儀器分析作業:熒光、紫外、紅外

2023年12月10日發(作者：教師節文案)

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傅立葉變換紅外光譜儀

曹文芳 1014061420

一、儀器結構

傅立葉變換紅外光譜儀的工作原理圖

固定平面鏡、分光器和可調凹面鏡組成傅立葉變換紅外光譜儀的核心部件－邁克爾干涉儀。由光源發出的紅外光經過固定平面鏡反射鏡后，由分光器分為兩束：50％的光透射到可調凹面鏡，另外50％的光反射到固定平面鏡。

可調凹面鏡移動至兩束光光程差為半波長的偶數倍時，這兩束光發生相長干涉，干涉圖由紅外檢測器獲得，經過計算機傅立葉變換處理后得到紅外光譜圖。

IRPresting-21型傅立葉變換紅外光譜儀具300入射邁克爾遜密閉型干涉儀，單光束光學系統，空冷陶瓷光源，鍍鍺KBr基片分束器，溫度可調的DLATGS檢測器，波數范圍7,800～350cm-1，S/N大于40,000∶1（4 cm-1，1分鐘，2,100 cm-1附近，P—P），具有自診斷功能和狀態監控器。可收集中紅外、近紅外、遠紅外范圍光譜。

二、實驗原理

原理概述：紅外吸收光譜分析方法主要是依據分子內部原子間的相對振動和分子轉動等信息進行測定。

一束具有連續波長的紅外光通過物質，物質分子中某個基團的振動頻率或轉動頻率和紅外光的頻率一樣時，分子就吸收能量由原來的基態振(轉)動能級躍遷到能量較高的振(轉)動能級，分子吸收紅外輻射后發生振動和轉動能級的躍遷，該處波長的光就被物質吸收。所以，紅外光譜法實質上是一種根據分子內部原子間的相對振動和分子轉動等信息來確定物質分子結構和鑒別化合物的分析方法。將分子吸收紅外光的情況用儀器記錄下來，就得到紅外光譜圖。紅外光譜圖通常用波長(λ)或波數(σ)為橫坐標，表示吸收峰的位置，用透光率(T%)或者吸光度(A)為縱坐標，表示吸收強度。

三、操作步驟

1 、開機前準備

開機前檢查實驗室電源、溫度和濕度等環境條件，當電壓穩定，室溫為21±5℃左右，濕度≤65%時才能開機。

2、開機

始終保持紅外光譜儀右下側黃色燈亮（除濕器指示燈）；開機時，首先打開右下側儀器電源開關，此時綠燈亮，穩定半小時，使得儀器能量達到最佳狀態。開啟電腦，點擊用戶名Administrator，輸入密碼，并運行儀器操作平臺IRsolution軟件，status欄顯示儀器自檢，約十幾秒后窗口右方出現4個綠色方塊，自檢完成，表示儀器正常，可以開始使用。

3 、制樣

固體樣品（溴化鉀壓片法）：取預先烘干的固體樣品1~1.5 mg與KBr 200~300 mg（樣品與KBr的比約為1:200）于瑪瑙研缽中，研磨成混合均勻的粉末（粒度小于2微米）。如果KBr和固體樣品不夠干燥，研磨時要用紅外燈烘干。用小藥匙轉入制片模具中，于油壓機6~8噸壓力下保持約5分鐘，撤去壓力后取出制成的半透明薄片，裝入樣品架。

液體樣品（液膜法）：取兩片氯化鈉鹽片，用潔凈的棉球沾少許溶劑將表面擦干凈，待溶劑揮發后，滴一小滴試樣在鹽片上，將另一鹽片壓在上面，使試樣均勻鋪散在鹽片中間形成液膜，中間不能有氣泡。然后將其裝入可拆式夜池架中，輕輕用螺絲固定好，插入儀器試樣池中測繪譜圖。 4．掃描和輸出紅外光譜圖

測試紅外光譜圖時，先在measure模式下按BKG鍵掃描背景（用KBr片做背景），一般背景信號強度在80%以上，否則能量太低，樣品信號噪音大；在Comment欄中輸入備注，在Data file中選擇樣品譜圖存儲路徑（E盤個人文件夾），按sample鍵掃描樣品信號，得到樣品紅外光譜圖;根據需要保存紅外光譜圖，或者導出ASC碼文本文檔，或打印。

