土壤微生物數量測定方法整理

2024年3月6日發(作者：朝花夕拾推薦詞)

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土壤微生物的別離鑒定及數量測定

（一） 培養基的制備

Ⅰ測定微生物總量培養基：

1. 細菌培養基〔牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基〕

牛肉膏Beefextract5.0g

蛋白胨Peptone10.0g

NaCI5.0g

蒸餾水H201000m1

瓊脂15～20g

PH7.2~7.4

制備步驟：

⑴ 在100 mL小燒杯中稱取牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，加50 mL蒸餾水，置電爐攪拌加熱至牛肉膏，蛋白胨完全溶解.

⑵ 向小鋁鍋中參加500 mL蒸餾水，將溶解的牛肉膏，蛋白胨倒入鋁鍋中并用自來水洗2～3次.參加5.0gNaC1，在電爐上邊加熱邊攪拌.

⑶ 參加洗凈的瓊脂條，繼續攪拌，加熱至瓊脂完全熔化，補足水量至1000 mL.

⑷用NaOH或HC1調至pH7.0. 用酸度計或用玻棒沾少許液體用精細pH試紙測定其pH值，并用10％NaOH調至所需pH值，必要時用濾紙或脫脂棉過濾。一般比要求的pH高出0.2，因為高壓蒸汽滅菌后，pH常降低。

⑸根據不同需要，可將配好的培養基分裝入配有棉塞的試管或三角瓶。注意分裝時防止培養基掛在瓶口或管口上引起雜菌污染。如液體培養基，應裝試管高度的1/4左右；固體培養基裝試管高度的1/5左右；裝入三角瓶的量以三角瓶容量的一半為限。，塞好棉塞，裝入小鐵絲筐，然后用舊報紙將棉塞局部包好. 標簽說明培養基的名稱、配制日期等。

⑹ 高壓蒸汽滅菌，用0.1Mpa〔15lb/in2〕121℃滅菌〔15-20〕30min.

2.放線菌培養基〔改進高氏1號瓊脂培養基〕

可溶性淀粉 20g

KNO3

1g

K2HPO40.5g

MgSO4? 7H2O 0.5g

NaCl 0.5g原0.05g

FeSO4? 7H2O 0.01g

pH 7.2-7.4

制備步驟：

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（1） 計算 根據配方計算各種藥品所需要的量，然后再分別稱量。

（2） 稱量 準確稱量各種成分。

（3） 溶化 配制時，先用少量冷水將淀粉調成糊狀，倒入少許沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補足水分到1000ml，調PH〔可不調〕。

（4） 分裝、包扎、滅菌。

注：各成分按配方順序依次溶解，對于微量成分，可預先配成高濃度的溶液，方便配置時量的控制。配制時，先用少量冷水，將淀粉調成糊狀，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加熱，邊攪拌邊依次逐一溶化其他成分，溶化后，補足水分到1000ml，調pH。

另：倒平板之前，在溶化的培養基中加重鉻酸鉀溶液，每300mL培養基加3%重鉻酸鉀1mL(l00ppm)。

3. 真菌培養基〔馬丁〔Martin〕-孟加拉紅瓊脂培養基〕

葡萄糖 10.0g

MgSO4.7H2O0.5g

蛋白胨 5.0g

孟加拉紅 33.4mg 〔或者每升加1%溶液3.3mL〕

K2HPO41g

蒸餾水H201000m1

PH 自然(4-5)

制備步驟：

〔1〕計算 根據配方計算各種藥品所需要的量，然后再分別稱量。

〔2〕稱量和熔化 按培養基配方，準確稱取各成分，并將各成分依次溶化在少于所需要的水量中待各成分完全溶化后，邊加邊攪拌, 以防糊底,補足水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的溶液，在1000ml培養液中參加1%的孟加拉紅溶液3.3ml，混勻后，參加瓊脂加熱溶化。

