黃芪甲苷調控線粒體自噬減輕5-Fu誘導老齡大鼠心肌毒性的實驗研究_百

2024年3月31日發(作者：貼春聯作文)

378

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

實驗研究

黃芪甲苷調控線粒體自噬減輕5-Fu誘導老齡大鼠

心肌毒性的實驗研究

252

李沅洋

1，

，周湘忠

3

，雷向紅

4

，張宇凡

2，

，徐月

1，

，魏麗萍

2△

摘要：目的探索黃芪甲苷（AS-Ⅳ）通過PINK1/Parkin信號通路調控自噬減輕5-氟尿嘧啶（5-Fu）誘導老齡大鼠

18月齡雄性SD大鼠36只，按隨機數字表法分為對照組、模型組、AS-Ⅳ組，每組12心肌毒性的療效及機制。方法

只。以5-Fu注射液30mg/kg，腹腔注射，隔日1次，連續7次建立模型組；AS-Ⅳ稀釋液，20mg/kg，灌胃，每日1次，連

續14次，建立AS-Ⅳ組。檢測血清肌鈣蛋白（IcTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌線粒體腺苷三磷酸（ATP）及膜

電位水平、行HE及Masson染色觀察心肌病理改變、免疫熒光染色檢測微管相關蛋白LC3Ⅱ表達、電鏡觀察線粒體結

構并采用Westernblot檢測PINK1/Parkin通路關鍵分子PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、LC3蛋白表達。結果與模型

組相比，AS-Ⅳ可減緩大鼠體質量下降，降低心肌cTnI及CK-MB水平，抑制線粒體ATP水平下降（P＜0.05）。與對照

組相比，模型組心肌纖維排列紊亂，膠原纖維沉積，膠原容積百分比升高；經AS-Ⅳ干預后，膠原容積百分比減低

（P＜0.05）。電鏡及LC3Ⅱ熒光染色顯示，經AS-Ⅳ干預后，線粒體損傷程度減輕，LC3Ⅱ表達量減低（P＜0.05）。

Westernblot結果提示AS-Ⅳ苷干預后Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ表達較模型組降低（P＜0.05）。結

論5-Fu可誘導心肌線粒體損傷，線粒體自噬過度，AS-Ⅳ可通過調節自噬減輕5-Fu心肌毒性。

關鍵詞：氟尿嘧啶；黃芪甙；線粒體；自噬；衰老；心臟毒性；黃芪甲苷；PINK1/Parkin信號通路

中圖分類號：R73-361文獻標志碼：ADOI：10.11958/20202229

TheexperimentalstudyonastragalosideⅣregulatingmitochondrialautophagytoreduce

myocardialtoxicityinducedby5-Fuinagingrats

1GraduateSchoolofTianjinUniversityofTraditionalChineMedicine,Tianjin300193,China;2DepartmentofCardiology,

TianjinUnionMedicalCenter;3DepartmentofCardiology,TianjinBinhaiNewAreaDagangHospital;4Departmentof

Ultrasound,TianjinUnionMedicalCenter;5GraduateSchoolofTianjinMedicalUniversity

△

LIYuan-yang

1,2

,ZHOUXiang-zhong

3

,LEIXiang-hong

4

,ZHANGYu-fan

2,5

,XUYue

1,2

,WEILi-ping

2△

CorrespondingAuthorE-mail:*******************

reduce5-fluorouracil(5-Fu)inducedmyocardialtoxicitybadonPINK1/s

Thirty-sixmaleSDratsaged18monthsweredividedintocontrolgroup,modelgroupandAS-Ⅳgroupbyrandomnumber

erventiongroupwasadministeredtheintragastrical20mg/kgAS-Ⅳdiluenteverydayfor

umlevelsoftroponinI(cTnI),creatinekinaisoenzyme(CK-MB),myocardialmitochondrialATPand

