信號肽酶切割

2023年12月4日發(作者：安全學習)

-

要求目的蛋白中不能含有信號肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。信號肽的切除分為兩步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之間初步切除，STE123在兩個glu-ala之間切割。

以pPIC9K為例，pPIC9K是用于在畢赤酵母中的多拷貝整合分泌表達蛋白的穿梭載體，利用組氨酸缺陷型標記進行互補篩選。

一、信號肽的2步切割

pPIC9K載體帶有自身信號肽，在分泌過程中被切除，但是由于切割效率，在目的產物N端帶有3－5個左右的信號肽的氨基酸。

設計引物時，為了防止切割不完全，能去掉GluAla兩個重復單位，不過文獻報道多個Glu會提高kex2的切割效率。

要求目的蛋白中不能含有信號肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。

信號肽的切除分為兩步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之間初步切除，STE123在兩個glu-ala之間 切割。

二、是否在3' 端是帶上一些其本來的序列？

1,首先，你要保證表達后細胞內信號肽酶能正確識別原來的位點，即此位點是不能隨便增減的，否則信號肽不能正常切割，在這個基礎上你再決定3' 端其本來序列的去留。

2，一般5'端多出一些氨基酸不會明顯影響到你的目的蛋白的活性，我們平時在做酵母表達時，信號肽切割后，目的蛋白往往有幾個多余的AA，這對活性好象沒什么影響，雖然如此，但你還得注意多余AA的性質，不能過酸或過堿。

三、重組pPIC9K/GS115表達出目的條帶后，

確定信號肽是否切除完全的方法：

1、N端測序

2、先查查你的氨基酸序列里有沒有糖基化位點，如果有就只能N端測序了。如果沒有，看分子量大小。

信號肽中有kex2和ste13兩個酶切位點，現在擔心的是kex2的位點酶切完全了，但ste13的兩個酶切位點glu， ala重復序列沒有切干凈，如果這兩個氨基酸沒有切除完全的話，分子量差異不大，兩個氨基酸的差異應該看不出來，一般來說，N端多一兩個AA應該對蛋白的活性沒有太大影響。western檢測有兩個條帶的問題，可能是目的蛋白有一部分被降解了。

四、附：信號肽切割原理和優化切割

《Expression of Your Recombinant Protein with a Native N-terminus》

If you wish to have your protein expresd with a native N-terminus, you should clone

your gene flush(直接地) with the Kex2 cleavage site. U PCR to rebuild the quence from the Xho I site

at bp 1184-1189 to the arginine codon at nucleotides 1193-1195. Remember to include the first amino

acid of your protein, if necessary, for correct fusion to the Kex2 cleavage site.

Signal Sequence Processing

The processing of the α-factor signal quence in pPICZα occurs in two steps:

1. The preliminary cleavage of the signal quence by the KEX2 gene product,

final Kex2 cleavage occurring between arginine and glutamine in the quence

Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, where * is the site of cleavage.

2. The Glu-Ala repeats are further cleaved by the STE13 gene product.

Optimization of Signal Cleavage

In Saccharomyces cerevisiae, it has been noted that the Glu-Ala repeats are not necessary

for cleavage by Kex2, but cleavage after Glu-Lys-Arg may be more efficient when

followed by Glu-Ala repeats. A number of amino acids are tolerated at site X instead of

Glu in the quence Glu-Lys-Arg-X. The amino acids include the aromatic amino acids,

small amino acids, and histidine. Proline, however, will inhibit Kex2 cleavage. For more

information on Kex2 cleavage, plea e (Brake et al., 1984).

There are some cas where Ste13 cleavage of Glu-Ala repeats is not efficient, and Glu-

Ala repeats are left on the N-terminus of the expresd protein of interest. This is

generally dependent on the protein of interest.

continued on next page

-