(3) 分裝、加塞、包扎、滅菌。

(4) 鏈霉素的參加 由于鏈霉素受熱易分解，所以臨用時將培養基溶化后待溫度降低至45攝氏度左右時才能參加。

注：⑴滅菌前加卡那霉素20μg/ml，或者倒平板之前加鏈霉素。

⑵倒平板之前加乳酸，每100mL培養基加。

Ⅱ測定功能菌所用培養基：

1.亞硝酸細菌培養基〔改進的斯蒂芬遜〔Stephenson〕培養基A〕

(NH4)2SO42.0g

NaH2PO40.25g

MnSO4·4H2O0.01g

MgSO4·7H2O0.03g

K2HPO40.75g

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CaCO35.0g

蒸餾水 1000ml

PH 7.2

注：CaCO3最后加，不需要溶解，直接調PH，培養基中有這個成分是為了緩沖pH。因為硝化細菌的生長會產生酸化效應，使得氫離子過剩，到了一定程度硝化作用將無法繼續，所以要堿性物質平衡酸堿。下同。

2.硝酸細菌培養基〔改進的斯蒂芬遜〔Stephenson〕培養基B〕

NaH2PO40.25g

K2HPO40.75g

MgSO4·7H2O0.03g

MnSO4·4H2O0.01g

CaCO31.0g

Na2CO31.0g

NaNO2

1.0g

蒸餾水 1000ml

PH 7.2

3.反硝化細菌培養基

檸檬酸鈉 5.0 g

KNO32.0 g

KH2PO41.0 g,

K2HPO41.0 g

MgSO4·7H2O0.2 g

蒸餾水 1000 ml

pH值 7.2~7.5

4.好氣性自生固氮菌培養基〔改進阿須貝(Ashby)無氮培養基〕

苯甲酸鈉 1.5 g

K2HPO40.2 g

MgSO4·7H2O0.2 g

NaCl 0.2 g

CaSO4·2H2O0.1 g

PH7.4—7.6

注：在培養基分裝入試管時，每管參加一1cm濾紙長條，要露出液面。

5.氨氧化細菌培養基〔蛋白胨氨化培養基〕

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K2HPO40.5 g

KH2PO40.5 g,

MgSO4·7H2O0.5 g

蛋白胨 5.0 g

蒸餾水 1000ml

PH7.0~7.2

6. 好氣性纖維素分解菌培養基〔依姆歇涅茨基纖維素分解菌培養基〕

KH2PO41.0 g

FeCl3·6 H2O0.1 g

MgSO4·7H2O0.3 g

CaCl2·6H2O 0.1 g

NaCl 0. 1 g

NaNO32.5 g

pH7.2～7．4

注：在培養基分裝入試管時，每管參加一1cm濾紙長條，需露出液面。

(二)試劑的配制

1.格里斯試劑〔Griess Reagent〕第一、第二液：

第一液：將0.5g的對氨基苯磺酸〔Sulfanilic Acid〕溶于150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

第二液：將0.5gα-萘胺〔α-naphthylamine〕參加50ml蒸餾水中，煮沸后，緩緩參加150ml的20-30%稀醋酸溶液中，保存于棕色瓶中。

2. 納氏試劑

甲液：將20.0g碘化汞和10.0g碘化鉀溶于100ml蒸餾水中。

乙液：將20.0g氫氧化鉀溶于100ml水中。

分別配制甲、乙二液，待冷卻后混合，放置2天后使用。保存于棕色瓶中。取上清液使用，保存期三周，隨著沉淀增加會影響測定結果。

3.二苯胺試劑：

溶1.0g無色的二苯胺〔Diphenylamine〕于20ml蒸餾水中，然后徐徐參加100ml濃硫酸〔相對密度1.84〕中，保存于棕色瓶中。

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〔三〕實驗器材

1.儀器設備

4℃冰箱、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、電子天平、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺、微量移液器、全溫空氣搖床、旋渦混合器、磁力攪拌器、微波爐等。