5．關機

（1）關機時，先關閉IRsolution軟件，關閉電腦主機，再關閉光譜儀電源，蓋上儀器防塵罩。

（2）在記錄本記錄使用情況。

6.注意事項

（1）保持實驗室整潔和干燥，不得在實驗室內進行樣品化學處理，實驗完畢即取出樣品。

（2）樣品室窗門應輕開輕關，避免儀器振動受損。

（3）眼睛不要注視激光光源，以免受傷害。

（4）實驗操作中，避免用手直接接觸錠劑成型器表面，以防樣品受潮，無法制樣；要用鑷子從錠劑成型器中取出壓好的薄片，而不能用手拿，以免玷污薄片。

（5）固體樣品壓片法時，試樣量必須合適。試樣量過多，試樣晶片太“厚”，透光率差，導致收集到的譜圖中強峰超出檢測范圍；試樣量太少，晶片太“薄”，收集到的譜圖信號信噪比差。

（6）液體樣品測定時，可拆式液體池的鹽片應保持透明干燥，切不可用手接觸鹽片表面；鹽片不能用水沖洗。以試樣溶于有機溶劑，制成1~10%濃度的溶液，注入適宜厚度的液體池中測定；常用溶劑有二氯甲烷、四氯化碳、三氯甲烷、二硫化碳、己烷及環己烷等，不可用水做試樣溶劑；使用完后，用相應溶劑立即將液體池清洗干凈。

（7）壓片機下未放壓片模具時，不能進行壓桿操作，避免超出可操作范圍。

（8）壓片完成后將試樣配件，特別是壓片模具擦拭干凈，必要時用乙醇或水清洗干凈并擦干，置干燥器中保存，以免銹蝕。 （9）不得隨意改變軟件參數。

（10）本儀器由專人保管，使用人員在上機前必須經過培訓，待考核通過后，方可上機使用。

四、發展與應用

傅立葉變換紅外光譜儀是20世紀70年代發展起來的新一代紅外光譜儀，紅外光譜儀的發展經歷了3個階段：第一階段是棱鏡式紅外分光光度計，它是基于棱鏡對紅外輻射的色散而實現分光的，其缺點是光學材料制造麻煩 ，分辨本領較低 ，而且儀器要求嚴格的恒溫降濕；第二階段是光柵式紅外分光光度計，它是基于光柵的衍射而實現分光的，與第一代相比．分辨能力大大提高，且能量較高，價格便宜，對恒溫、恒濕要求不高，是紅外分光光度計發展的方向；第三階段是基于干涉調頻分光的傅立葉變換紅外光譜儀，它的出現為紅外光譜的應用開辟了新的領域。

紅外光譜儀具有以下特點：一是掃描速度快，可以在1s內測得多張紅外譜圖；二是光通量大，可以檢測透射較低的樣品，可以檢測氣體、固體、液體、薄膜和金屬鍍層等不同樣品；三是分辨率高，便于觀察氣態分子的精細結構；四是測定光譜范圍寬，只要改變光源、分束器和檢測器的配置，就可以得到整個紅外區的光譜。

紅外及拉曼光譜都是分子振動光譜。通過譜圖解析可以獲取分子結構的信息。任何氣態、液態、固態樣品均可進行紅外光譜測定，這是其它儀器分析方法難以做到的。由于每種化合物均有紅外吸收，尤其是有機化合物的紅外光譜能提供豐富的結構信息，因此紅外光譜法是有機化合物結構解析的重要手段之一。因此紅外光譜儀廣泛應用于有機化學、高分子化學、無機化學、化工、催化、石油、材料、生物、醫藥、環境等領域。

