全血膽堿酯酶活性的分光光度測定方法羥胺三氯化鐵法
Blood—Determinatoin of cholinestera activity—Spectrophotometric
method—Hydroxylamine-ferric chloride method
1 主題內容與適用范圍
本標準規定了血中膽堿酯酶活性的分光光度測定方法——羥胺三氯化鐵法。
本法最低檢測濃度為2.4μmol/L。
本標準適用于正常人和接觸有機磷農藥人員血中膽堿酯酶活性的測定。
2 原理
血液膽堿酯酶使乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸。未被膽堿酯酶水解而剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺反應，生成乙酰羥胺，然后，與三氯化鐵在酸性溶液中反應，形成紅色羥肟酸鐵絡合物。顏色深度與剩余乙酰膽堿的量成正比。在波長520 nm比色定量，由水解的乙酰膽堿的量計算膽堿酯酶活性。
3 儀器
3.1分光光度計，10mm比色杯。
3.2比色管，10 mL。
3.3普通漏斗，40mm。
3.4恒溫水浴箱，控溫士0.5℃。
3.5采血針頭。
3.6血色素吸管，有20μL刻度。
4試劑
本標準所用試劑均為分析純試劑。
4.1 實驗用水，蒸餾水或具同等純度的去離子水。
4.2 鹽酸， =1.19 g/mL。
4.3 鹽酸溶液(1+2)。
4.4 堿性羥胺溶液，臨用前將139 g/L鹽酸羥胺溶液和140 g/L氫氧化鈉溶液等體積混合。
4.5 磷酸鹽緩沖液(pH=7.20)，準確稱取磷酸氫二鈉()8.36g和磷酸二氫鉀()1.36g，用水溶解并稀釋到500mL，保存在冰箱內。
4.6 三氯化鐵溶液，稱取10 g三氯化鐵()，加0.84 mL鹽酸(4.2)，然后加水100mL。貯存于棕色瓶中。
4.7 氯化乙酰膽堿標準液，精確稱取乙酰膽堿1.2716g，用磷酸鹽緩沖液(4.5)溶解，并稀釋到100 mL，此溶液1mL相當于70μmol乙酰膽堿，為貯備液。臨用前，取此溶液用磷酸鹽緩沖液(4.5)稀釋10倍，此溶液1 mL相當于7μmol乙酰膽堿，為應用液。
5采樣、運輸和保存
5.1用血色素吸管，取耳垂血20μL，注入比色管中（事先加入0.98 mL磷酸鹽緩沖液），立即進行測定。
5.2如不能立即測定，可靜脈取血0.5 mL，注入玻璃管中（含肝素或草酸鉀抗凝劑），混勻。于保溫瓶中加冰運送，置于4℃冰箱中可保存一周。
6分析步驟
樣品測定按下表進行。
全血膽堿酯酶測定操作步驟
| 樣品管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
磷酸鹽緩沖液，mL | O．98 | 0. 98 | 1.0 | 1.0 |
混勻全血（草酸鉀抗凝），ml | 0. 02 | 0. 02 |
| | | | |
置37 C水浴中預熱5 min
乙酰膽堿應用液（4.7），mL 水，mL | 1.0 — 1.0 — — 1.0 — 1.0 |
| |
置37℃水浴中反應30min，準時取出,各管加入4.OmL堿性羥胺溶液(4.4),充分振搖2 min,繼續加入2.0 mL鹽酸溶液(4.3)，充分振搖2min，再加入2.0mL三氯化鐵溶液(4.4)，充分振搖，用濾紙過濾后，以試劑空白為參比在波長520nm處測吸光度。然后按7.1計算膽堿酯酶活性。如同時分析大批樣品，可采用標準曲線法按7.2求出膽堿酯酶活
性絕對值。
7計算
7.1公式計算法
7.1.1按式(1)計算酶活性的絕對值。
………………(1)
式中：——水解乙酰膽堿的濃度，μmol(0.02 mL37℃30min)；
A——以試劑空白為參比的在波長520 nm處樣品管的吸光度值；
B——以試劑空白為參比的在波長520 nm處對照管的吸光度值；
C——以試劑空白為參比的在波長520 nm處標準管的吸光度值。
7.1.2按式(2)計算酶活性的相對值。
…………………(2)
式中：——酶活性的相對值，%；
——被測血樣中酶活性的絕對值，μmol(O.02 mL37℃30min)；
——正常人血中酶活性絕對值，μmol(O. 02 mL37℃30min)。
7.2標準曲線法
7.2.1 被水解乙酰膽堿的吸光度=C一(A—B)。
7.2.2 被水解乙酰膽堿的吸光度查乙酰膽堿標準曲線，得相應的被水解乙酰膽堿(μmol此值是0.02 mL血液在37℃30min反應條件下，膽堿酯酶的活性絕對值。
8說明
8.1本法檢測限為2.4μmol/L，線性范圍為2.4～1000.0μmol/L。當乙酰膽堿的含量為1.4.4.2，7.0μmol時，其變異系數分別為：12.8%，9.O%，6.4%。
8.2使用的玻璃器皿洗凈后，在1+3硝酸中浸泡24 h，用水沖洗干凈后，再用蒸餾水洗三次，干燥后備用。
8.3取血時不應過度擠壓耳垂，因為本法是同時測定血清假性膽堿酯酶和血球真性膽堿酯酶。選用的乙酰膽堿基質濃度對血球真性膽堿最適宜，此時測得的血液膽堿酯酶活性值，真性膽堿酯酶占85%。測定結果基本上只代表血球真性膽堿酯酶活性值。如果采血時過度擠壓耳垂，采得的血液中血清和組織液所占比例過多，會使結果偏低。
8.4加堿性羥胺和鹽酸(1+2)時，必須嚴格掌握振搖時間，使其充分反應，否則會影響結果。
8.5加三氯化鐵顯色后，棕紅色鐵絡合物易褪色，必須控制在20 min內比色完畢。若大批樣品分析時，可分批加入三氯化鐵溶液，否則會有較大誤差。
8.6濾液一定要澄清，如果出現混濁，會使吸光度升高，而膽堿酯酶活性偏低。
8.7氯化乙酰膽堿基質不太穩定，每次測定需做標準管。標準管讀數在同一比色計上應保持恒定或僅有較小的變動。
8.8計算膽堿酯酶活性百分數時，應以本地區正常人全血膽堿酯酶活性為基準。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由遼寧省勞動衛生研究所負責起草。
本標準主要起草人周健英、胡索清。
本標準由衛生部委托技術歸口單位中國預防醫學科學院勞動衛生與職業病研究所負責解釋。
