二維核磁共振譜在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用_李波

2024年3月28日發(fā)(作者：寫人的)

2005　Vol.17　No.4

天然產(chǎn)物研究與開發(fā)　

NATURALPRODUCTRESEARCHANDDEVELOPMENT　

523

二維核磁共振譜在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用

李　波

1,2＊

,陳海華,許時嬰

22

(1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院,新鄉(xiāng)453003;2.江南大學(xué)食品學(xué)院,無錫214036)

摘　要:二維核磁共振譜(2DNMR)是獲取多糖結(jié)構(gòu)信息,尤其是在多糖序列分析方面的有力工具。本文重點介

紹了在多糖結(jié)構(gòu)解析中常用的幾種2DNMR譜以及2DNMR解析多糖結(jié)構(gòu)的方法。

關(guān)鍵詞:核磁共振;二維核磁共振;多糖;結(jié)構(gòu)

中圖分類號:O65　　　

ApplicationofTwoDimensionNuclearMagneticResonanceintheStructural

DeterminationofPolysaccharide

LIBo

1,2＊

,CHENHai-hua

2

,XUShi-ying

2

(hool,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China;

ofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)

Abstract:Twodimensionnuclearmagneticresonance(2DNMR)isapowerfultoolacquiringstructuralinformationofpolysac-

charide,l2DNMRspectraoftenudinpolysaccharidestructural

analysisandthemethodforstudyingpolysaccharidestructureusing2DNMRareintroducedinthispaper.

Keywords:nuclearmagneticresonance;2DNMR;polysaccharide;structure

　　近年來,多糖類化合物由于具有多方面的功能

性質(zhì),因而成為研究領(lǐng)域的一個熱點,多糖的結(jié)構(gòu)及

其構(gòu)效關(guān)系也越來越引起人們的重視。

經(jīng)典的分析方法如高碘酸氧化、Smith降解和甲

基化分析等,對簡單多糖的結(jié)構(gòu)還能解析,但對復(fù)雜

的多糖則有些力不從心。尤其是對于糖基之間的連

接序列,往往只能依靠推測,缺乏確鑿的證據(jù)。核磁

共振(NMR)方法引入多糖結(jié)構(gòu)的研究后,大大推動

了這一領(lǐng)域的發(fā)展。早期NMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)

中糖苷鍵的構(gòu)型以及重復(fù)結(jié)構(gòu)中單糖的數(shù)目,隨著

NMR技術(shù)的發(fā)展,尤其是二維核磁共振(2DNMR)

的出現(xiàn)和發(fā)展,NMR逐漸成為獲得多糖結(jié)構(gòu)信息最

有力的工具。NMR具有不破壞樣品的優(yōu)點,因而在

獲取多糖的結(jié)構(gòu)信息后,所用的樣品可以通過除去

溶劑而回收。

目前,國內(nèi)有關(guān)2DNMR研究多糖結(jié)構(gòu)的文獻

很少

[1,2]

針對性

。面對種類繁多的2DNMR,初學(xué)者往往

感到無從下手,而且限于條件,也不可能每種2D

NMR都去做一做。事實上,不同的2DNMR譜,它

所提供的信息是不同的。對于多糖,一般只需測定

其中的幾種2DNMR譜,就能獲得必要的結(jié)構(gòu)信息。

下面介紹2DNMR在多糖結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。

[3-6]

1　NMR的準(zhǔn)備工作

1.1　單糖組成和甲基化分析

　　對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖,尤其是結(jié)構(gòu)未知的多糖,

直接采用NMR分析結(jié)構(gòu)難度很大,也不可取,因而

在NMR分析之前最好做一些基礎(chǔ)性的工作,主要是

單糖組成的測定和甲基化分析。而且,這些前期的

分析結(jié)果越準(zhǔn)確越有助于對NMR結(jié)果的解析。

1.2　樣品的制備

　　通常,多糖的分子量越大,NMR譜圖中峰的重

疊越嚴(yán)重,也就越難解析,如果多糖的分子量超過2

萬,則有可能得不到十分清晰的圖譜。當(dāng)然,這也與

多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度有關(guān),不能一概而論。因此,對

,相關(guān)介紹2DNMR的書籍又缺乏對多糖的

　　收稿日期:2004-04-06　　　接受日期:2004-05-12

　＊通訊作者Tel:86-373-3040977;E-mail:libowuxi@

524

天然產(chǎn)物研究與開發(fā)　　　　　　　　　　　　　　　　2005　Vol.17　No.4

于分子量很大而結(jié)構(gòu)又比較復(fù)雜的多糖,最好將多

糖進行部分酸水解后再進行NMR分析。

多糖的分子量大,樣品濃度最好超過30mg/

mL,而且濃度越大,越有利于測定

[7]