Theexpressionofmicrotubule-associatedprotein(LC3Ⅱ)rastructureof

PINK1,Parkin,Beclin1,LAMPandLC3)s

tablemethod,modelwasadministeredtheintraperitonealinjectionof30mg/kg5-Fu

assonstainingwereudtoevaluatethepathologicalchangesofmyocardium.

teinexpressionsofPINK1/Parkinpathway(keymolecules

andinhibitthedecreaofmitochondrialATPlevels(P＜0.05).Comparedwithcontrolgroup,themyocardialfiberswere

Comparedwiththemodelgroup,

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectandmechanismofastragalosideⅣ(AS-Ⅳ)regulatingautophagyto

AS-Ⅳcouldslowdowntheweightloss(P＜0.05),reducethecretionofmyocardialenzymecTnIandCK-MB(P＜0.05)

disorderlyarrangedheinterventionof

基金項目：天津濱海新區衛生健康委員會科技重點支持項目（2019BWKZ004）；京津冀基礎研究合作專項（19JCZDC63900）

AS-Ⅳ,thecollagenvolumefractiondecreadinthemodelgroup(P＜0.05).ElectronmicroscopyandLC3Ⅱfluorescence

作者單位：1天津中醫藥大學研究生院（郵編3000193）；2天津市人民醫院心臟內科；3天津濱海新區大港醫院心臟內科；4天津市人民醫院

超聲科；5天津醫科大學研究生院

作者簡介：李沅洋（1988），女，碩士，住院醫師，主要從事抗代謝類化療藥物心臟毒性方面研究。E-mail：**********************

△

通信作者E-mail：*******************

天津醫藥2021年4月第49卷第4期

379

labelingshowedthatafterAS-Ⅳintervention,thedegreeofmitochondrialdamagewasreducedandtheexpressionofLC3Ⅱ

wasdecread(P＜0.05).WesternblotresultsindicatedthatBeclin1,PINK1,Parkin,LAMPandLC3Ⅱ/Ⅰexpression

levelsweresignificantlyreduced(P＜0.05).Conclusion

cardiacmitochondrialautophagy,andAS-Ⅳalleviatesitbyregulatingautophagy5-Fumyocardialtoxicity.

The5-Fuinducesmyocardialmitochondrialinjuryandexcessive

Keywords:fluorouracil;Astragalin;mitochondria;autophagy;aging;cardiotoxicity;astragalosideⅣ;PINK1/Parkin

signalingpathway

療藥物，

5-氟尿嘧啶

臨床應用廣泛，

（5-fluorouocil

尤其對于無法耐受手術需藥

，5-Fu）是抗代謝類化

物化療的老齡患者意義重大。然而，5-Fu發揮抗腫

瘤效應的同時存在多器官不良反應，其中腫瘤相關

心血管疾病報道尤為多見

［1-2］

。5-Fu用于老齡尤其

是伴有心血管基礎疾病的患者時心臟毒性發生率更

高，程度更重

［3］

。因此，應重視化療藥物心臟毒性的

防治。黃芪甲苷（AstragalosideⅣ，AS-Ⅳ）是黃芪的

主要活性成分，可通過清除氧自由基、抗脂質過氧化

等途徑參與心肌細胞的保護

［4］

。本研究擬在老齡鼠

模型中評價AS-Ⅳ對5-Fu誘導心肌毒性的保護作

用，從調控線粒體自噬穩態角度初探其分子機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組18月齡（老齡）雄性SD大鼠36只，平