2.器材準備

⑴將90ml水裝入250ml三角瓶中，并裝有15-20個玻璃珠，滅菌。

⑵將9ml水裝入試管，滅菌。

⑶試管架，1ml無菌吸管，記號筆，白瓷比色板，接種環，酒精燈等。

〔四〕實驗方法

1.樣品采集

在靠近植株根系部, 去除表層0-5cm的表土，采集5-20 cm土壤剖面,多點采集, 混勻后四分法取1 kg, 裝無菌塑料袋帶回，4℃冰箱保存。

2.懸液制備

稱取10g土壤樣品，放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，置于搖床上室溫振蕩20min，

使土樣與水充分混合，將土壤中的微生物細胞充分分散，從土壤中別離出來。此為10-1土壤懸液，吸取lml此土壤懸液于9ml無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次混勻，制成10-2土壤懸液。以此類推依次制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8不同稀釋度的土壤懸液。

3.土壤懸液稀釋度選擇

⑴細菌:10-4~10-6

⑵放線菌：10-3~10-5

⑶真菌：10-2~10-4

以上采用稀釋平板法，分別設置三個濃度梯度，二次重復。

⑷亞硝酸細菌：10-3~10-6

⑸硝酸細菌：10-3~10-6

⑹反硝化細菌：10-4~10-7

⑺好氣性自生固氮菌：10-3~10-6

⑻氨氧化細菌：10-5~10-8

⑼好氣性纖維素分解菌：10-2~10-5

以上采用最大或然法〔MPN〕，分別設置四個濃度梯度，三次重復。

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4.接種(平板接種技術)

平板接種是用接種環將菌種接至平板培養基上,或用移液管,滴管將一定體積的菌液移至平板培養基上,然后進展培養.其目的是進展菌落形態觀察,別離純化菌種,活菌計數,或進展其它試驗.其方法有多種,根據實驗的目的要求不同,可分以下幾種.

①斜面菌種接至平板

劃線法:按無菌操作的方法自斜面用接種環直接取少量菌體,在平板培養基外表自左至右輕輕連續劃線或分區劃線,注意不要劃破培養基.或先制成菌懸液,接種在平板邊緣的一處,將接種環灼燒滅菌,再從有菌的部位如上方法劃線接種.

點接法:一般用于霉菌菌落觀察的接種.無菌操作下,用接種針從斜面或孢子懸液中取少量孢子,輕輕點接在平板培養基上,點接的部位和點接的次數根據實驗目的與要求確定.

②菌懸液接至平板涂抹法:用滅菌的移液管或滴管吸取一定體積的菌液移至平板上,然后用無菌的玻璃涂棒將菌液均 勻涂布在整個平板上.

混菌法:先將菌液參加培養皿中,然后參加融化并冷卻至45～50℃的固體培養基,輕輕搖勻,平置,待完全凝固后倒置培養.

③平板菌種接至斜面

此法一般是將別離培養得到的單菌落,在無菌操作下分別接種到斜面培養基上,以便進一步擴大培養或作保存之用.接種之前先選好平板上的單菌落,并做好標記.左手拿平板,右手拿接種環,在火焰上方或火焰旁邊操作,灼燒接種環后將接種環在空白培養基處冷卻,以免將菌種燙死,然后挑取菌落,在火焰旁邊稍等片刻,此時左手將平板放下,拿起斜面培養基,按斜面接種的方法接種.

