超聲處理對脫脂牛乳蛋白質結構和界面性質的影響

2023年12月18日發(作者：書夾子)

超聲處理對脫脂牛乳蛋白質結構和界面性質的影響

馬蓉;楊富民;楊敏;楊繼濤;張光地;劉東;劉倩霞

【摘 要】[目的]分析不同時間20 kHz超聲處理對脫脂牛乳蛋白質結構和界面性質的影響.[方法]以脫脂牛乳為研究對象,分別討論了不同超聲時間對脫脂牛乳酪蛋白膠束平均粒徑、脫脂乳濁度和熒光光譜的影響,分析了脫脂乳乳化活性和乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性的變化規律.[結果]隨著超聲時間的延長,脫脂乳中酪蛋白膠束的平均粒徑減小,脫脂乳濁度顯著降低,但乳體系pH基本不變;超聲處理4 min時,脫脂牛乳內源熒光最大發射波長λmax達到最大值,最大熒光強度突然增大.ANS熒光λmax在超聲處理2 min時迅速增大,之后基本保持不變;最大熒光強度在2

min時降至最低,之后增大.[結論]就界面性質而言,4 min超聲處理的脫脂牛乳乳化活力指數和起泡性最大,分別比未處理的提高了35.14％和21.74％.試驗結果可為超聲技術在液態乳制品的生產加工過程中的應用提供理論基礎和參考依據.

【期刊名稱】《甘肅農業大學學報》

【年(卷),期】2018(053)005

【總頁數】8頁(P169-175,184)

【關鍵詞】超聲波處理;脫脂牛乳;粒徑;熒光特性;界面性質

【作 者】馬蓉;楊富民;楊敏;楊繼濤;張光地;劉東;劉倩霞

【作者單位】甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;甘肅農業大學理學院,甘肅 蘭州 730070;甘肅農業大學理學院,甘肅 蘭州 730070;甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅

蘭州 730070;甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070;甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅 蘭州 730070

【正文語種】中 文

【中圖分類】TS252.2

超聲波具有波動與能量的雙重屬性，頻率高于20 kHz，在液體介質中傳播時，引起一系列的物理化學作用，形成最主要的三大效應—熱效應、機械效應、空化效應[1].因此，超聲波可以通過聲空化等物理化學作用改變溶液性質.超聲波作為一種新興的技術，已應用于食品無損檢測、乳液乳化、均質、超聲輔助提取、酶的鈍化、肉的嫩化等方面[2].

近年來，眾多研究指出，低頻率超聲波(20～100 kHz)可通過空穴效應、微流束效應等物理作用改變乳蛋白質的結構、空間構象和聚集方式，從而影響其理化和功能性質[3].已有研究表明，相比高壓均質和機械攪拌，低頻超聲處理(20 kHz)可在短時間內(2～3 min)顯著增加酪蛋白粉末、脫脂乳粉及乳蛋白粉的溶解性，顯著降低其粒徑[4-6].酪蛋白粉末復溶后經超聲處理其凝膠強度增大，脫水收縮作用降低[7].5 min低頻超聲處理(20 kHz)使酪蛋白粒徑達到最小，且酸凝膠強度增大[8].在高于乳體系自然pH環境下，復原乳經低頻超聲(20 kHz)后，酪蛋白解離程度增大[5].另外，原乳經超聲(20 kHz)后，其發酵性能和制作的酸奶性質與高壓均質處理乳具有顯著差異[9-10].綜上所述，低頻超聲處理可顯著降低酪蛋白粒徑，改善其部分理化和功能性質.然而，目前的研究多集中于酪蛋白粉末復溶后的結構和原乳凝膠性能等方面，關于脫脂乳中天然酪蛋白膠束結構及脫脂乳乳化性、發泡性等界面性質隨超聲處理的變化規律鮮有報道.

本研究采用20 kHz超聲波對脫脂牛乳進行不同時間超聲處理，系統分析處理前后

的牛乳酪蛋白膠束平均粒徑、脫脂牛乳濁度和乳蛋白熒光特性變化規律，并討論了脫脂牛乳乳化活性、乳化穩定性、起泡性和泡沫穩定性隨超聲時間的變化規律，以期為超聲波改性技術在鮮牛乳加工過程中的應用提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛乳(甘肅農業大學牛奶場，每日新鮮的生牛乳，奶牛的健康狀態良好，無疾病)，疊氮化鈉(阿拉丁化學試劑有限公司)，鹽酸、氫氧化鈉為分析純(天津市化學試劑三廠)，十二烷基磺酸鈉(SDS)(天津市博迪化工有限公司)，8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)(阿拉丁化學試劑有限公司)，去離子水，菜籽油購于超市.