均體質量（600±50）g，購自北京維通利華實驗動物技術公司，

動物許可證號：SCXK（京）2019-0006。將大鼠依次編號，應

用隨機數字表法進行分組，分為對照組、模型組和AS-Ⅳ組，

每組12只。所有大鼠飼養于天津市人民醫院恒溫動物實驗

中心，自由進食水。經預實驗后以5-Fu注射液30mg/kg，隔

日1次，腹腔注射，連續7次，構建5-Fu心臟毒性模型，對照

組等方式等劑量給與0.9%氯化鈉注射液；AS-Ⅳ組在造模基

礎上以AS-Ⅳ稀釋液20mg/kg，每日1次，灌胃，連續14次。

本實驗經天津市人民醫院倫理委員會批準（2020-B03）。

1.2主要儀器和試劑氟尿嘧啶注射液（20mg/支，天津金

耀氨基酸有限公司，批準文號H12020959），大鼠血清心肌肌

鈣蛋白（IcTnI）及肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶聯免疫吸附測

定（ELISA）試劑盒（武漢Elabscience有限公司），線粒體腺苷

三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）及膜電位檢測試劑盒

Group

陽萬類生物有限公司）

公司），Beclin1、Parkin

，兔源

，LC3

、

LC3Ⅱ一抗（美國Proteintech

一抗及辣根過氧化物酶標記的

PINK1、LAMP、COX-Ⅳ一抗（沈

山羊抗兔二抗IgG（美國CellSignalingTechnology公司）。多

功能酶標儀（美國Bio-Rad公司），光學顯微鏡、熒光顯微鏡

日本Nikon公司），透射電鏡（日本日立公司），凝膠成像分析

系統（美國Bio-Rad公司）。AS-Ⅳ購自MedChemExpress，純

度為98.0%，實驗藥物用量參照產品在體實驗推薦劑量。按

照

20

大鼠總用量取AS-Ⅳ粉劑，溶于10%

下以

mmol/L

0.9%氯化鈉注射液稀釋成

母液于-4℃保存，用時取出適量母液在超聲助溶

DMSO中配制為

10mmol/L。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠一般情況觀察各組大鼠自給藥前1d起至第15

