氮唑類(lèi)抗真菌藥物靶酶CYP51的研究進(jìn)展

2024年4月1日發(fā)(作者：橙)

氮唑類(lèi)抗真菌藥物靶酶CYP51的研究進(jìn)展

李冉;張大志

【摘 要】氮唑類(lèi)藥物是臨床上應(yīng)用最廣、種類(lèi)最多的廣譜高效抗真菌藥物,其作用

靶點(diǎn)為真菌甾醇合成過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶

(CYP51).CYP51由CYP51基因(同名ERG11)表達(dá).一方面,真菌CYP51是跨膜蛋白,

難以純化獲得其準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)信息,成為藥物研發(fā)的瓶頸之一;另一方面,CYP51變異

是公認(rèn)的真菌耐藥的主要原因之一,研究其結(jié)構(gòu)變化對(duì)于抗真菌耐藥具有重要意義.

因此,筆者對(duì)近年來(lái)CYP51的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述.%Triazoles are the most widely

ud antifungal drugs in clinic with broad spectrum and high

efficacy,which targets sterol 14α-demethyla (CYP51),an enzyme

expresd by the gene EGR11,which is a key enzyme in the fungi ergos-

terol the one hand,the CYP51 belongs to a

transmembrane is difficult to get the exact functional structure

conformation which becomes a big challenge for the development of new

the other hand,it becomes con-nsus that EGR11 exon mutation

cau CYP51 structural change is one of the major reasons for antifungal

drugs resistance. Therefore,study of the structural changes toward the

antifungal drug resistance is quite review authors have

summarized the rearch progress on CYP51 over the recent years.

【期刊名稱(chēng)】《藥學(xué)實(shí)踐雜志》

【年(卷),期】2016(034)002

【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P106-109)

【關(guān)鍵詞】CYP51靶酶;三維結(jié)構(gòu);動(dòng)力學(xué);突變;耐藥

【作 者】李冉;張大志

【作者單位】第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室,上海200433;第二軍醫(yī)大學(xué)藥

學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室,上海200433

【正文語(yǔ)種】中 文

【中圖分類(lèi)】R978.5

羊毛甾醇14-α去甲基酶（sterol 14α-demethyla，P45014DM，CYP51）是

麥角甾醇生物合成路徑中必不可少的酶［1］，其主要功能是催化羊毛甾醇14-α

位的甲基離去。唑類(lèi)化合物能選擇性地抑制真菌的CPY51，為常用的抗真菌藥物

［2］。但由于CYP51是疏水性很強(qiáng)的膜蛋白，藥物與靶酶的構(gòu)效關(guān)系研究難以

形成清晰明確的結(jié)論［3］，阻礙了新型抗真菌化合物的設(shè)計(jì)和發(fā)展。另外，

CYP51也參與了部分耐藥機(jī)制，它的變異是真菌耐藥問(wèn)題的主要原因之一。近些

年來(lái)已有研究者對(duì)致病性真菌不同種屬類(lèi)的CYP51的三維結(jié)構(gòu)、活性位點(diǎn)以及與

唑類(lèi)的結(jié)合進(jìn)行了較為深入的研究，分析了靶酶的相關(guān)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，與耐藥有關(guān)的

基因突變的報(bào)道也在不斷增加。

目前，不同相關(guān)菌屬的CY P51基因已經(jīng)得到克隆和鑒定。對(duì)基因序列的識(shí)別和對(duì)

