硫酸銨分級沉淀

2024年3月15日發(fā)(作者：fun的比較級)

一， 基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質(zhì)。用此方法可以將主要的

免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用方法。高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可

與蛋白質(zhì)競爭水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀

出來。各種蛋白質(zhì)的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質(zhì)。這

種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不

易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。

二， 試劑及儀器

1 . 組織培養(yǎng)上清液、血清樣品或腹水等

2. 硫酸銨（ NH 4 ） SO 4

3. 飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

4. 蒸餾水

5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 )

6. 透析袋

7. 超速離心機(jī)

8. pH 計(jì)

9. 磁力攪拌器

三， 操作步驟

以腹水或組織培養(yǎng)上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各種不同的免疫球蛋白鹽析

所需硫酸 銨的飽和度也不完全相同。通常用來分離抗體的硫酸銨飽和度為 33% —

50% 。

（一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊攪拌邊慢慢加到 1 升 蒸餾水中。用氨水或硫酸

調(diào)到硫酸pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同飽和度銨溶液的配制

（二）沉淀

1.樣品（如腹水） 20 000 ′ g 離心 30 min ，除去細(xì)胞碎片；

2.保留上清液并測量體積；

3.邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中，終濃度為 1 ： 1 （

4.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時(shí)或攪拌過夜（ 4 ° C ），使蛋白質(zhì)充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白質(zhì)溶液 10 000 ′ g 離心 30 min （ 4 ° C ）。棄上清保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀溶解后放入透析袋對

PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時(shí)（ 4 ° C ），每隔 3-6 小時(shí)換透析緩沖液一次，

以徹底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測定上清液中蛋白質(zhì)含量。

四，應(yīng)用提示

（一） 先用較低濃度的硫酸氨預(yù)沉淀，除去樣品中的雜蛋白。

1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中，使?jié)舛葹?0.5:1 (v/v) ；

2.將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時(shí) 或過夜（ 4 ° C ）；3.3000 ′ g 離心 30 min

（ 4 ° C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀

溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透

析，除去硫酸氨；

5.雜蛋白與欲純化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時(shí)，用預(yù)沉淀除雜蛋白是非常

有效

（二）為避免體積過大，可用固體硫酸氨進(jìn)行鹽析（硫酸氨用量參考表 1 ）；硫酸氨

沉淀法與層析 技術(shù)結(jié)合使用，可得到更進(jìn)一步純化的抗體。

今天作的實(shí)驗(yàn)是利用硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，從之前作過的經(jīng)驗(yàn)知道，這一個(gè)步驟是有名

的煩，要慢慢用敲的把硫酸銨緩緩的加入蛋白質(zhì)溶液中。

相關(guān)的原理可以在莊榮輝學(xué)習(xí)網(wǎng)站中找到，與鹽溶剛好相反，在蛋白質(zhì)溶液中加入硫

酸銨，會使得蛋白質(zhì)的溶解度下降，因而沉淀出來。因?yàn)榱蛩徜@所解離的離子容很大，所

帶的電子數(shù)也多(NH4+, SO42-)，因此當(dāng)其溶入水中時(shí)，會吸引大量水分子與這些離子水

合。

蛋白質(zhì)分子表面多少有一些較不具極性的區(qū)域，水分子會在這些非極性區(qū)的表面聚集，

形成類似『水籠』的構(gòu)造(請見下圖)，以便把蛋白質(zhì)溶入水中。一旦蛋白質(zhì)溶液加入硫酸

銨，后者吸引了大量水分子，使水籠無法有效隔離蛋白質(zhì)的非極性區(qū)，造成這些非極性區(qū)

之間的吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的非極性區(qū)域，就越容易用硫酸

銨沉淀下來。

在計(jì)算所添加的硫酸銨的重量方面，找到了一個(gè)不錯(cuò)的網(wǎng)站——硫酸銨計(jì)算機(jī)

這個(gè)網(wǎng)頁上可以靠著輸入實(shí)驗(yàn)溫度、溶液體積、想要到達(dá)的百分濃度以及初始的百分

濃度這四個(gè)數(shù)值，就可以得到需要添加的硫酸銨克數(shù)，以及在加入固體硫酸銨后所增加的

體積，算是一個(gè)很不錯(cuò)的網(wǎng)站。

此外另一個(gè)比較值得提的，是我有用兩種方式加入硫酸銨，第一種是固體的硫酸銨模

碎加入，另一種是將硫酸銨溶成飽和溶液再加入，各有各的優(yōu)缺點(diǎn)，比較如下：

1.造成蛋白質(zhì)變質(zhì)的程度：固體的硫酸銨>硫酸銨飽和溶液

利用硫酸銨飽和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成變質(zhì)(沒試過用倒入的)。

不像固體的硫酸銨只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白質(zhì)就壞了(溶液有致密的白色氣泡產(chǎn)

生)。

2.操作的容易度： 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

固體硫酸銨最大的缺點(diǎn)就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以當(dāng)你要溶解

的蛋白質(zhì)很多時(shí)，這是很累的步驟。然而硫酸銨飽和溶液比較麻煩只有在配制部分，要先

加熱讓它飽合后，回到操作溫度讓它過飽和，最后用濾紙把硫酸銨結(jié)晶去掉。

3.蛋白質(zhì)溶液的體積放大程度 硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

這是使用硫酸銨飽和溶液最頭痛的部分，舉例來說，要讓100 ml的硫酸銨百分比從

0%到25%， 如果是加入固體的硫酸銨，只會讓溶液從100 ml變成107 ml左右，但若

是加入硫酸銨飽和溶液，會讓溶液變成125 ml！而且若是要提高到50%，須加等量的硫

酸銨飽和溶液，所以會讓蛋白質(zhì)溶液從100 ml變成200 ml。

因此在加入硫酸銨時(shí)，若是低百分濃度可以利用硫酸銨飽和溶液，然而如果是高百分

濃度的，除非不在意蛋白質(zhì)溶液體積的放大(反正都要離心離下來)，否則還是用固體硫酸

銨來的好。

所以今天從0%拉到25%及從25%拉到50%時(shí)，都是利用硫酸銨飽和溶液，但是當(dāng)要

從50%拉到75%時(shí)，我選擇利用固體硫酸銨，因?yàn)槿绻昧蛩徜@飽和溶液， 離心機(jī)無法

離那么多的溶液體積。