天，連續監測體質量，依據體質量給予相應劑量藥物，最終以

給藥第0、3、6、9、12、15天體質量值作為統計數據。同時觀察

給藥期間各組大鼠毛色、精神狀態、納食、二便等情況。于實

驗第15天處死取材。至實驗結束，模型組死亡3只，AS-Ⅳ組

死亡1只。

1.3.2

30

血清cTnI及CK-MB檢測腹主動脈取血，室溫靜置

采用

min

ELISA

，離心（

法檢測大鼠血清

4℃，1000×g，15

（OD

CK-MB

min），收集血清。每組取

）值，繪制標準曲線，

、cTnI含量。酶標儀在

6只，

指標含量。

450nm波長處測量光密度計算樣本

1.3.3線粒體ATP檢測取新鮮心肌組織20mg，加入裂解

液，勻漿低溫離心（4℃，12000×g，5min）取上清，將ATP標準

溶液稀釋成不同濃度制備標準曲線，配制ATP檢測工作液，

將

5min

100

消

μL

除

ATP

ATP

檢測工作液加入不透光

本底后加入待檢樣品

96

，采

孔板內，

用化學

室溫靜置

（luminometer）測定RLU值。取少量上清用BCA法檢測蛋白

發光儀

濃度，最終ATP值需轉換為μmol/g蛋白形式進行定量。該指

標需以新鮮組織、低溫環境下提取線粒體，以保證細胞存活

及線粒體呼吸代謝相關酶的活性，對時間效率要求較高。因

此實驗中調整樣本量（n=5），達到取材與線粒體提取同時進

行，縮短耗時以減少誤差。

1.3.4膜電位檢測取新鮮心肌組織20mg，冰上勻漿提取

線粒體，按試劑盒配制JC-1緩沖液，將碳酰氰基-對-氯苯腙

（CCCP）稀釋成10μmol/L，制備陽性對照，于不透光96孔板

中加入JC-1檢測工作液及樣本，充分混勻后采用熒光顯微

鏡檢測JC-1單體及聚合體激發光與發射光熒光值。以膜電

位聚合體與單體紅/綠熒光比值（R/G）為最終結果。該指標

同樣需以新鮮組織、低溫環境下提取線粒體，除需保證細胞

存活及線粒體膜完整性外，JC-1工作液染色后也需立即觀

察，以減少熒光淬滅。該指標與線粒體ATP檢測同時進行，

每組取5只。

1.3.5

48h，脫水包埋組織，

組織病理學分析

切片（

取左心室組織固定于

4μm），并行蘇木精-

4%

伊紅

多聚甲醛

色及

（HE）染

Image

Masson染色。樣品于光學顯微鏡下觀察、攝片。采用

積百分比

J軟件進行心肌纖維化程度相對定量分析，

（collagenvolumefraction，CVF%）=陽性藍染面積

心肌膠原容

/組

織總面積×100%。因5-Fu所誘導的心臟毒性以心肌收縮力

下降為主

［5-6］

，左心室結構及功能為評估心臟受損的良好指

標，同時為使組織充分固定，避免裂片及染色不均，故選取左

心室進行病理（HE、Masson、LC3Ⅱ）及電鏡觀察。因模型組

（上海碧云天有限公司）

（

380

死亡3只，每組取4只進行觀察分析。

1.3.6電鏡觀察線粒體超微結構取新鮮左心室心肌組織

切成體積＜1mm

3

的組織塊，于2.5%戊二醛固定液中固定24h，

沖洗后，于1%鋨酸固定液固定2h，梯度乙醇脫水，環氧樹脂

包埋后超薄切片機切片，超薄切片經枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重

染色后，嵌入環氧樹脂。樣品于透射電鏡下觀察、攝片。

1.3.7LC3Ⅱ免疫熒光染色檢測心肌石蠟切片常規脫蠟、

脫水，

8

10%

min

一

60

抗

山羊血清室溫封閉

煮沸，

置于加入檸檬酸修復液

保溫數分鐘后中小火

（pH=6.0）的修復盒中，中火

修復完畢后復溫

30

、洗

min

滌

。加入

7min

；滴加二

LC3Ⅱ

。自然冷卻后洗滌。

一抗，4℃過夜。

封片后熒光顯微鏡下觀察、

min。洗滌后滴加DAPI，室溫避光染核

抗，

攝片。采用Image

5

室

min

溫

J軟件進行陽

，

避

PBS

光

沖洗。

孵育

性標記計數。

1.3.8蛋白質免疫印跡分析取新鮮心肌組織勻漿提取線

粒體蛋白，BCA法定量、SDS-PAGE電泳分離、轉膜，4℃過夜

孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX-Ⅳ抗體（稀釋度均

為1∶500）及LC3抗體（稀釋度為1∶1000），次日洗膜后以辣

根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（稀釋度為1∶1000）繼

續孵育90min。掃描膠片，采用ImageJ軟件進行相對定量分

析，各目的蛋白以COX-Ⅳ（內參蛋白）進行校正。

1.4統計學方法采用SPSS23.0對數據進行統計分析。符

合正態分布計量資料采用

x±s

表示，各組間比較采用單因素

方差分析，結合Tukey's檢驗進行多重比較，非正態分布數據

采用非參數檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1大鼠一般情況對照組大鼠飲食活動情況良

好，體質量保持穩定狀態。模型組出現活動力差，納

差，并伴有不同程度的腹瀉癥狀，自給藥第6天起體

質量下降。經AS-Ⅳ干預后，大鼠精神狀態及攝食

情況優于模型組，體質量下降幅度較小。實驗過程

各組大鼠體質量變化趨勢，見圖1。

900

750

量

（

g

）

600

質

體

鼠

450

大

300

150

對照組

模型組

0

0

AS-Ⅳ

3

組

691215

時間（d）

各時間點組間比較：F

12.861

＊＊

，F

0d

＝0.122，F

3d

12d

=31.490

＊＊

，F

15d

=19.404

＊＊

=1.602

，

＊

P＜

，

0.05

F

6d

=4.464

＊

，F

，

＊＊

P＜0.01

9d

；

=

a

與對照組比較，

Fig.1

b

與模型組比較，P＜0.05

Changes

圖1各組大鼠體質量變化

ofratbodyweightineachgroup

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

2.23組大鼠心肌酶變化與對照組相比，模型組

血

AS-Ⅳ

清cTnI及CK-MB水平明顯升高（P＜0.05），而

0.05

組上述心肌酶指標較模型組顯著降低（P＜

Tab.