。但是,樣品溶

解后的粘度不能太大,要有一定的流動性,以使各部

分的磁場均勻。樣品管底部少量的沉淀不影響分

析,關(guān)鍵是磁場掃描范圍內(nèi)的溶液要均勻一致。

測定多糖的溶劑一般是重水(D

2

O)。國外有報

道先用D

2

O將樣品冷凍干燥3次(或減壓蒸發(fā)3

次),以充分替換出樣品中原有的H

2

O,再進行NMR

測試。但若將固體樣品直接溶于D

2

O后進行NMR

測試,一般也能得到比較滿意的結(jié)果。內(nèi)標(biāo)通常用

TMS和DSS,也可以用甲醇、丙酮等來定標(biāo),但要注

意所加入的溶劑不能破壞多糖的溶解性。

[8,9]

3)確定硫酸基的取代位置

[11]

。硫酸酯多糖中硫酸

基的取代位置對多糖的生理功能有重要影響,若用

紅外光譜法來判定硫酸基的位置并不可靠

,

13

CNMR可有效地解決這一問題。糖環(huán)上某一位置

的碳若發(fā)生硫酸基的取代,則其化學(xué)位移向低場移

動6～9ppm。因此,通過比較硫酸酯多糖脫硫前后

的

13

CNMR譜,就可以確定硫酸基在糖環(huán)上的取代位

置。4)確定某些糖類。例如,δ170～176范圍內(nèi)的

低場信號表明存在己糖醛酸的羧基或乙酰氨基,δ

16～18范圍內(nèi)的高場信號表明有6位脫氧糖的甲

基存在。5)確定異頭碳的構(gòu)型。多數(shù)β型異頭碳的

化學(xué)位移高于α型約2～3ppm,因而可對H譜的分

析結(jié)果進一步確證。但此規(guī)律不適用于甘露糖和鼠

李糖,因為它們的α與β化學(xué)位移幾乎在同一位置。

[12]

2　1DNMR在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

1

2.1　HNMR

1

HNMR主要解決多糖結(jié)構(gòu)中糖苷鍵構(gòu)型的問

3　2DNMR在多糖結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

　　以上

13

CNMR的應(yīng)用大多建立在對多糖

13

13

CNMR譜的全歸屬基礎(chǔ)之上,而2DNMR對于多糖

題。通常α型糖苷的異頭質(zhì)子超過δ5.0,β型一般

小于δ5.0。此外,耦合常數(shù)

3

J

1,2

對解析異頭質(zhì)子的

構(gòu)型也有幫助。如果異頭質(zhì)子同時滿足化學(xué)位移小

于5.0且

3

J

1,2

大于6,則認(rèn)為是β型。反之,若化學(xué)

位移大于5.0且J

1,2

小于4,則認(rèn)為是α型。J

1,2

的

計算方法是譜峰的分裂間距(ppm)乘以儀器的工作

頻率。

此外,異頭質(zhì)子(H1)和6位脫氧糖的甲基(H6)

信號的線寬和積分可用于區(qū)別糖單元的類型及其相

對含量。

2.2　CNMR

13

CNMR的化學(xué)位移范圍較寬,而且通常采用

全去耦法,每一種化學(xué)等價的碳原子只有一條譜線,

因而譜圖的分辨率好,譜線很少重疊。

13

13

33

CNMR譜的全歸屬起著至關(guān)重要的作用。下面重

點介紹幾種在多糖結(jié)構(gòu)研究中比較常用的2DNMR

譜。

3.1　同核位移相關(guān)譜

3.1.1　COSY(化學(xué)位移相關(guān)譜,

1

H,

1

HChemicalShift

CorrelationSpectroscopy)

COSY能夠提供糖環(huán)中相鄰氫核之間的耦合關(guān)

