基因修飾小鼠應(yīng)用于心臟研究的進展從小鼠到人類從基因到臨床_

2023年12月29日發(fā)(作者：考試作弊)

基因修飾小鼠應(yīng)用于心臟研究的進展：從小鼠到人類，從基因到臨床

【摘要】 基因修飾(敲除、變異和過度表達)小鼠自90年代初應(yīng)用于心臟學(xué)研究。近十余年來，利用這一類模型的研究發(fā)現(xiàn)對心血管領(lǐng)域所取得的重要進展有著突出的貢獻，已經(jīng)成為該領(lǐng)域里具有舉足輕重地位的研究手段。目前，基因修飾小鼠模型的數(shù)量日益增多并已形成系統(tǒng)，有關(guān)的心臟表現(xiàn)型數(shù)據(jù)庫日趨豐富，多種從整體到分子水平的表現(xiàn)型的研究手段已十分成熟。在今后的心臟研究中，小鼠模型有望對闡明疾病的分子機制和探索新的治療途徑起到很大的推動作用。

【關(guān)鍵詞】 基因修飾小鼠 臟學(xué) 基因敲除 基因過度表達

ABSTRACT: Since the 1990s， models of genetically modified mice

(gene knockout， mutation or transgene overexpression) have been

increasingly ud in heart rearch. The findings from this class of

murine models have contributed significantly to a number of rearch

breakthroughs achieved in the last 15 years. Currently， the number of

genetically modified mou strains has been increasing steadily. The

models that targeted a family or a functionally relevant group of

proteins have formed systemic tools for rearch u. The databa of

mou cardiac phenotype has been established. Meanwhile， the rearch

methodology and strategic approach exploring mou cardiac phentypes at

molecular to in vivo levels have been mature. It is expected that the

u of this class of genetically targeted mou models will become

increasingly important in future rearch.

KEY WORDS: genetically modified mou; cardiology; gene knockout;

gene overexpression

在破譯了人類DNA編碼序列之后，科研人員面臨的更艱巨的任務(wù)是探討基因在生命健康及疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用，從而尋求疾病診治的新途徑。目前開展這方面研究的重要手段之一是已廣泛應(yīng)用的基因修飾小鼠。近十余年的研究證實，這一類模型的應(yīng)用對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新近取得的重要進展有著突出的貢獻。因此，Rario Capecchi，Martin Evans和Oliver Smithies榮獲了2007年度諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎，以表彰他們在奠定應(yīng)用小鼠胚胎干細胞進行特定基因干預(yù)原理方面的貢獻。

可以用于心臟學(xué)研究的基因修飾小鼠的品系估計已達數(shù)千種。隨著數(shù)量的積累，這一類小鼠模型已形成系統(tǒng)。由此獲得的科研發(fā)現(xiàn)對認識某一蛋白家族或相關(guān)分子在心臟中的作用非常重要。例如，腎上腺素能受體9種亞型的敲除、變異或過

度表達的小鼠均有報道[1]。又如，眾多的參與心肌肥大信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號分子基因的敲除、變異或過度表達的小鼠模型均已建立并廣泛應(yīng)用[2]。同樣，針對位于細胞膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫鈣通道、離子交換體、鈣ATP酶等多種鈣信號調(diào)控蛋白，目前已有20余種基因敲除、變異或過度表達小鼠模型[3]。

1 基因修飾小鼠的種類

應(yīng)用胚胎干細胞單個基因干預(yù)技術(shù)和不同啟動子的選擇，目前可以制造單個基因敲除、變異基因表達、基因過度表達的小鼠品系[4]。在敲除某一基因的基礎(chǔ)上敲入(knock??in)另一基因的模型可以用來研究一種基因的功能能否被另一相關(guān)(如用人的基因替換小鼠基因)或變異基因所替代。基因敲入方法也可以導(dǎo)入某種報告基因(reporter)。兩種以上基因的干預(yù)則可以通過小鼠品系間雜交而得到(表1，圖1)。目前的趨勢是制造可調(diào)控性和器官或細胞特異的基因干預(yù)小鼠模型，從而避免其他非特異性的影響或影響小鼠胚胎發(fā)育而無法得到成年動物[4]。