），

1

見表

Comparison

1。

ofCK-MBandcTnIlevelsbetween

threegroups

表1各組大鼠血清CK-MB及cTnI水平比較

（ng/L，

x±s

）

組別

n

對照組

模型組

644.71±6.56

cTnI

26.20±7.49

CK-MB

AS-Ⅳ組

6

6

147.45±33.64

a

ab

143.18±38.74

a

＊

F

109.84±29.03

P＜0.01；

與對照組比較，

b

與模型組比較，

20.535

＊

77.78±27.24

ab

a

P＜0.05

13.456

＊

2.33組大鼠心肌線粒體功能損傷情況與對照組

相比，模型組線粒體ATP水平及膜電位均明顯下降

P＜0.05）。與模型組相比，AS-Ⅳ組ATP水平顯著

升高（P＜0.05），膜電位R/G比值2組間差異無統計

學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2ComparisonofMMPandATPlevelsbetween

threegroups

表2各組大鼠心肌組織線粒體膜電位及ATP水平比較

（x±s）

組別

n

對照組

ATP

膜電位（R/G）

模型組

50.88±0.18

（μmol/g）

1.97±0.44

AS-Ⅳ

F

組

5

5

0.36±0.05

a

0.64±0.15

ab

0.95±0.34

a

13.062

＊＊

1.50±0.33

5.610

＊

＊

P＜0.05，

＊＊

P＜0.01；

a

與對照組比較，

b

與模型組比較，P＜0.05

2.43組大鼠心肌纖維化變化HE染色結果：對照

組心肌纖維排列整齊，未見特異性病理改變；模型組

心肌細胞排列欠規則，心肌纖維略顯粗大，部分細胞

核深染濃集；AS-Ⅳ組心肌纖維排列欠規則，但并無

明顯特異性病理改變。Masson染色結果：對照組心

肌間質纖維可見少量藍染區域，呈輕微纖維化表現；

模型組心肌纖維增粗，間隔增大，可見較多間質藍染

區，纖維化程度較重；AS-Ⅳ組心肌間質仍可見纖維

化，但程度較模型組減低，見圖2。與對照組膠原容

積

1.84%

百分

0.87%

）升

比（

高

3.53%±0.88%

，與模型

）相比，模型組（16.74%±

2.53

）

組大鼠心肌線粒體結構及功能變化

明顯減低（F=40.331

組相

，

比

P＜

，

0.05

AS-

）

Ⅳ

。

組（10.18%±

對照組

心肌細胞質膜完整，肌絲排列整齊，線粒體結構正

常，線粒體嵴排列致密，可見單個自噬小體；模型組

表現為線粒體稀疏，核周間隙擴張，線粒體部分腫

脹、固縮，形態不均，并可見較多脂滴沉積及自噬小

（

天津醫藥2021年4月第49卷第4期

381

照組LC3Ⅱ表達量（84.00±7.55）相比，模型組

（167.75±14.01）升高，與模型組相比，AS-Ⅳ組LC3Ⅱ

表達量（120.05±16.09）則減低（F=35.321，P＜0.05），

見圖4。

體，線粒體結構破壞較為嚴重；AS-Ⅳ組顯示線粒體

排列欠規則，線粒體出現腫脹，但形態及結構大致正

常，其間可見單個散在自噬泡，見圖3。

2.63組大鼠心肌組織LC3Ⅱ表達水平比較與對

HE染色（×200）

Masson染色（×100）

Fig.2

對照組模型組AS-Ⅳ組

Thepathologicalmorphologyofmyocardialtissuesunderlightmicroscopebebweenthethreegroups