比有利于了解不同種類(lèi)的CY P51在基因水平的聯(lián)系。一般而言，序列一致性低于

40%的基因視為不同的家族，一致性高于55%的基因歸為一個(gè)亞家族，因此，不

同的亞家族基因的一致性應(yīng)在40%～55%之間。整個(gè)生物界CY P51的序列相似

性降低至23%～34%，同一物種CY P51多個(gè)拷貝間的序列相似性程度為中等，

真菌間的相似性相對(duì)低很多，一般把一致性在30%左右的就可以歸為同一家族，

可見(jiàn)真菌的CYP51酶的基因序列差異較大［4］。這種基因序列的低一致性與生

物功能的高度單一性反差較大，使得對(duì)CY P51催化反應(yīng)的單一性和反應(yīng)機(jī)制的研

究愈加困難，頗具挑戰(zhàn)性。

不同CYP51氨基酸序列的一致性是同源模建的基礎(chǔ)。雖然真菌中圍繞卟啉-Fe的

氨基酸序列的一致性相對(duì)較高，但總體而言，種間的一致性、相似性不高［5］。

新近報(bào)道的首個(gè)真菌類(lèi)CYP51晶體（釀酒酵母的RsCYP51）結(jié)構(gòu)中［6］，其氨

基酸序列與白念珠菌、新生隱球菌、煙曲霉等致病真菌的CYP51相比較，絕對(duì)保

守的為24%，相近的僅為25%。

2.1 三維模型的構(gòu)建與分子對(duì)接 早期張萬(wàn)年等［7］首次根據(jù)原核生物 P450s

（P450BM3、P450cam、P450terp和P450eryF）已知的共晶結(jié)構(gòu)來(lái)構(gòu)建白念

珠菌的CYP51與底物24（28）-亞甲基-24，25-二氫羊毛甾醇復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)，

同時(shí)鑒定了與底物任意一原子相距0.8 nm以?xún)?nèi)的活性位點(diǎn)氨基酸殘基，這些氨基

酸殘基有助于更好地理解酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。底物與CYP51的分子對(duì)接研究

［8］表明，底物固定在活性位點(diǎn)主要是通過(guò)疏水作用力和氫鍵相互作用。另外

14個(gè)唑類(lèi)化合物的活性構(gòu)象也分別對(duì)接到白念珠菌CYP51的唑類(lèi)結(jié)合位點(diǎn)，研究

發(fā)現(xiàn)這14個(gè)唑類(lèi)化合物在結(jié)合位點(diǎn)都有相似的對(duì)接模式。抑制劑的鹵代苯環(huán)和氨

基酸殘基Y132之間可能有π-π疊加相互作用。伊曲康唑和酮康唑較長(zhǎng)側(cè)鏈會(huì)穿

過(guò)結(jié)合位點(diǎn)和底物入口通道的殘基相互作用。

隨著同源建模技術(shù)的發(fā)展，白念珠菌、煙曲霉菌和新生隱球菌CYP51酶的三維模

型依次被構(gòu)建出來(lái)［5，8］，用于研究與底物的結(jié)合模式和與唑類(lèi)抑制劑的相互

作用，以及鄰近突變對(duì)酶與抑制劑結(jié)合的影響。研究發(fā)現(xiàn)，疏水作用和氫鍵在底物

識(shí)別和定向方面起重要作用。白念珠菌和煙曲霉菌的CYP51酶的模型雖然有相似

的核心結(jié)構(gòu)，但它們的活性位點(diǎn)明顯不同。對(duì)白念珠菌和煙曲霉菌CYP51的結(jié)合

位點(diǎn)與唑類(lèi)化合物分子對(duì)接研究表明［8］，泊沙康唑較長(zhǎng)的側(cè)鏈能占據(jù)CYP51

的一個(gè)特定通道。通道內(nèi)相應(yīng)的氨基酸殘基能為唑類(lèi)化合物對(duì)特定點(diǎn)突變耐藥菌株

的活性數(shù)據(jù)［8］提供解釋和支持。結(jié)果表明，這種額外的相互作用有利于穩(wěn)定其

與CYP51突變體的結(jié)合，而氟康唑（FCZ）和伏立康唑并沒(méi)有這種性質(zhì)。同時(shí)表

明，這些能特異影響泊沙康唑活性點(diǎn)的突變，是通過(guò)干預(yù)泊沙康唑側(cè)鏈與受體的結(jié)

合而起作用的。

2.2 重組體的表達(dá)及動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 白念珠菌屬羊毛甾醇14-α去甲基酶（CaCYP51）與唑類(lèi)結(jié)合的性質(zhì) 2010