1.2 儀器與設備

GT10-1型高速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)，JY92-ⅡDN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，PHS-3C實驗室pH計(上海三信儀表廠)，精密電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，分光光度計(722S)(上海精密科學儀器有限公司)，UV-2100雙光束紫外-可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器有限責任公司)，熒光分光光度計(F-380)(天津港東科技發展股份有限公司)，Bettersize2000激光粒度儀(丹東百特儀器有限公司)，均質機，微量注射器.

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預處理 新鮮牛乳經紗布過濾除雜后，在25 ℃、轉速4 000 r/min條件下離心20 min，除去上層脂肪，即得脫脂乳.為了防止微生物生長，加入0.02%(w/v)疊氮化鈉并在4 ℃下保存.

1.3.2 超聲處理樣品 將上述脫脂乳置于工作頻率為20 kHz的超聲波細胞粉碎機中，調整超聲波的輸出功率為400 W，參考孫顏君等[11]的方法，依據預試驗結果，設置超聲波處理時間為2、4、6、8、10、15、20 min，超聲時間3 s，間隔時間3 s，超聲過程在循環水浴中進行，以確保樣品溫度維持在室溫；以未經超聲波處

理的脫脂乳為對照.

1.3.3 粒徑測定 采用Bettersize2000激光粒度儀測定樣品中酪蛋白膠束粒徑，泵速1 800 r/min，顆粒折射率1.46，分散劑折射率1.33，吸收參數0.001.

1.3.4 濁度的測定 參照Claudia等[12]的方法，將處理后的樣品搖勻后準確移取200 μL，用去離子水稀釋至10.00 mL，室溫下，用紫外-可見分光光度計在860

nm處測定樣品溶液的吸光度，參比溶液為去離子水，平行測定3次，取平均值.

1.3.5 熒光特性測定

1.3.5.1 內源熒光 參照Yazdi等[13]的方法，25 ℃下采用熒光分光光度計測定其熒光發射光譜.用微量移液器移取超聲處理后的樣品100 μL，加入20.0 mL去離子水并混勻.熒光光譜激發波長為290 nm(狹縫2.5 nm)，發射光譜采集范圍為290～450 nm(狹縫2.5 nm)，掃描速率1 200 nm/min.

1.3.5.2 外源熒光 參照Philippe等[14]的方法，25 ℃下采用熒光分光光度計測定其熒光發射光譜.分別用微量移液器移取超聲處理后的樣品300 μL，加入20.0 mL去離子水，再加入100 μL濃度為8.0×10-3 mol/L的ANS熒光試劑，振蕩，靜置3 min.激發波長為390 nm(狹縫2.5 nm)，發射光譜采集范圍為400～650

nm(狹縫2.5 nm)，掃描速率1 200 nm/min.

1.3.6 乳化活性及乳化穩定性的測定 參照Jiang等[15]的方法，取3 mL菜籽油與9 mL待測樣品溶液，在高速分散均質機上均質1 min，用微量注射器迅速從乳狀液的底部取100 μL，稀釋10 mL 0.1%的SDS溶液，500 nm波長下測定吸光度值，記為A0.將乳狀液靜置10 min再以同樣的方法稀釋并測定，得到吸光值A10，乳化活力指數(EAI)與乳狀液穩定性(ES)分別按公式(1)、(2)計算.

乳化活力指數

(1)

式中，EAI表示每克蛋白質的乳化面積(m2/g)；C為溶液中樣品蛋白的濃度(1

g/mL)；L為比色杯直徑(1 cm)；Φ為油相所占的分數；N為稀釋倍數.

乳化穩定性

(2)

式中，A0為零時刻的吸光值；A10為10 min時的吸光值.

1.3.7 起泡性和起泡穩定性的測定 參照Jiang等[15]的方法，取25 mL溶液置于50 mL的燒杯中，在20 000 r/min下高速攪打1 min；快速將泡沫完全轉移至量筒中，測定最初的泡沫體積V0和量筒靜置30 min時保留的泡沫體積V30.起泡性和起泡穩定性分別按公式(3)、(4)計算.

起泡性

(3)

起泡穩定性

(4)

1.4 數據分析

所有數據均重復試驗3次，結果用表示.采用Orign 8.0軟件作圖，用SPSS 17.0軟件對數據進行顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 超聲處理對脫脂牛乳pH值的影響

由表1可以看出，超聲時間對脫脂乳的pH值無顯著影響(P>0.05)，可見超聲處理并不影響乳中礦物質形態和其平衡，換言之，超聲處理并沒有促使膠束中礦物質大幅度解離，這與Jambrak等[16]的研究結果一致.