系。COSY譜中,每個交叉峰反映了相鄰氫核之間的

耦合關(guān)系。交叉峰的強度與其有關(guān)的

3

J值密切相

關(guān),

3

J值大,交叉峰的強度就大,反之亦然。

由于異頭質(zhì)子易于確認(rèn),所以一般從異頭質(zhì)子

的對角線峰出發(fā),首先找到H1/H2的交叉峰,通過

劃線即可找出H2的對角線峰。再由H2的對角線

峰出發(fā),依次找出H3～H6的對角線峰和化學(xué)位移。

3.1.2　COSY-45(β-COSY)

COSY的脈沖序列由兩個90°的脈沖組成。如果

減小第二個脈沖的寬度,使其傾倒角減小,則會對交

叉峰及對角線峰的精細(xì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。在COSY-45

中,第二個脈沖角度是45°。與COSY相比,COSY-45

減少了平行躍遷間的磁化轉(zhuǎn)移強度,限制了多重峰

的間接躍遷,對角線峰則因自身的自相關(guān)峰消失而

簡化。因此,COSY-45譜中的對角線峰沿對角線變

窄,減少了對鄰近的交叉峰的干擾,有利于復(fù)雜分子

的密集峰群的解析。另外,從COSY-45還可判別耦

合常數(shù)的符號。對于多糖,推薦采用COSY-45譜。

CNMR在多糖結(jié)構(gòu)研究中的作用如下:1)確

定糖殘基的數(shù)目和相對含量。異頭碳的共振信號出

現(xiàn)在δ90～110,由于所有異頭碳的共振是非等價的

且很少重疊,因而可根據(jù)這一范圍內(nèi)峰的個數(shù)來確

定糖殘基的數(shù)目,還可根據(jù)峰的相對高度來估算糖

殘基的相對比例。2)確定糖鏈的連接位置。糖環(huán)上

某個位置的碳如發(fā)生取代,則其化學(xué)位移向低場移

動6～7ppm。如α-Glc的C4的化學(xué)位移是δ70.6,

C4被取代后化學(xué)位移變?yōu)棣?8.1。因此,如果糖殘

基的各個碳都得以歸屬,就可以通過與已知單糖的

碳的化學(xué)位移進行比較

[7,10]

,確定糖鏈的連接位置。

2005　Vol.17　No.4李　波等:二維核磁共振譜在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用　

525

3.1.3　DQF-COSY(雙量子濾波COSY,DoubleQuan-

tumFilteredCOSY)

就自旋體系的識別而言,DQF-COSY所能提供

的信息與COSY毫無二致。DQF-COSY的優(yōu)點在于

它抑制了強峰和溶劑峰,而且由于對角線峰和交叉

峰均為吸收型,所以分辨率較高。然而,DQF-COSY

的靈敏度比同等條件下的COSY低。

3.1.4　TQF-COSY(三量子濾波COSY)

TQF-COSY只能顯示至少三個以上兩兩耦合的

自旋之間的交叉峰。對于糖環(huán)而言,滿足這一條件

的質(zhì)子一般只有H5和H6(6位通常有兩個質(zhì)子),

而在COSY譜中出現(xiàn)的其它譜峰均被“洗白”。因

此,TQF-COSY可以作為COSY譜的一個補充,用于

識別H5和H6。

在很多情況下,單靠COSY并不能完成多糖中

各個糖環(huán)質(zhì)子的識別。這種不完全的識別往往是由

于缺乏質(zhì)子間的交叉峰連接

。交叉峰的缺失可能

是由于以下原因造成的:1)也是最常見的原因,是兩

個化學(xué)位移很接近而相互間的耦合又較強的兩個質(zhì)

子的交叉峰很容易掩埋在對角線峰中;2)兩個質(zhì)子

間的耦合太弱,因而所形成的交叉峰強度太小,難于

觀測;3)由于譜峰相互重疊,有的交叉峰可能根本無

法識別。總之,還有必要做其它的一些實驗作為補

充才能完成譜峰的識別。

3.1.5　TOCSY(全相關(guān)譜,TotalCorrelationSpectroscopy)

COSY給出的是相鄰氫核間的相關(guān)峰,而TOC-

SY給出的是同一自旋體系中所有氫核間的相關(guān)峰,

包括長程耦合和短程耦合。從任一譜峰出發(fā),可以

找到好幾個相關(guān)峰,它們與該氫核處于同一自旋體

系,如H1/H2,H1/H3,H1/H4等,因而可能克服一些

COSY譜中由于譜峰重疊造成的困難。TOCSY可以

作為COSY譜的補充和驗證。

3.1.6　NOESY(NuclearOverhaurEffectSpectroscopy)

NOESY的外觀與COSY相似,其差別在于交叉

峰表示的不是耦合關(guān)系,而是NOE關(guān)系。通常間距

小于5 的兩個質(zhì)子,在譜上會出現(xiàn)交叉峰,且空間

距離越近,NOE作用越強。對于多糖,NOESY可作

為COSY的補充來識別譜峰,也可用來確定糖殘基

間的連接方式。

3.2　碳?xì)湎嚓P(guān)譜

3.2.1　HSQC(異核單量子相干,HeteronuclearSingle-

qauntumCoherence)

HSQC反映的是直接相連的H、C核之間的耦

113

[4]

1

合關(guān)系(J

CH

),它的作用相應(yīng)于H,C-COSY。在用

H,HCOSY等將糖單元的氫核的化學(xué)位移進行歸屬

后,通過HSQC,就可將碳核的化學(xué)位移進行歸屬。

此外,如果某些氫核的譜峰由于重疊無法識別,可以

根據(jù)已識別的δH由HSQC推出相應(yīng)的δC,然后再

根據(jù)