表1 基因修飾小鼠的種類（略）

Table 1 Types of genetically modified mou models

圖1 不同小鼠品系間雜交(crossbreeding)可供研究基因(蛋白質(zhì))之間的相互作用以及心臟病的基因治療。例如在探討基因治療心力衰竭方面，品系間雜交方法可以研究一種提高心肌收縮性的基因干預(yù)能否糾正某一種基因干預(yù)所引起的心肌病和心力衰竭（略）

Fig.1 Crossbreeding of strains of mice wtih specific gene

targeting allows for investigating gene??gene (or protein??protein)

interactions or explorating gene therapy of heart dia， such as

heart failure. A: Depicted are two strains of genetically modified mice

with cardiac phenotypes of either cardiomyopathy and heart failure

(indicated by yellow colour) or a markedly enhanced myocardial

contractility (indicated by red colour). B: Crossbreeding is uful in

determining whether the heart failure phenotype en in the

cardiomyopathy strain can be reverd by the specific gene??targeting

leading to an enhanced inotropy (indicated by blue colour)

2 小鼠心臟表現(xiàn)型的研究手段

小鼠心臟重約0.1g，左心室容量約40μL，每博心輸出量為20-25μL，心率則高達600次/min。因此，在準(zhǔn)確定量小鼠心臟形態(tài)和功能變化方面對研究儀器的要求很高。近十余年來，多個大公司在科研儀器方面的投入對小鼠心臟學(xué)研究起到了很大的推動作用。在心臟影像學(xué)方面，多個公司的超聲心動影像系統(tǒng)目前均可以

達到相當(dāng)好的分辨率(0.05-0.1mm)(圖2A)。彩色血流或組織多普勒、兩維Strain

rate、心臟超聲造影等均普遍或開始應(yīng)用于科研中。VisulSonic公司的高分辨率超聲系統(tǒng)可供觀測胚胎小鼠心臟形態(tài)及功能狀況。核磁共振成像(MRI)的應(yīng)用也時有報道。Millar導(dǎo)管公司的超微高保真度壓力和壓力/容積導(dǎo)管以及心臟內(nèi)心電圖電極導(dǎo)管也是開展研究的必具設(shè)備(圖2A)。其他常用的儀器還包括D.S.I.公司的監(jiān)測血壓或心電的Telemetry系統(tǒng)，Harvard Apparatus公司的微型呼吸機等。

另一方面，近十幾年對整體小鼠心臟表現(xiàn)型的研究表明，在應(yīng)激或疾病情況下研究小鼠心臟表現(xiàn)型對于闡明基因在疾病發(fā)生和發(fā)展中的作用至關(guān)重要[5]。常用的小鼠心臟疾病模型包括主動脈縮窄 (壓力超負荷)、容量超負荷、心肌缺血/再灌注、心肌梗死等(圖2B)[5]。自從開展小鼠心臟研究以來，業(yè)已積累了豐富的相關(guān)數(shù)據(jù)庫。研究所必需的大量試劑如抗體、檢測藥盒、DNA array芯片等均有商品化供應(yīng)。這些均為今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 應(yīng)用基因修飾小鼠模型所取得的重要研究進展

與腫瘤、免疫、炎癥等領(lǐng)域一樣，基因修飾小鼠的應(yīng)用與近十幾年來在心臟學(xué)研究領(lǐng)域中所取得的重要進展密切有關(guān)(圖3)。現(xiàn)分以下幾個方面簡述。

圖2 A：應(yīng)用心臟超聲影像學(xué)(左)或壓力/容積心導(dǎo)管(右)確定小鼠心臟形態(tài)和功能。圖示小鼠左心室(LV)短軸和長軸二維影像；B：顯微外科手術(shù)方法造成冠狀動脈結(jié)扎(左)或主動脈縮窄(右)（略）

Fig.2 A: Determination of cardiac toporgraphy and function of

mice by echocardiography (Left) or by pressure/volume catheter (right).

Images are short?? and long??axis views of the left ventricle (LV)

of a mou. B: Ligation of the coronary artery (left) or constriction of

the aortic arch (right) in the mou by open??chest surgery. a: aorta;

r.i.: right innominate artery; l.m.: left main carotid artery

圖3 目前用小鼠模型進行心臟研究的基本途徑是應(yīng)用綜合的研究手段在不同的層次去發(fā)現(xiàn)小鼠的心臟表現(xiàn)型，包括在病理情況下研究心臟形態(tài)和功能改變。這些表現(xiàn)型對于理解人類心臟病的分子機制、新的治療靶分子和治療途徑具有重要的價值（略）