表1 超聲時間對脫脂乳pH值的影響Table 1 Effect of ultrasound time on pH

of skim milk超聲時間/minUltrasound

timepH06.67±0.0026.66±0.0146.66±0.0166.67±0.0186.67±0.00106.67±0.01156.67±0.02206.67±0.01

2.2 超聲處理對脫脂牛乳中酪蛋白膠束粒徑的影響

由圖1可知，隨著超聲時間的延長，脫脂牛乳中酪蛋白膠束平均粒徑減小.當超聲時間為2 min時，酪蛋白膠束粒徑變化不顯著.2 min后，隨超聲時間的延長膠束粒徑顯著減小.20 min時，膠束平均粒徑由最初的283 nm降至180

apala等[17]和Shanmmugam等[18]在研究中也觀察到超聲處理后的酪蛋白平均粒徑降低.這是由于超聲波的空穴效應產生機械剪切力使蛋白顆粒被粉碎，甚至表面分子發生解離，從而降低了膠束粒徑.

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05).Different letters indicate the significant

differences(P<0.05).圖1 超聲時間對脫脂牛乳酪蛋白膠束平均粒徑的影響Figure

1 Effect of ultrasonic time on average particle size of cain micelles in

skim milk

2.3 超聲處理對脫脂牛乳濁度的影響

濁度不僅能定性說明酪蛋白膠束間相互作用的改變，而且還與微粒粒徑有關[19].由圖2可以看出，15 min之內，脫脂乳濁度隨超聲時間的延長而顯著降低，之后變化不顯著.脫脂乳濁度變化趨勢與膠束粒徑變化趨勢基本一致，也有文獻報道了相似結論[18].

圖2 超聲時間對脫脂牛乳蛋白濁度的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on

turbidity of skim milk

2.4 超聲處理對脫脂牛乳熒光特性的影響

不同超聲時間對脫脂牛乳內源熒光光譜的影響見圖3.

A：超聲時間對脫脂牛乳內源熒光特性的影響；B：超聲時間對脫脂牛乳內源熒光最大熒光強度和最大發射波長的影響.A:Effects of ultrasonic time on

endogenous fluorescence characteristics of skim milk;B:Effects of ultrasonic

time on the maximum fluorescence intensity and maximum emission

wavelength of endogenous fluorescence of skim milk.圖3 脫脂牛乳內源熒光特性Figure 3 Fluorescence emission spectra of Skim Milk

熒光光譜能有效反應蛋白質三級結構的構象變化.最大發射波長(λmax)是反映色氨酸殘基所處微環境的重要指標，說明蛋白質構象的變化和結構的伸展[20].由圖3可見，超聲處理2 min和4 min后，脫脂牛乳最大發射波長λmax發生紅移，說明在超聲波作用下乳蛋白構象發生改變，色氨酸側鏈轉移到蛋白分子表面，造成蛋白微環境極性的增加，這與Mirianim等[21]的研究結果一致.雖然λmax隨超聲時間呈現出波動變化，但每個時間點下的λmax與未處理相比發生了紅移，證明超聲波使乳蛋白微觀結構發生了改變.就最大熒光強度而言，雖然4 min和15 min出現拐點，但超聲處理使其降低，說明蛋白質結構打開，使發色基團暴露到溶劑中，造成熒光強度的降低[22-23].因此，通過熒光光譜分析可以看出，超聲波處理改變了脫脂牛乳蛋白的分子結構，膠束親水性增強.

常用的評價蛋白質表面疏水性的方法有ANS熒光探針法，ANS與蛋白結合的熒光強度與蛋白的表面疏水性呈正相關性[24].維持蛋白質三級結構的主要作用力是疏水作用，它在維持蛋白結構穩定和功能性質方面起著重要作用[25].由圖4可知，與未經超聲處理的脫脂乳相比，當超聲時間為2 min時，脫脂乳疏水性降低，意味著乳清蛋白和酪蛋白膠束相互作用改變，或者膠束內部結構變得致密，使ANS與乳蛋白的結合能力降低[26].2 min后，隨著超聲時間的延長，脫脂牛乳蛋白的表面疏水性逐漸增大，說明空化作用使蛋白質分子的結構變得疏松，更易于與ANS結合[27].ANS熒光光譜λmax在超聲時間為2 min時迅速增大，之后隨著超聲時間的延長呈現小幅度波動.

A：超聲時間對脫脂牛乳外源熒光特性的影響；B：超聲時間對脫脂牛乳外源熒光最大熒光強度和最大發射波長的影響.A:Effects of ultrasonic time on

exogenous fluorescence characteristics of skim milk;B:Effects of ultrasonic

time on the maximum fluorescence intensity and maximum emission

wavelength of exogenous fluorescence of skim milk.圖4 脫脂牛乳蛋白ANS熒光發射光譜Figure 4 Fluorescence emission spectra of ANS in skim milk

由此可見，內源熒光和ANS熒光光譜變化均表明超聲處理使脫脂牛乳中蛋白質結構發生了改變.然而，由于脫脂乳中成分復雜，熒光特性不僅取決于酪蛋白膠束，還涉及乳清蛋白，以及乳清蛋白和酪蛋白膠束間的相互作用，因此熒光光譜并沒有呈現出規律性變化.