5.培養

將所有試管和平板置于25-28℃黑暗條件下避光培養。培養時間由短到長分別為：

⑴真菌：2～3d；

⑵細菌：3～4d；

⑶放線菌：5～7d。

⑷氨氧化細菌：7～8d；

⑸好氣性自生固氮菌：7～8d；

⑹亞硝酸細菌：10～14d；

⑺硝酸細菌：10～14d；

⑻反硝化細菌：10～14d；

⑼好氣性纖維素分解菌：10～14d；

6.結果觀察

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⑴亞硝酸細菌：取出培養液5滴于白瓷比色板上，參加格里斯試劑〔Griess Reagent〕第一、第二液各兩滴，如有亞硝酸鹽存在，那么呈紅色。

⑵硝酸細菌：取出培養液5滴于白瓷比色板上，參加格里斯試劑〔Griess Reagent〕第一、第二液各兩滴，如不呈紅色，表示亞硝酸均已經完全消失。此時，另取培養液5滴于白瓷比色板上，加二苯胺試劑2滴，如呈藍色，那么表示亞硝酸已經被氧化成硝酸，說明有硝酸細菌的存在。

⑶反硝化細菌：參加格利斯亞硝酸試劑，觀察顏色變化，確定正負反響。

⑷好氣性自生固氮菌：觀察試管培養液外表與濾紙接觸處有無褐色或黏液狀菌膜生成，或有無圓暈混濁出現。

⑸氨氧化細菌：取出培養液5滴于白瓷比色板上，參加納氏試劑兩滴，如有氨氧化細菌存在，那么呈棕色或褐色。

⑹好氣性纖維素分解菌：觀察濾紙條是否成團，有無黃色或橘黃色菌斑出現及濾紙斷裂情況。

7. 鏡檢計數

稀釋平板菌落計數

平板接種培養有混合平板培養法和涂抹平板培養法兩種方法.

⑴混合平板培養法

將無菌平板編上10-7,10-8,10-9,每一設置三個重復,用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10-9稀釋液各1mL放入編號10-9的3個平板中,同法吸取10-8稀釋液各1mL放入編號1×10-8的3個平板中,再吸取1×10-7稀釋液各1mL放入編號1×10-7的3個平板中,由低濃度向高濃度時,吸管可不必更換.然后在9個平板中分別倒入已熔化并冷卻至45～50℃的細菌培養基(圖5-2),輕輕轉動平板,使菌液與培養基混合均勻,冷凝后倒置,在30℃下培養.至菌落長出后即可計數.

⑵涂抹平板計數法

涂抹平板計數法與混合法根本一樣,所不同的是先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中,待凝固后編號,然后用無菌吸管吸取0.1mL菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上,每個編號設三個重復.再用無菌刮鏟將菌液在平板上涂抹均勻(圖24-3),每個稀釋度用一個滅菌刮鏟,更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌.在由低濃度向高濃度涂抹時,也可以不

更換刮鏟.將涂抹好的平板平放于桌上20～30min,使菌液滲透入培養基,然后將平板倒轉,保溫培養,至菌落長出后即可計數.

計算結果時,常按以下標準從接種后的3個稀釋度中選擇一個適宜的稀釋度,求出每克菌劑中的含菌數.

(1)同一稀釋度各個重復的菌數相差不太懸殊.

(2)細菌,放線菌,酵母菌以每皿30～300個菌落為宜,霉菌以每皿10～100個菌落為宜.

選擇好計數的稀釋度后,即可統計在平板上長出的菌落數,統計結果按下式計算.

混合平板計數法:

每g樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×稀釋倍數

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涂抹平板計數法:

每g樣品的菌數=同一稀釋度幾次重復的菌落平均數×10×稀釋倍數

盡管使用不同的培養基，但細菌、放線菌和真菌都可能在同一個培養基上生長，所以必須用顯微鏡做進一步的觀察。明顯有菌絲的一般是真菌，真菌的菌絲為絲狀分枝，比擬粗大；而放線菌菌絲呈放射狀，比擬細。細菌有球狀和桿狀，有些細菌也形成細小的菌絲。酵母菌的菌落與細菌的菌落很相似，但在顯微鏡下容易分辨。酵母菌個體比擬大，一般有圓形、橢圓形、卵形、檸檬形或黃瓜形，有些還有瘤狀的芽。