Fig.3 Using genetically modified mice， rearchers have adopted

an integrated physiological approach to explore phenotypes that may bear

key information on the regulation of physiology， pathogenesis of

dias and potential therapeutic targets

3.1 動脈粥樣硬化的機制和模型 動脈粥樣硬化的病因涉及多種基因和環(huán)境因素，因此較好地模擬臨床病理特征的動物模型是研究發(fā)病機制和探討有效治療

方案的關(guān)鍵。嚙齒類動物的高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的比值(HDL/LDL)遠遠高于人類，故不易誘發(fā)動脈粥樣硬化病變。基于干擾脂蛋白代謝而建立的數(shù)種基因修飾小鼠在老齡或某些環(huán)境因素，例如高脂飲食、高血壓、血管內(nèi)皮損傷等的影響下，可以發(fā)生與人類相似的動脈粥樣硬化病變。這些模型包括脂蛋白??E基因敲除 (ApoE -/-)、低密度脂蛋白受體敲除(LDL??R-/-)和表達變異的ApoE基因(E3L)[6]。應(yīng)用這些小鼠模型進行的研究極大地促進了對動脈粥樣硬化病變病因的認識和實驗性治療的探討，已成為最常選用的動物模型。

3.2 心臟發(fā)生學(xué)及先天性心臟病的分子機制 應(yīng)用基因敲除小鼠研究心臟胚胎發(fā)生的分子機制在近年里有了突破性進展。現(xiàn)已確定若干基因在心臟發(fā)生的各個階段起到關(guān)鍵作用。例如，NKx2.5基因缺失小鼠發(fā)生心房心室間隔缺損和傳導(dǎo)系統(tǒng)障礙[7]。又如組織轉(zhuǎn)化因子?撥?(TGF?撥?)影響心臟瓣膜的形成，而心肌的發(fā)生則受到多個基因的影響，包括ErbB、EF2、SRF、GATA和myocardin等[7??8]。新近的研究表明，敲除微小RNA1.2(miR1.2)可能通過抑制心臟發(fā)生中關(guān)鍵基因之一Hand的mRNA、蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯而干擾心房間隔的形成[9]。這些研究為深入了解心臟發(fā)生的分子機制打下了方法學(xué)基礎(chǔ)，也為人類先天性心臟病的分子發(fā)病學(xué)和基因診斷提供了重要的實驗依據(jù)。

3.3 心肌病的分子機制 心肌病的發(fā)生與肌節(jié)的結(jié)構(gòu)蛋白、收縮蛋白或收縮調(diào)節(jié)蛋白的基因變異密切有關(guān)。目前已有上百種有關(guān)的基因變異或缺失小鼠模型的報道。心臟表現(xiàn)型研究證明其中絕大多數(shù)品系的小鼠發(fā)生各種類型的心肌病[7??8]，而且許多小鼠心肌病的表現(xiàn)型與人類相關(guān)基因變異所致的心肌病相似。例如，α?布∧?蛋白重鏈(α??MHC)的變異導(dǎo)致肥厚型心肌病，而mLIM基因敲除小鼠發(fā)生擴張型心肌病[10]。目前利用小鼠復(fù)制相應(yīng)基因變異已成為確定人類心肌病基因發(fā)病機制的重要研究手段。

妊娠心肌病的病死率很高，其病因一直不清楚。新近的研究取得了突破性進展[11]。妊娠期間心肌發(fā)生生理性肥大并伴有毛細血管增生。心肌特異性敲除STAT3的雌性小鼠妊娠時心肌肥大但不伴有毛細血管增生，證明了STAT3在介導(dǎo)血管增生中的關(guān)鍵作用。STAT3的另一保護性作用是抑制氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)某些基因的表達，如Cathepsin D。Cathepsin D降解在妊娠后期至泌乳期大量分泌的泌乳素，生成16ku的片段。該片段可抑制微血管的生成，因而STAT3敲除小鼠發(fā)生妊娠心肌病[11]。進一步的臨床研究證實了在小鼠模型上觀測到的這些分子異常，并驗證了應(yīng)用藥物抑制泌乳素的分泌，可以有效地治療妊娠心肌病[11]。