圖23組大鼠心肌組織光鏡下病理形態變化

×10000

×20000

Fig.3

對照組模型組AS-Ⅳ組

Thepathologicalmorphologyofmyocardialmitochondriaunderelectronmicroscopebebweenthethreegroups

圖33組大鼠電鏡下心肌線粒體形態變化

對照組模型組AS-Ⅳ組

Fig.4TheproteinexpressionlevelsofLC3Ⅱinmyocardialtissues(×400)

圖43組大鼠心肌組織LC3Ⅱ免疫熒光標記染色（×400）

382

2.73組大鼠心肌線粒體自噬PINK1/Parkin信號通

路

Beclin1

相關

表

、

蛋

PINK1

白表

、

達水平與對照組相比，模型組

（

Parkin

達量

P＜0.05

、LC3Ⅱ/Ⅰ

升高（P

Parkin

＜

），見圖5

及

0.05

、LAMP及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相對

、表

LAMP

），AS-

3。

表達量則較模型組減低

Ⅳ組Beclin1、PINK1、

Beclin1

ABC

60ku

PINK1

54ku

Parkin

49ku

COX-Ⅳ

19ku

LAMP

ABC

45ku

LC3Ⅰ

LC3Ⅱ

16

14

ku

ku

COX-Ⅳ

19ku

Fig.5Theproteins

A：對照組；

expressions

B：模型組；

ofPINK1/Parkin

C：AS-Ⅳ組

圖5大鼠心肌組織

myocardial

PINK1/Parkin

tissues

pathwayin

通路相關蛋白表達情況

Tab.3Comparisonoftheproteinexpressionof

PINK1/Parkinpathwayinmyocardialtissues

betweenthreegroups

表3大鼠心肌組織PINK1/Parkin通路相關蛋白表達比較

（n=4，

x

±s）

組別

對照組

模型組

0.73±0.12

Beclin1

1.01±0.66

PINK1

AS-Ⅳ

F

組

1.54±0.13

a

1.26±0.21

ab

1.54±0.20

a

33.365

＊＊

1.19±0.13

b

7.774

＊

組別

對照組

模型組

0.77±0.27

ParkinLAMPLC3Ⅱ/Ⅰ

1.62±0.09

a

0.61±0.09

1.21±0.12

a

1.09±0.18

1.43±0.95

a

AS-Ⅳ

F

組1.06±0.11

babb

8.949

＊

0.91±0.13

22.935

＊＊

1.16±0.10

5.309

＊

＊＊

P＜0.05，

＊

P＜0.01；

a

與對照組比較，

b

與模型組比較，P＜0.05

3討論

在關注高齡患者化療藥物心臟毒性損傷的同時，

5-Fu用于化療時存在潛在且嚴重的心臟毒性，

需

更加關注其心臟毒性的預防及治療。

粒體損傷是一種機制假說。藥理機制研究指出

5-Fu引起心臟毒性的發病機制是多方面的，線

5-

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

Fu

粒體，

體內代謝產物氟

阻斷三羧酸循環，

-檸檬酸

減少

（

ATP

F-Cltrate

產生，

）可作用于線

改變線粒體

膜通透性，從而導致線粒體功能異常

［7］

。線粒體損

傷導致有缺陷的細胞器逐漸積累，由此線粒體自噬

被啟動

［8］

。自噬是一種程序化的細胞內降解過程，

平衡的自噬可滿足代謝需要、細胞器更新及維持細

胞穩態

［9］

。自噬的激活通常被認為具有心臟保護

性，而過度的自噬導致細胞死亡和心肌受損

［10-11］

。

的線粒體自噬信號通路，

PINK1/Parkin信號通路是已知的研究較為深入

其參與多種心血管系統疾