13

CNMR譜的峰形和峰高,結(jié)合甲基化分析的

結(jié)果,對未知的δH進行反推。

3.2.2　HMBC(異核多鍵相關(guān),HeteronuclearMultiple-

bondCorrelation)

HMBC把H核與長程耦合的C核關(guān)聯(lián)起來,其

作用相應(yīng)于長程H,C-COSY,它能提供分子骨架的

結(jié)構(gòu)信息。對于多糖,HMBC可作為一種序列分析

的工具給出糖單元間的連接次序。例如,一種多糖

由A、B、C三種糖單元組成,在HMBC譜中,出現(xiàn)A-

H1/B-C2、B-H1/C-C3、C-H1/A-C4的相關(guān)峰,則可以

推定多糖有如下的結(jié)構(gòu)單元:-4A1-2B1-3C1-4A1-。

由此可見,HMBC在多糖結(jié)構(gòu)研究中是一個非常有

用的工具,它解決了糖殘基連接序列的問題,這是以

前的分析手段(包括1DNMR)難以做到的,這也正

是2DNMR的魅力所在。

3.3　2DNMR的解析思路

　　對于多糖的結(jié)構(gòu)分析,必做的2DNMR譜為

COSY-45(或DQF-COSY)、HSQC和HMBC。若條件允

許,TQF-COSY、TOCSY和NOESY也可做一做,以幫

助識別氫核。用2DNMR分析多糖結(jié)構(gòu)的思路如

下:1)首先由碳譜確定異頭碳的數(shù)目。因為碳譜是

全去耦譜,一般一條譜線對應(yīng)一種化學(xué)等價的碳原

子,而氫譜有耦合峰,異頭質(zhì)子的數(shù)目不易確定,且

有些異頭質(zhì)子峰還可能被溶劑峰所掩蓋;2)由異頭

碳的位移,在HSQC譜中找出異頭質(zhì)子;3)從異頭質(zhì)

子出發(fā),在COSY-45(或DQF-COSY)譜中,找出其它

氫核的化學(xué)位移。若不能完成識別,可結(jié)合TQF-

COSY、TOCSY、NOESY等幫助識別;4)由氫核的位

移,在HSQC譜中找出碳的位移。對于個別無法識

別的碳,可借助甲基化分析的結(jié)果進行推測;5)完成

了氫和碳的歸屬后,在HMBC譜中找出與某一個糖

單元的異頭質(zhì)子和異頭碳相關(guān)的另一個糖單元的碳

和氫,從而推出糖單元的連接次序;6)在得到多糖的

初步結(jié)構(gòu)后,最好與甲基化分析的結(jié)果進行對照,看

是否有大的出入,這樣可以避免2DNMR譜中一些

噪音峰和雜質(zhì)峰所帶來的干擾。

下面舉一個例子。筆者在對羊棲菜褐藻糖膠的

113

526

天然產(chǎn)物研究與開發(fā)　　　　　　　　　　　　　　　　2005　Vol.17　No.4

從異頭質(zhì)子出發(fā),在COSY-45譜(圖2)中,可找出其

它氫核的化學(xué)位移。氫和碳的歸屬完成后,在HM-

BC譜(圖3)中可找到B1/D2、C1/A4、C1/D2和D1/

C4(在HMBC譜的其它區(qū)域,圖3未顯示)的相關(guān)峰,

由此就能推出糖單元A、B、C、D、E之間的連接次序。

綜上所述,2DNMR在多糖結(jié)構(gòu)研究中可以發(fā)揮

重要的作用。雖然目前一些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大的多

糖用2DNMR還不能完全解決問題,但相信隨著NMR

技術(shù)的不斷發(fā)展,更多的多糖結(jié)構(gòu)將會被解開。

參考文獻

圖1　羊棲菜褐藻糖膠DSJL的HSQC譜

Fig.1　HSQCspectrumofDSJL

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圖2　羊棲菜褐藻糖膠DSJL的COSY45譜

Fig.2　COSY45spectrumofDSJL

圖3　羊棲菜褐藻糖膠DSJL的HMBC譜

Fig.3　HMBCspectrumofDSJL

結(jié)構(gòu)進行研究時,由于褐藻糖膠的分子量較大且組

成復(fù)雜,因此將其部分酸水解后再用2DNMR進行

分析。部分酸水解產(chǎn)物稱為DSJL,其分子量約為1

萬,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖組成,NMR

儀的工作頻率為400MHz。首先由碳譜確定異頭碳

A、B、C、D、E,再從HSQC譜(圖1)中找出異頭質(zhì)子。