3.4 心肌肥大的分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 生理性和病理性心肌肥大的分子機制是應(yīng)用基因修飾小鼠的重要研究方面。應(yīng)用表達組成型活化(constitutively active)和顯性抑制(dominant negative)磷酸肌醇3激酶(PI3K)的基因修飾小鼠的研究證明，胰島素生長激素(IGF1)/PI3K介導(dǎo)生理性心肌肥大[8，12]，而多種信號通路通過鈣/calcineurin或Gq蛋白/蛋白激酶C(PKC)等導(dǎo)致病理性心肌肥大。Olson

的研究組應(yīng)用基因修飾小鼠模型證實的Calcineurin通路是這一領(lǐng)域的突破性進展[13]。

應(yīng)用基因修飾小鼠模型的一些發(fā)現(xiàn)使我們對心肌肥大有了全新的認識。例如，以往認為α1A?采鏨舷偎嗇蓯芴?(α1A??AR)激活是導(dǎo)致心肌肥大的重要機制之一。而新近的研究發(fā)現(xiàn)，過度表達α1A??AR本身并不引起心肌肥大[1]，也不加重病理情況下的心肌肥大[14]。另一重要發(fā)現(xiàn)是在慢性壓力超負荷情況下，多種基因修飾小鼠心肌肥大程度明顯輕于對照動物，而心室功能可以保持在代償狀態(tài)[15??17]。這一發(fā)現(xiàn)對心肌肥大是長期壓力超負荷狀況下必須的代償機制的傳統(tǒng)觀點提出了質(zhì)疑，并提示抑制或逆轉(zhuǎn)心肌肥大可能成為治療心臟病的新目標(biāo)。

3.5 心律失常的分子機制 目前，基因修飾小鼠已成為心臟電生理的主要哺乳類動物模型，相應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)對理解心律失常發(fā)生及維持的基因和分子機制，尤其是離子通道病(channelopathy)概念的提出有著重要的貢獻。離子通道病涉及細胞膜鉀、鈉或鈣通道蛋白的變異。表達某些細胞膜離子通道蛋白的小鼠表現(xiàn)出人類相似的心臟電生理乃至心肌顯微結(jié)構(gòu)方面的異常，例如長或短Q??T綜合征(LQTS，SQTS)或Brugada綜合征[18]。許多心肌病小鼠也表現(xiàn)出各種類型的心律失常和心性猝死，為這方面的研究提供了有價值的模型。

心房纖顫是臨床最為常見的心律失常，其治療方案和療效有待提高。然而對心房纖顫的分子病因一直不清楚。近年來已有若干個小鼠心房纖顫模型問世，基因修飾包括心肌特異性過度表達TGF?撥隆?RhoA、腫瘤壞死因子?撥?(TNF?撥?)或敲除KCNE1[19??20]。我們新近的品系間雜交研究發(fā)現(xiàn)，降低心肌病小鼠心肌PI3K的活性可以加重心房擴大和心肌纖維化病變，并誘發(fā)心房纖顫[21]。

3.6 細胞內(nèi)鈣的調(diào)控與心臟病的聯(lián)系 在心肌舒張時相，衰竭心肌發(fā)生肌漿網(wǎng)內(nèi)儲存的鈣經(jīng)由Ryanodin受體(RyR)控制的鈣通道而外漏，造成舒張期細胞內(nèi)鈣水平升高，由此導(dǎo)致心肌舒張不全和心律失常。利用一系列的小鼠模型，Marks的研究組最近證明，幾種RyR結(jié)合蛋白起到了穩(wěn)定RyR鈣通道的作用。在心力衰竭情況下，這些蛋白質(zhì)尤其是FK506?步岷系鞍?(FKBP12.6)被過度磷酸化而與RyR分離，從而導(dǎo)致RyR通道功能異常進而引起鈣庫內(nèi)鈣外溢[22]。循此發(fā)現(xiàn)，目前已開發(fā)出數(shù)種RyR?哺仆ǖ牢榷?劑，經(jīng)實驗研究證實具有改善心功能和抗心律失常的作用。

3.7 小鼠模型在心臟病基因或細胞治療研究方面的應(yīng)用 在心臟病基因或細胞治療研究領(lǐng)域，小鼠模型的應(yīng)用首先是提供了一系列的心臟疾病和實驗工具。心力衰竭的突出問題是心肌收縮力減弱。利用基因修飾小鼠模型的研究業(yè)已確認，十余種基因干預(yù)可以長期提高基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌收縮性(表2)。例如過度表達腎上腺素能受體(α1A?病?β1?病?β2??AR)等均可顯著提高心肌收縮性[1]。然