病的發生發展

［12-13］

。Kubli等

［14］

證實沉默PINK1基

因后心肌細胞中線粒體功能受損，氧化應激水平增

高，進而引起心力衰竭。Givvimani等

［15］

在小鼠升主

動脈縮窄誘導的心力衰竭模型中也發現抑制線粒體

自噬后可明顯減少升主動脈縮窄引起的心肌纖維

化。因此，自噬的動態變化對心血管疾病具有不同

的意義，即維持平衡狀態的自噬有益于心肌保護，但

線粒體自噬過度則可能加重心肌損傷。本研究大鼠

在經5-Fu刺激后線粒體自噬PINK1/Parkin信號通

路相關蛋白Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ

比值升高，提示線粒體自噬參與了5-Fu誘導的心肌

損傷，且線粒體可呈現自噬過度狀態。

黃芪是經典的多效中藥之一，臨床用于冠心病、

心絞痛的治療且已取得顯著療效

［16］

。AS-Ⅳ是黃芪

的主要成分之一，研究表明AS-Ⅳ通過激活一氧化

氮

cGMP/PKG

合成酶（

GSK-3）失活，

信號通路，

NOS）產生

抑制線粒體通透性轉換孔

進一步使糖原合成酶激酶

一氧化氮（NO），從而激活

（mPTP）

-3

開

放，發揮心肌線粒體保護作用

［17］

；同時AS-Ⅳ能夠下

調心肌組織磷酸化縫隙連接蛋白

Caspa-3

肌細胞凋亡

表達水平，

［18］

。

上調Bcl-2的表達，

3（P-Cx3

從而抑制心

）以及

基于以上研究基礎，筆者參照Li等

［19-20］

干預方

式以觀察AS-Ⅳ對化療藥物心臟損傷的保護作用。

本研究發現，

AS-Ⅳ

在5-Fu誘導的心臟毒性模型中給予

食及精神狀態；

干預能改善大鼠的一般狀況，

此外，組織病理學檢測以及心肌酶學

包括體質量、攝

檢測結果均表明AS-Ⅳ可減輕心肌細胞損傷、減緩

心肌組織纖維化進展，并能改善心肌細胞線粒體質

量，從而緩解化療藥物對心肌的損傷。

線粒體質量控制是維持細胞正常活動的關鍵，

線粒體自噬過程對于質量控制至關重要

［21］

。研究表

明AS-Ⅳ通過PINK1/Parkin信號通路參與多種心血

管疾病的預防及治療

［22-23］

。黃莉等

［24］

以心肌缺血再

灌注模型觀察AS-Ⅳ對細胞自噬及心肌組織損傷的

（

天津醫藥2021年4月第49卷第4期

影響，結果表明AS-Ⅳ能夠降低Beclin1的表達，抑

制自噬從而保護心肌。為進一步探索AS-Ⅳ參與調

節線粒體自噬的分子機制，本研究對PINK1/Parkin

信號通路蛋白表達進行定量，結果表明AS-Ⅳ可降

低Beclin1和LAMP蛋白表達。LAMP為溶酶體膜蛋

白，可用于監測自噬體與溶酶體融合狀態，AS-Ⅳ干

預后LAMP蛋白表達水平降低，提示線粒體自噬通

量下降，

Parkin

心肌線粒體數量與質量的內穩態。

通路過度激活，

表明AS-Ⅳ可通過抑制線粒體自噬

調控自噬穩定狀態，從而維持

PINK1/

綜上，AS-Ⅳ可減輕5-Fu誘導心肌損傷，其機制

可能是AS-Ⅳ通過調節線粒體自噬穩態，改善線粒

體質量，從而發揮心肌細胞保護作用。本研究在動

物實驗基礎上初步探索了AS-Ⅳ在預防及改善5-Fu

誘導心肌毒性中的作用與機制，為腫瘤患者尤其是

老齡患者臨床化療安全性提供了新的干預策略及研

究方向。

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384

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

實驗研究

CD137-CD137L信號通路通過活化TNF受體相關因子6

促進小鼠動脈粥樣硬化斑塊內血管新生

翁嘉懿

1

，殷云杰

2

，馬雪興

1

，李淵

1

，陳璐

1

，何洪濤

1

，徐桂冬

1△

，孫康云

1

摘要：目的

管新生。方法

探討CD137-CD137L信號通路是否通過活化TNF受體相關因子6（TRAF6）促進粥樣硬化斑塊內血

將小鼠內皮細胞（bEnd.3）和小鼠主動脈環分別分為對照組（培養基中加入10μg/LTNF-α）、IgG同型

