土壤微生物數(shù)量測(cè)定
（一）培養(yǎng)基的制備：
Ⅰ測(cè)定微生物總量培養(yǎng)基：
1. 細(xì)菌培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基）
牛肉膏Beefextract 5.0g
蛋白胨Peptone 10.0g
NaCI 5.0g
蒸餾水H20 1000m1
PH 7.2~7.4
2. 放線(xiàn)菌培養(yǎng)基 （高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基）
可溶性淀粉 20g
KNO3 1g
K2HPO4 0.5g
MgSO4? 7H2O 0.5g
NaCl 0.05g
FeSO4? 7H2O 0.01g
pH 7.2-7.4
注：配制時(shí)，先用少量冷水，將淀粉調(diào)成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補(bǔ)足水分到1000ml，調(diào)pH。
另：倒平板之前，在溶化的培養(yǎng)基中加重鉻酸鉀溶液，每300mL培養(yǎng)基加3%重鉻酸鉀1mL(l00ppm)。
3. 真菌培養(yǎng)基（馬丁（Martin）-孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基）
葡萄糖 10.0g
MgSO4.7H2O O.5g
蛋白胨 5.0g
孟加拉紅 33.4mg （或者每升加1%溶液3.3mL）
K2HPO4 1g
蒸餾水H20 1000m1
PH 自然(4~5)
注：⑴滅菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加鏈霉素。
⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培養(yǎng)基加0.lmL。
以上培養(yǎng)基皆加瓊脂15g/L。
Ⅱ測(cè)定功能菌所用培養(yǎng)基：
1.亞硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基（改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培養(yǎng)基A）
(NH4)2SO4 2.0g
NaH2PO4 0.25g
MnSO4·4H2O 0.01g
MgSO4·7H2O 0.03g
K2HPO4 0.75g
CaCO3 5.0g
蒸餾水 1000ml
PH 7.2
注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接調(diào)PH，培養(yǎng)基中有這個(gè)成分是為了緩沖pH。因?yàn)橄趸?xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生酸化效應(yīng)，使得氫離子過(guò)剩，到了一定程度硝化作用將無(wú)法繼續(xù)，
所以要堿性物質(zhì)平衡酸堿。下同。
2.硝酸細(xì)菌培養(yǎng)基（改良的斯蒂芬遜（Stephenson）培養(yǎng)基B）
NaH2PO4 0.25g
K2HPO4 0.75g
MgSO4·7H2O 0.03g
MnSO4·4H2O 0.01g
CaCO3 1.0g
Na2CO3 1.0g
NaNO2 1.0g
蒸餾水 1000ml
PH 7.2
3. 反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基
檸檬酸鈉 5.0 g
KNO3 2.0 g
KH2PO4 1.0 g,
K2HPO4 1.0 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
蒸餾水 1000 ml
pH值 7.2~7.5
4.好氣性自生固氮菌培養(yǎng)基（改良阿須貝(Ashby)無(wú)氮培養(yǎng)基）
苯甲酸鈉 1.5 g
K2HPO4 0.2 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
NaCl 0.2 g
CaSO4·2H2O 0.1 g
PH 7.4—7.6
注：在培養(yǎng)基分裝入試管時(shí)，每管加入一1cm濾紙長(zhǎng)條，要露出液面。
5.氨氧化細(xì)菌培養(yǎng)基（蛋白胨氨化培養(yǎng)基）
K2HPO4 0.5 g
KH2PO4 0.5 g,
MgSO4·7H2O 0.5 g
蛋白胨 5.0 g
蒸餾水 1000ml
PH 7.0~7.2
6. 好氣性纖維素分解菌培養(yǎng)基（依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養(yǎng)基）
KH2PO4 1.0 g
FeCl3·6 H2O 0.1 g
MgSO4·7H2O 0.3 g
CaCl2·6H2O 0.1 g
NaCl 0. 1 g
NaNO3 2.5 g
pH 7.2～7．4
注：在培養(yǎng)基分裝入試管時(shí)，每管加入一1cm濾紙長(zhǎng)條，需露出液面。
(二)試劑的配制
1.格里斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液：
第一液：將0.5g的對(duì)氨基苯磺酸（Sulfanilic Acid）溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