在兩級稀釋度中，選細菌和放線菌的菌落數為30～200個、真菌菌落數為20～40個的培養皿各5個，取其平均值計算出每組的菌落數。如果菌落很多，可將其分成2～4等份進展計數。微生物生物量可以通過微生物細胞個體大小和密度計算得到。

8.計算

土壤微生物數量〔cfu·g-1〕=MD/W

式中M為菌落平均數：D為稀釋倍數；W為土壤烘干質量〔g〕。

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背景知識：

微生物

微生物(microorganism簡稱microbe是包括細菌、病毒、真菌以及一些小型的原生動物、顯微藻類等在的一大類生物群體，它個體微小，卻與人類生活關系密切。涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及安康、食品、醫藥、工農業、環保等諸多領域。

微生物的定義

現代定義：微生物是一切肉眼看不見貨看不清的微小生物的總稱。

形體微小，構造簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物，統稱為微生物。 〔但有些微生物是可以看見的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。〕

1

特點： 個體微小,一般<0.1mm。構造簡單,有單細胞的,簡單多細胞的,非細胞的。進化地位低。

2

分類： 原核類:

三菌,三體。三菌：細菌、藍細菌、放線菌 三體：支原體、衣原體、立克次氏體。真核類:

真菌,原生動物,顯微藻類。非細胞類:

病毒,亞病毒(

類病毒,擬病毒,朊病毒)。

3

五大共性：體積小,面積大； 吸收多,轉化快 ；生長旺,繁殖快；適應強,易變異； 分布廣,種類多

微生物的類群

種類

原核：細菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體。

真核：真菌、藻類、原生動物。

非細胞類：病毒和亞病毒。

一般地，在中國大陸地區的教科書中，均將微生物劃分為以下8大類：

細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體。

1

細菌:(1)定義:一類細胞細短,構造簡單,胞壁堅韌,多以二分裂方式繁殖和水生性強的原核生物

(2)分布:溫暖,潮濕和富含有機質的地方

(3)構造:主要是單細胞的原核生物,有球形,桿形,螺旋形

根本構造：細胞膜 細胞壁 細胞質 核質。特殊構造：莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞

(4)繁殖:

主要以二分裂方式進展繁殖的

(5)菌落:

單個細菌用肉眼是看不見的,當單個或少數細菌在固體培養基啊行大量繁殖時,便會形成一個肉眼可見的,具有一定形態構造的子細胞群落.

菌落是菌種鑒定的重要依據.不同種類的細菌菌落的大小,形狀光澤度顏色硬度透明度都不同.

2

放線菌

(1)定義:一類主要成菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強的原核生物

(2)分布:含水量較低,有機物較豐富的,呈微堿性的土壤中

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(3)形態構造:主要由菌絲組成,包括基菌絲和氣生菌絲(局部氣生菌絲可以成熟分化為孢子絲,產生孢子)

(4)繁殖:通過形成無性孢子的形式進展無性繁殖

(5)菌落:在固體培養基上:枯燥,不透明,外表呈致密的絲絨狀,彩色干粉

真菌

真菌〔Fungus〕是一種真核生物。最常見的真菌是各類蕈類，另外真菌也包括霉菌和酵母。現在已經發現了七萬多種真菌，估計只是所有存在的一小半。大多真菌原先被分入動物或植物，現在成為自己的界，分為四門

真菌通常又分為三類，即酵母菌、霉菌和蕈菌〔大型真菌〕，它們歸屬于不同的亞門。

真菌的細胞既不含葉綠體，也沒有質體，是典型異養生物。它們從動物、植物的活體、死體和它們的排泄物，以及斷枝、落葉和土壤腐殖質中、來吸收和分解其中的有機物，作為自己的營養。真菌的異養方式有寄生和腐生。