對照組（培養基中加入10μg/LTNF-α+5mg/LIgG2b）和CD137刺激組（培養基中加入10μg/LTNF-α+5mg/LCD137

抗體）。利用轉染小干擾RNA（siRNA）技術抑制內皮細胞和主動脈環TRAF6基因表達，將內皮細胞和主動脈環分別

分為對照siRNA組（轉染對照siRNA）和TRAF6siRNA組（轉染TRAF6siRNA）。分別采用Westernblot和實時熒光定

量PCR（qPCR）檢測內皮細胞和主動脈環TRAF6、血管內皮生長因子（VEGF）、Smad1/5蛋白和mRNA的表達；采用

新生實驗檢測主動脈環新生微血管形成能力。結果

Transwell遷移實驗檢測內皮細胞的遷移能力；內皮細胞管腔形成實驗檢測內皮細胞的管腔形成能力；主動脈環血管

mRNA表達水平均高于對照組和IgG同型對照組（均P＜0.05）。與對照siRNA組比較，TRAF6siRNA組內皮細胞和主

低，主動脈環新生微血管數量減少（均P＜0.05）。結論

樣硬化斑塊內血管新生。

關鍵詞：抗原，CD137；動脈粥樣硬化；TNF受體相關因子6；Smad1蛋白質；Smad5蛋白質；血管新生

中圖分類號：R541.4文獻標志碼：ADOI：10.11958/20202041

CD137-CD137L信號通路可能通過TRAF6促進小鼠動脈粥

CD137刺激組內皮細胞和主動脈環TRAF6、VEGF蛋白和

動脈環TRAF6、Smad1/5蛋白和mRNA表達水平明顯降低，內皮細胞遷移數量減少，內皮細胞小管長度和分支數量降

CD137-CD137Lsignalingpromotesangiogenesisinatherosclerosisplaqueofmicethrough

activatingTNFreceptorassociatedfactor6

1DepartmentofCardiovascularDias,SuzhouHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Suzhou215000,China;

2DepartmentofCardiovascularDias,YixingPeople'sHospital

△

WENGJia-yi

1

,YINYun-jie

2

,MAXue-xing

1

,LIYuan

1

,CHENLu

1

,HEHong-tao

1

,XUGui-dong

1△

,SUNKang-yun

1

CorrespondingAuthorE-mail:******************

atherosclerosisplaqueviaactivatingTNFreceptorassociatedfactor6(TRAF6).Methods

Abstract:ObjectiveToexplorewhetherCD137-CD137Lsignalingpathwaycanpromoteangiogenesisin

theaorticringsfrommalemiceweredividedintothefollowinggroups:controlgroup(with10μg/LTNF-αinculture

medium),IgGisotypecontrolgroup(with10μg/LTNF-α+5mg/LIgG2binculturemedium)andCD137activatedgroup

基金項目：蘇州市“科教興衛”青年科技項目（KJXW2017040）；蘇州市科技局項目（sys2018088）

作者單位：1南京醫科大學附屬蘇州醫院心血管內科（郵編215000）；2宜興市人民醫院心血管內科

作者簡介：翁嘉懿（1991），女，碩士，主治醫師，主要從事動脈粥樣硬化發病機制及治療研究。E-mail：********************

△

Endothelialcells(bEnd.3)and

通信作者E-mail：******************

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