而進一步的研究發(fā)現(xiàn)其中一些品系的小鼠由于特定基因表達倍數(shù)過高或隨著年齡增加而出現(xiàn)心肌病理損害和心肌病，提示基因干預(yù)(過度表達)具有量效關(guān)系(表2)[1，23]。有數(shù)種基因干預(yù)小鼠則無明顯心臟病變而正性肌力作用長期保持，例如敲除受磷蛋白(phospholamban)，過度表達5型腺甘環(huán)化酶或低倍數(shù)過度表達β2??AR(<100倍)或α1A??AR(<80倍)等。應(yīng)用品系雜交的方法證明，敲除受磷蛋白可以逆轉(zhuǎn)由于mLIM敲除或β1??AR過度表達所引起的擴張型心肌病[10，24]。

松弛素(relaxin)是一生殖生理肽類激素。我們于2003年報導(dǎo)松弛素基因敲除小鼠隨著年齡增加而出現(xiàn)心肌纖維化并伴有心室舒張功能異常[25]。而后的研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用人松弛素進行治療或利用腺病毒介導(dǎo)的松弛素基因轉(zhuǎn)染均可以逆轉(zhuǎn)動物心肌纖維化病變。

心臟病細胞治療設(shè)想的提出令人鼓舞。然而，目前臨床小規(guī)模實驗療效有限，尚有大量關(guān)鍵的基礎(chǔ)問題還待解決，例如移植的干細胞存活率不理想、分化程度低、與生存的心肌之間的功能匹配不佳等。目前多種小鼠模型是該領(lǐng)域研究的必不可少的工具，例如有免疫缺陷而對植入干細胞沒有排斥反應(yīng)的SCID小鼠，可供監(jiān)測植入干細胞的EGFP(定位于胞漿)或β??Gal(定位于胞核)的轉(zhuǎn)基因小鼠等。應(yīng)用基因修飾小鼠的研究還證明了一些與移植干細胞存活和向心肌細胞分化的重要因子，如胰島素生長因子、AKT等。

表2 目前證實具有正性肌力表現(xiàn)型的一些基因修飾小鼠品系。其中一些品系發(fā)生心肌病而提示基因治療“副作用”的可能（略）

Table 2 Strains of genetically modified mice with identified

cardiac ??hyper??inotropy phenotype??. Some of strians also

develop with aging cardiomyopathy indicating ??side??effect?? of

gene overexpression

4 研究展望

新一代小鼠模型(即器官或細胞特異性，可調(diào)節(jié)性敲除或過度表達)將會越來越多地采用，從而避免小鼠胚胎期死亡或一些非特異的心臟表現(xiàn)型。可以預(yù)測，基因修飾小鼠的應(yīng)用在今后會日益廣泛。這一類模型已經(jīng)并將更多地用于心臟基因表達和蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，包括表觀遺傳學(xué)(epigenetics)、微小RNA(micro

RNA)和siRNA[4，9，26]。

在闡明新的治療概念(proof??of??concept)方面，對基本的心臟病理生理機制，例如心律失常、心肌纖維化、心肌肥大、心肌病等的研究將會更多地應(yīng)用小鼠模型，而這些研究將會導(dǎo)致一些重要的全新認識。一般認為小鼠模型上的發(fā)現(xiàn)在

推廣到臨床應(yīng)用之前需要在大的動物模型(translational models)上予以進一步驗證。然而已有證據(jù)表明，在某些情況下，實現(xiàn)科研發(fā)現(xiàn)從“小鼠到人”的直接過渡是可能的，例如前面述及的產(chǎn)后心肌病病因和臨床治療方案的闡明[11]。

目前已認識到，小鼠基因背景(即品系)對表現(xiàn)型有重要的影響[27]，這對表現(xiàn)型的解釋以及不同小鼠品系的基因修飾模型之間的比較造成一定困難。然而這一特征為今后研究基因背景對某一特定基因功能的影響提供了重要的線索和研究手段，值得應(yīng)用基因組學(xué)的研究手段進行探討。

為了加快突破性的科研發(fā)現(xiàn)以及從基礎(chǔ)到臨床或從小鼠到人之間科研成果的轉(zhuǎn)化，需要基礎(chǔ)科研人員與臨床醫(yī)生有更多的交流與合作。這不僅為基礎(chǔ)研究不斷提供新的線索和思路，也有利于加強臨床人員的科研意識和提高疾病診斷治療的水平。

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