真菌常為絲狀和多細胞的有機體，其營養體除大型菌外，分化很小。高等大型菌有定型的子實體。除少數例外，真菌都有明顯的細胞壁，通常不能運動，以孢子的方式進展繁殖。真菌菌落：大小：大。形狀：絨毛狀，絮狀，蛛網狀。顏色：五顏六色〔孢子的顏色〕

真菌：念球菌、粘菌等。

細菌的菌落特征與繁殖

細菌在固體培養基上分裂繁殖時，許多細胞堆集在一起，形成肉眼可見的群體稱為菌落。不同種類的細菌其菌落形態互不一樣，表現在大小、形狀、邊緣、隆起、光澤、質地和顏色等方面。細菌菌落大小不一，小的不到1毫米，大的可以鋪滿整個培養皿；菌落形狀有圓形、不規那么形、卷發狀、假根狀等；菌落的隆起形狀有擴展、臺狀、低凸、乳頭狀等；有的菌落有光澤、有的沒有；有的菌落較粘，有的那么較脆；菌落一般呈灰色，少數為白色、黃色、紅色、綠色和棕色等。大小：小。形狀：光滑，粘稠或粗糙枯燥。顏色：多為白色。

細菌一般進展無性繁殖，表現為細胞的橫分裂，稱為裂殖。裂殖結果形成兩個大小一樣的子細胞。在最適宜的條件下，20～30分鐘就能分裂1次，并可繼續分裂假設干次。當繼續分裂時，常因養料供給缺乏或溫度變化以及其它種種原因而停頓分裂或死亡。

放線菌的菌落特征與繁殖

放線菌的菌落質地致密，外表呈嚴密的絨狀，或堅實、枯燥而多皺。由于基菌絲長在培養基，所以菌落與培養基結合較緊，不容易被挑起，或者被挑起后不容易破碎。當孢子絲形成大量孢子布滿菌落外表時，使菌落呈絮狀、粉末狀或顆粒狀，而與細菌菌落判然有別。此外，如用放大鏡仔細觀察，可以看見菌落周圍有放射狀菌絲。

放線菌主要通過形成無性孢子的方式進展繁殖。其孢子絲成熟時，分化形成許多孢子，稱為分生孢子。分生孢子常具色素，呈白、灰、黃、橙黃、紅、藍、綠等顏色。

孢子絲形成孢子的方式有凝聚分裂和橫隔分裂兩種。大多數放線菌按凝聚分裂方式形成孢子，其過程是在孢子絲從頂端到基部，細胞質分段圍繞核質，逐漸凝聚成一串大小相似的小段，然后每一小段外面產生新的孢子壁而形成孢子，最后孢子絲壁破裂，將孢子釋放出來。少數放線菌按橫隔分裂方式形成孢子，其過程

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是在孢子絲產生許多距離均等的橫隔，然后在橫隔處斷裂形成孢子。另外有些放線菌可在菌絲上形成孢子囊，在孢子囊形成孢囊孢子，但這樣的種類很少。

土壤稀釋液的配制：

懸液制備

準確稱取待測土樣品10g,放入裝有90mL無菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中,用手或置搖床上振蕩20min,使微生物細胞分散,靜置20～30s,即成10-1稀釋液;

再用1mL無菌吸管,吸取10-1稀釋液1mL,移入裝有9mL無菌水的試管中,吹吸3次,讓菌液混合均勻,即成10-2稀釋液;

再換一支無菌吸管,吸取10-2稀釋液1mL,移入裝有9mL無菌水的試管中,也吹吸3次,即成10-3稀釋液;

以此類推,連續稀釋,制成10-4,10-5,10-6,10-7,10-8,10-9，10-10等一系列稀釋菌液

考前須知：

1、 培養基提前一天倒入培養皿，室溫存放一天，另培養基說明枯燥。

2、 做無菌水接種對照，檢測污染情況。

3、 吸取10-6，10-8和10-10稀釋液100ul，均勻涂布。

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