紫外-可見分光光度計

一、儀器的類型和基本組成部分

1．儀器的分類

紫外-可見分光光度計按使用波長范圍可分為：可見分光光度計和紫外-可見分光光 度計兩類（統稱為分光光度計）。前者的使用波長范圍是 400～780 nm；后者的使用波長范圍為200～1000 nm?？梢姺止夤舛扔嬛荒苡糜跍y量有色溶液的吸光度，而紫外-可見分光光度計可測量在紫外、可見及近紅外光區有吸收的物質的吸光度。紫外-可見分光度計按光路可分為單光束式及雙光束式兩類；按測量時提供的波長數又可分為單波長分光光度計和雙波長分光光度計兩類。

2．儀器的基本組成部分

目前，紫外-可見分光光度計的型號較多，但它們的基本構造都相似，都由光源、單色器、樣品吸收池、檢測器和信號顯示系統等五大部件組成，其組成框圖見圖 2-1 。

由光源發出的光，經單色器獲得一定波長單色光照射到樣品溶液，被吸收后，經檢測器將光強度變化轉變為電信號變化，并經信號指示系統調制放大后，顯示或打印出吸光度 A（或透射比 τ），完成測定。

（1）光源 光源是提供入射光的裝置。可見光區常用的光源為鎢燈，可用的波長范圍為 350~1000 nm；紫外光區常用的光源為氫燈或氘燈（其中氘燈的輻射強度大，穩定性好，壽命長，因此近年生產的儀器多使用氘燈） ，它們發射的連續波長范圍為180~360 nm。

（2）單色器 單色器是將光源輻射的復合光分成單色光的光學裝置。單色器一般由狹縫、色散元件及透鏡系統組成，其中色散元件是單色器的關鍵部件。最常用的色散元件是棱鏡和光柵（現在的商品儀器幾乎都使用光柵） 。

（3）吸收池 吸收池是用于盛裝被測量溶液的裝置。一般可見光區使用玻璃吸收池，紫外光區使用石英吸收池。紫外-可見分光光度計常用的吸收池規格有：0.5 cm、1.0 cm、2.0 cm、3.0 cm、5.0 cm等，使用時，根據實際需要選擇。

（4）檢測器 檢測器是將光信號轉變為電信號的裝置。常用的檢測器有硒光電池、光電管、光電倍增管和光電二極管陣列檢測器。硒光電池結構簡單，價格便宜，但長時間曝光易“疲勞”，靈敏度也不高。光電管的靈敏度比硒光電池高。光電倍增管不僅靈敏度比普通光電管靈敏，而且響應速度快，是目前高、中檔分光光度計中最常用的一種檢測器。光電二極管陣列檢測器是紫外-可見光度檢測器的一個重要進展，它具有極快的掃描速度，可得到三維光譜圖。

（5）信號顯示器 信號顯示器是將檢測器輸出的信號放大并顯示出來的裝置。常用的裝置有電表指示、圖表指示及數字顯示等。現在很多紫外-可見分光光度計都裝有微處理機，一方面將信號記錄和處理，另一方面可對分光光度計進行操作控制。

二、儀器工作原理

物質的紫外-可見光譜直接地反映了物質分子的電子躍遷，與物質的結構直接相關，不同的物質其紫外-可見吸收光譜不同。而吸收強弱又與吸光物質的量有關。因此可以由物質光譜的特異性對物質進行定性分析，并根據吸收強度對物質作定量測試。在一定的條件下，吸光物質對單色光的吸收符合朗伯-比爾定律，即

A=εbc

上式中 A 為吸光度；b 為光程長度（即吸收池厚度），單位為 cm；c 為吸光物質的物質的量濃度，單位為 mol/L；ε為摩爾吸光系數，單位為 L/(mol?cm)；由上式可知，當 b、ε 一定時，吸光物質的吸光度為其濃度 c 的單值（線性）函數。因此對吸光物質的濃度的測試可直接歸結為對吸光度 A的測試。