2.5 超聲處理對脫脂牛乳乳化性的影響

不同超聲時間對脫脂牛乳乳化性的影響見圖5.在油水混合液中，酪蛋白分子的親水、親油基團使蛋白分子具有擴散到油水界面的趨勢，疏水部分朝向脂質，親水部分朝向水相，油水界面張力降低并成膜，因而具有乳化性能[28].用乳化活力(EAI)和乳化穩定性(ES)表征蛋白的乳化性，是蛋白質功能性質最有力的指標之一[29].由圖5可知，超聲處理4 min內，脫脂乳乳化活性顯著增加，在4 min時達到最大(1.353 m2/g)，之后緩慢降低.乳化穩定性隨超聲時間的增加而增大，在8 min時達到最大(109.15%)，8 min后迅速降低，之后基本保持不變.總體而言，超聲處理10 min內，脫脂乳的乳化性得到顯著提高.

超聲處理過程中發生機械性震蕩，分子的空間結構被破壞，蛋白質分子部分展開，油水界面聚集了很多分子降低了表面張力，從而提高了乳化性[30].由熒光光譜看出，4 min超聲處理時脫脂乳的熒光特性發生了顯著改變，而乳蛋白結構及疏水性的變化直接導致了乳化性的變化.之后由于超聲時間進一步延長，機械振蕩的高能量和溶液溫度的上升，改變了原來分散的蛋白空間結構，蛋白變性程度增大，乳化活力指數和乳化穩定性都呈現下降的趨勢[11].綜上所述，超聲處理4 min可顯著改善脫脂牛乳的乳化性.

圖5 超聲時間對脫脂牛乳蛋白乳化性的影響Figure 5 Effects of ultrasonic time

on emulsification of skim milk

2.6 超聲處理對脫脂牛乳起泡性的影響

蛋白質在超聲波作用下，大量氣泡進入溶液形成一定的氣-液界面，溶液中的蛋白分子吸附在這些界面上使界面張力降低并成膜稱為蛋白的起泡性.維持泡沫穩定存在的能力稱為蛋白質的起泡穩定性.由圖6所示，隨著超聲時間的增加，脫脂牛乳起泡性呈先增后減的趨勢；與未經超聲處理相比，在4 min時起泡性由最初的128.8%增加到156.8%.雖然脫脂乳的起泡性在超聲4 min后隨著超聲時間的延長而降低，但其值依然高于未處理樣品.在超聲時間為2 min時，泡沫穩定性略微降低，之后呈增大趨勢.有研究指出，蛋白經超聲處理解聚成小分子亞基，增加了氣水界面的蛋白分子數目，起泡能力提高[31].另外，在上述熒光光譜圖中，4 min超聲處理時脫脂牛乳內源熒光最大發射波長λmax達到最大值，改變了牛乳蛋白質的表面疏水性，促進水-氣界面形成，同時使蛋白分子展開，展開的蛋白分子通過相互作用形成更為穩定的網絡結構和界面膜.而且，超聲處理后酪蛋白膠束粒徑減小，從而增加了其起泡性能力和泡沫穩定性[32].由此可見，4 min超聲處理可顯著改善脫脂乳的起泡性，這與熒光光譜和乳化性研究結論一致.

圖6 超聲時間對脫脂牛乳蛋白起泡性的影響Figure 6 Effects of ultrasonic time

on foaming of skim milk

3 結論

與傳統方法相比，超聲波技術不損失營養物質，無毒、無害，操作簡單，運行成本低廉，無食品安全問題，符合綠色食品工業的發展要求，探索并擴大其應用范圍是目前的研究熱點，是一種較為安全可靠的蛋白質改性方式.20 kHz超聲波處理20

min內對脫脂牛乳pH值不會產生顯著影響，但其濁度和粒徑隨超聲時間的延長顯著降低.熒光特性分析顯示，超聲處理4 min時，脫脂牛乳內源熒光最大發射波長

λmax達到最大值，最大熒光強度由最初的降低突然增大.ANS熒光λmax在超聲處理2 min時迅速增大，之后基本保持不變；ANS最大熒光強度在2 min時降至最低，之后增大.由此可見，超聲處理改變了脫脂乳中蛋白質的微結構和疏水性，4

min時改變程度最大.

乳蛋白的微觀結構和疏水性變化必然引起其界面性質改變.當超聲時間為4 min時，脫脂牛乳乳化活力指數和起泡性達到最大，分別比未處理的提高了35.14%和21.74%.總體而言，超聲處理改善了脫脂乳的界面性質.

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