第二液：將0.5gα-萘胺（α-naphthylamine）加入50ml蒸餾水中，煮沸后，緩緩加入150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。
2. 納氏試劑
甲液：將20.0g碘化汞和10.0g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。
乙液：將20.0g氫氧化鉀溶于100ml水中。
分別配制甲、乙二液，待冷卻后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，隨著沉淀增加會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。
3.二苯胺試劑：
溶1.0g無(wú)色的二苯胺（Diphenylamine）于20ml蒸餾水中，然后徐徐加入100ml濃硫酸（相對(duì)密度1.84）中，保存于棕色瓶中。
（三）實(shí)驗(yàn)器材：
1.儀器設(shè)備
4℃冰箱、立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、微量移液器、全溫空氣搖床、旋渦混合器、磁力攪拌器、微波爐等。
2.器材準(zhǔn)備
⑴將90ml水裝入250ml三角瓶中，并裝有15-20個(gè)玻璃珠，滅菌。
⑵將9ml水裝入試管，滅菌。
⑶試管架，1ml無(wú)菌吸管，記號(hào)筆，白瓷比色板，接種環(huán)，酒精燈等。
（四）實(shí)驗(yàn)方法：
1.樣品采集
在靠近植株根系部, 去除表層0-5cm的表土，采集5~20 cm土壤剖面,多點(diǎn)采集, 混勻后四分法取1 kg, 裝無(wú)菌塑料袋帶回，4℃冰箱保存。
2.懸液制備
稱(chēng)取10g土壤樣品，放入盛有90ml無(wú)菌水的三角瓶中，置于搖床上室溫振蕩20min，
使土樣與水充分混合，將土壤中的微生物細(xì)胞充分分散，從土壤中分離出來(lái)。此為10-1土壤懸液，吸取lml此土壤懸液于9ml無(wú)菌水中，另用無(wú)菌吸管吹吸3次混勻，制成10-2土壤懸液。以此類(lèi)推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀釋度的土壤懸液。
3.土壤懸液稀釋度選擇
⑴細(xì)菌:10-4~10-6
⑵放線(xiàn)菌：10-3~10-5
⑶真菌：10-2~10-4
以上采用稀釋平板法，分別設(shè)置三個(gè)濃度梯度，二次重復(fù)。
⑷亞硝酸細(xì)菌：10-3~10-6
⑸硝酸細(xì)菌：10-3~10-6
⑹反硝化細(xì)菌：10-4~10-7
⑺好氣性自生固氮菌：10-3~10-6
⑻氨氧化細(xì)菌：10-5~10-8
⑼好氣性纖維素分解菌：10-2~10-5
以上采用最大或然法（MPN），分別設(shè)置四個(gè)濃度梯度，三次重復(fù)。
4.接種
⑴液體培養(yǎng)基
將六種功能菌培養(yǎng)基分裝于試管中，每管5ml，每個(gè)菌需培養(yǎng)基12支試管。按照縱3橫4的方陣排列于試管架上，標(biāo)簽示之。
用1ml無(wú)菌吸管依次從低濃度到高濃度吸取土壤稀釋液，放入各自對(duì)應(yīng)編號(hào)的管中。
另取一管培養(yǎng)基接種1ml無(wú)菌水作為對(duì)照。
⑵瓊脂培養(yǎng)基
將細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌瓊脂培養(yǎng)基采用混菌法進(jìn)行接種，每個(gè)培養(yǎng)皿接種lml土壤稀釋液，二次重復(fù)。接種后，倒入15-20ml培養(yǎng)基迅速混勻。
5.培養(yǎng)
將所有試管和平板置于25-28℃黑暗條件下避光培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間由短到長(zhǎng)分別為：
⑴真菌：2～3d；
⑵細(xì)菌：3～4d；
⑶放線(xiàn)菌：5～7d。
⑷氨氧化細(xì)菌：7～8d；
⑸好氣性自生固氮菌：7～8d；
⑹亞硝酸細(xì)菌：10～14d；
⑺硝酸細(xì)菌：10～14d；
⑻反硝化細(xì)菌：10～14d；
⑼好氣性纖維素分解菌：10～14d；
6.結(jié)果觀察
⑴亞硝酸細(xì)菌：取出培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液各兩滴，如有亞硝酸鹽存在，則呈紅色。
⑵硝酸細(xì)菌：取出培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，加入格里斯試劑（Griess Reagent）第一、第二液各兩滴，如不呈紅色，表示亞硝酸均已經(jīng)完全消失。此時(shí)，另取培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺試劑2滴，如呈藍(lán)色，則表示亞硝酸已經(jīng)被氧化成硝酸，說(shuō)明有硝酸細(xì)菌的存在。
⑶反硝化細(xì)菌：加入格利斯亞硝酸試劑，觀察顏色變化，確定正負(fù)反應(yīng)。
⑷好氣性自生固氮菌：觀察試管培養(yǎng)液表面與濾紙接觸處有無(wú)褐色或黏液狀菌膜生成，或有無(wú)圓暈混濁出現(xiàn)。
⑸氨氧化細(xì)菌：取出培養(yǎng)液5滴于白瓷比色板上，加入納氏試劑兩滴，如有氨氧化細(xì)菌存在，則呈棕色或褐色。
⑹好氣性纖維素分解菌：觀察濾紙條是否成團(tuán)，有無(wú)黃色或橘黃色菌斑出現(xiàn)及濾紙斷裂情況。