三、UV-3600紫外分光光度計基本操作步驟

1．

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3．

4．

5．

首先打開紫外分光光度計的電源，然后再打開計算機的電源。

雙擊桌面上的“UVProbe”快捷鍵，進入主菜單。

單擊菜單中下部“Connect”圖標，紫外分光光度計開始自檢。

待所有自檢項目結束（各項自檢條目均亮綠燈）后，單擊“OK”圖標。

于儀器檢測室內放入盛有相同檢測媒介（不含樣品）的對比池（靠內）和樣品池（靠外）， 單擊“Baline”圖標進行背景掃描。

6． 待背景掃描結束后，取出樣品池，加入待檢測樣品，然后放回檢測室，單擊“Auto Zero”圖標進行調零。

7．

8．

待調零結束后，單擊“Start”圖標開始掃描。

掃描結束后，屏幕會跳出“New Data Set”對話框，請在“File”欄自己建立路徑和文檔名，然后單擊“OK”圖標。接著單擊菜單左上角的“Save”圖標，最終完成文件的存儲。如要轉換成ASCII碼文件，請單擊菜單左上角的“File”圖標，然后在其下拉菜單中單擊“”圖標，跳出“Save

Spectrum File”對話框，單擊“保存類型(T)”欄，并在其下拉菜單中選擇“Data

Print Table(*.txt)”這一欄，自己給此文件建立路徑和名字后，單擊“保存(s)”鍵即完成ASCII碼文件的轉換工作。

9． 取出樣品池，經處理后進行下一次實驗。

10． 多次測樣時，若檢測媒介未變，請重復6-9操作步驟；若檢測媒介已變，請重復5-9操作步驟。

11． 測樣結束后，先關掉此軟件，然后關掉計算機電源，最后關掉紫外分光光度計電源。若該計算機另有它用，可同時按住[Alt]+[F4]鍵，然后按[Enter]鍵結束程序后再關掉紫外分光光度計電源。

12． 實驗結束后，用重鉻酸鉀洗液浸泡樣品池兩分鐘，接著用去離子水洗滌干凈，然后用分析純丙酮洗滌，在室溫下吹干后放入池盒中，以方便下一次實驗的進行。

PL熒光分光光度計

一、儀器結構

由高壓汞燈或氙燈發出的紫外光和藍紫光經濾光片照射到樣品池中，激發樣品中的熒光物質發出熒光，熒光經過濾過和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數字的形式顯示出來?；窘Y構和原理如圖所示。

①光源

光源應具有強度大、適用波長范圍寬兩大特點，常用光源有高壓汞燈、氙燈、氙一汞弧燈等。此外，紫外激光器、固體激光器、高功率連續可調染料激光器和二極管激光器等熒光光源把熒光法的應用范圍拓寬。

②濾光片和單色器

在熒光光度計中，通常采用干涉濾光片和吸收濾光片作為激發光束和熒光輻射的波長選擇器。在熒光分光光度計中至少選用一個，而常常是用兩個光柵單色器，且均帶有可調狹縫，以供選擇合適的通帶。理想的單色器應在整個波長區內有相同的光子通過效率，不幸的是這種理想的單色器不存在。

③ 檢測器

一般普通的熒光分光光度計均采用光電倍增管作為檢測器。它是很好的電流源，在一定條件下其電流量與人射光強度成正比。此外，還有光導攝像管、電子微分器、電荷耦合器陣列檢測器。

④ 顯示裝置

以前，顯示裝置有數字電壓表，記錄儀和陰極示波器等，現在，人們可以通過計算機軟硬件技術根據不同要求，來選擇不同的直觀的視頻讀出方式。

二、熒光分光光度計的工作原理

物質熒光的產生是由在通常狀況下處于基態的物質分子吸收激發光后變為激發態, 這些處于激發態的分子是不穩定的,在返回基態的過程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產生熒光。不同物質由于分子結構的不同,其激發態能級的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現為各種物質都有其特征熒光激發和發射光譜；，因此可以用熒光激發和發射光譜的不同來定性地進行物質的鑒定。在溶液中，當熒光物質的濃度較低時,其熒光強度與該物質的濃度通常有良好的正比關系,即IF=KC,利用這種關系可以進行熒光物質的定量分析,與紫外-可見分光光度法類似，熒光分析通常也采用標準曲線法進行。

