基因槍瞬時轉化洋蔥表皮

2023年12月14日發(作者：幫助的名言)

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基因槍瞬時轉化洋蔥表皮

1. 基因槍DNA微彈的制備

（1）稱取直徑為0.6 μm的鎢粉于干凈 1.5 mL的離心管中，用1

mL 70％乙醇振蕩5 min進行清洗，室溫靜置10 min，短暫離心后棄上清液；

（2）重復操作步驟（1）；

（3）向離心管中加入1 mL去離子水，充分振蕩，靜置2 min，短暫離心后棄上清液，重復沖洗2次；

（4）加入500 μL滅菌的50％的甘油，充分振蕩混勻，每管50 μL進行分裝制備成60 mg/mL的微載體；

（5）將5 μL（約1ug/μL）pUC18-35S-PtERFs-GFP質粒和對照pUC18-35S-GFP分別加入到微載體管中，然后加入50 μL CaCl（2.5 M）和20 μL亞精胺（0.1 M）；

（6）振蕩3 min，室溫靜置2 min，短暫離心后棄上清液；

（7）加入150 μL 70％乙醇，輕輕混勻，短暫離心后棄上清液，重復兩次；

（8）加入150 μL 70％乙醇，輕輕重懸，即為基因槍所需DNA微彈。

2. 洋蔥表皮受體的制備

將購買的洋蔥放在水中過夜復蘇培養，用鑷子小心取洋蔥的第4-7層鱗莖內表皮，并切割成2 cm × 3 cm的小塊平鋪于1/2 MS固體培養基平板中央，于室溫暗培養24 h備用。

3. 基因槍瞬時轉化洋蔥細胞

（1）將載體膜安裝在載體膜支架上，取5 μL DNA微彈均勻的涂抹在載體膜上，水平室溫放置2-3 min待乙醇完全揮發；

（2）將可裂膜于75%乙醇中沖洗后安裝在固定冒中，然后安裝到基因槍主體裝置上；

（3）在DNA微彈組件中安裝上終止屏，并將其固定在基因槍主體裝置上； （4）將含有洋蔥表皮的培養基平板置于合適的射擊距離處進行轟擊；

（5）將轟擊后的培養基平板密封，室溫暗培養36 h，于激光共聚焦顯微鏡下觀察分析。

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