三、 熒光分光光度計簡介

熒光分光光度計是用于掃描液相熒光標記物所發出的熒光光譜的一種儀器。其能提供包括激發光譜、發射光譜以及熒光強度、量子產率、熒光壽命、熒光偏振等許多物理參數，從各個角度反映了分子的成鍵和結構情況。通過對這些參數的測定, 不但可以做一般的定量分析，而且還可以推斷分子在各種環境下的構象變化，從而闡明分子結構與功能之間的關系。熒光分光光度計的激發波長掃描范圍一般是190~650nm，發射波長掃描范圍是200~800nm?？捎糜谝后w、固體樣品（如凝膠條）的光譜掃描。目前熒光分析法廣泛應用于生化、化學、藥物分析、食品檢驗、地理、冶金、醫學、環境科學和生命科學研究等各個領域。熒光儀器是用來測定熒光物質的性質和含量的分析儀器，通常分兩大類：熒光光度計和熒光分光光度計。熒光分光光度計技術在現代科學的發展中正顯示出獨特的作用，越來越得到人們的重視。

四、操作步驟

儀器設備名稱：熒光分光光度計

型 號：RF-5301PC型

國 別 廠 家：日本島津公司

技術指標：

波長掃描范圍：220-900nm

波長精度：±1.5nm；

狹縫范圍：0.15-20nm

信噪比：S/N比150以上（水拉曼峰測定，狹縫5nm）

最高掃描速度：5，500nm/min

1開機

a. 確認所測試樣液體或固體，選擇相應的附件。

b. 先開啟儀器主機電源，預熱半小時后啟動電腦程序RF-530XPC，儀器自檢通過后，即可正常使用。

2測樣

(1) spectrum模式

a. 在“Acquire Mode”中選擇“Spectrum”模式。

? 對于做熒光光譜的樣品，“Configure”中“Parameters”的參數設置如下：

“Spectrum Type”中選擇Emission；給定EX波長；給定EM的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm)；設定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點擊“OK”完成參數的設定。 ? 對于做激發光譜的樣品，“Configure”中“Parameters”的參數設置如下：

“Spectrum Type”中選擇Excitation；給定EM波長；給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm—900nm)；設定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點擊“OK”，完成參數的設定。

b. 在樣品池中放入待測的溶液，點擊“Start”，即可開始掃描。

c. 掃描結束后，系統提示保存文件?？稍凇癙rentation”中選擇“Graf” “Radar”

“Both Axes Ctrl+R”來調整顯示結果范圍；在“Manipulate” 中選擇“Peak

Pick”來標出峰位，最后在“Channel”中進行通道設定。

d. 述操作步驟對固體樣品同樣適用。

(2) Quantitative模式

a. 在“Acquire Mode”中選擇“Quantitative”模式。

b. “Configure”中“Parameters”的參數設置如下：

Method 選擇“Multi Point Working Curve” ；“Order of Curve” 中選擇 “1st和“No” ；給定EX、EM波長；設定狹縫寬度，點擊“OK”，完成參數的設定。

c. 在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執行“Auto Zero” 命令校零點。

d. 點擊“Standard”模式，制作工作曲線。

e. 將樣品池中的空白溶液換成一系列的已知濃度的樣品標準溶液進行測量，執行“Read”命令，得到相應的熒光強度，系統根據測量值自動生成一條“熒光強度-濃度”曲線。

f. 在“Prentation” 中選擇“Display Equation”，得到標準方程。將此工作曲線 “Save”為擴展名為“.std”的文件。

g. 工作曲線制備完畢，即可進入未知樣的測量，選擇進入“Unknown”模式，將樣品池中的已知濃度標準溶液換成待測樣品溶液，執行“Read”命令，即可得到相應的熒光強度和相應的濃度。將此 “Save”為擴展名為“.qnt”的文件。

(3) Time Cour模式

a. 在“Acquire Mode”中選擇“Time Cour”模式。

b. “Configure”中“Parameters”的參數設置如下： 給定EX、EM波長；設定狹縫寬度；設定反應時間；讀取速度；讀取點數；

點擊“OK”，完成參數的設定。

c. 在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執行“Auto Zero” 命令校零點。

d. 將樣品池中的空白溶液換成待測溶液，點擊“Start”，即可開始掃描。掃描結束后，即可得到熒光強度對時間的工作曲線。

e. 將此工作曲線“Save”為擴展名為“.TMC”的文件。

3. 關機

退出軟件后關畢主機。

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