年，Warrilow等［9］首次在大腸桿菌中表達(dá)出了野生型的CaCYP51，并初步闡

述了突變體I 471T CaCYP51的性質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在氧化條件下，純化的

CaCYP51與唑類(lèi)的親和力是相似的，解離常數(shù)Kd值在10～26 nM（除了FCZ

的Kd值為47 nM）。伏立康唑與CaCYP51的親和力高于FCZ，歸因于伏立康唑

脂肪碳上多出來(lái)的甲基增強(qiáng)了與芳香氨基酸的疏水相互作用，但是，克霉唑和伊曲

康唑與CaCYP51相似的親和力表明化合物側(cè)鏈并不是決定與靶酶親和力的決定性

因素。在CO置換實(shí)驗(yàn)中，CaCYP51與伊曲康唑的親和力是FCZ的7倍，與在氧

化條件的2倍相比，這一差距表明唑類(lèi)的側(cè)鏈對(duì)結(jié)合力有著決定性作用。突變體

I471T CaCYP51也在該實(shí)驗(yàn)中得到了初步的表征，并表明FCZ的耐藥是源自對(duì)底

物親和力的增強(qiáng)和對(duì)唑類(lèi)化合物結(jié)合力減弱的雙重影響。其后，人類(lèi)同源的 14-α

去甲基酶 HsCYP51和Δ60HsCYP51得到表達(dá)和純化［10］，以探索唑類(lèi)藥物和

農(nóng)業(yè)中的抗真菌藥對(duì)它們的選擇性。

2.2.2 煙曲霉菌羊毛甾醇 14-α去甲基酶（CYP51B）的結(jié)構(gòu)與功能研究 不同于人

類(lèi)和其他脊椎動(dòng)物，煙曲霉菌有2個(gè)CY P51基因［11，12］，所表達(dá)的酶分別

是CYP51A和CYP51B，兩者氨基酸序列的相似度為59%。盡管2個(gè)基因在煙曲

霉菌中都有活性，但是研究指出CY P51B基因編碼的酶主要負(fù)責(zé)羊毛甾醇的去甲

基化。2個(gè)基因的出現(xiàn)或許成為解釋煙曲霉菌高度耐藥的原因。2015年，

Hargrove等［13］首次表達(dá)純化并鑒定了煙曲霉菌的CYP51B，研究發(fā)現(xiàn)它催化

天然底物齒孔醇和植物的CYP51底物鈍葉醇去甲基化的催化常數(shù)Kcat值分別為

（45±3）和（52±3）／min，對(duì)羊毛甾醇并沒(méi)有活性。咪康唑在測(cè)定過(guò)程中對(duì)酶

的抑制活性最強(qiáng)。與伏立康唑復(fù)合物的X-射線結(jié)構(gòu)表明，煙曲霉菌的CYP51B與

其他同源的CYP51有較高的整體相似性，但具有在其他門(mén)系所沒(méi)有的特點(diǎn)，進(jìn)而

為小分子伏立康唑?qū)η咕行峁┝私忉尅?

隨著唑類(lèi)藥物的長(zhǎng)期大量使用，真菌的耐藥情況日益嚴(yán)重。已知的臨床致病真菌對(duì)

唑類(lèi)化合物耐藥的機(jī)制主要分為4類(lèi)：①CYP51的點(diǎn)突變致使其與唑類(lèi)藥物的親

和力降低；②靶酶基因的上調(diào)導(dǎo)致CYP51的過(guò)度表達(dá)；③轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的過(guò)度表達(dá)致

使唑類(lèi)藥物的流出增加；④在耐藥的白念珠菌屬中發(fā)現(xiàn)的ERG3的突變。其中，

影響唑類(lèi)結(jié)合的CYP51的突變體通常在耐藥菌株中發(fā)現(xiàn)［14，15］，并得到了廣

泛的研究。研究CYP51的突變及對(duì)唑類(lèi)結(jié)合的影響，有利于設(shè)計(jì)抗耐藥真菌的藥

物。

3.1 白念珠菌 目前，已有140多種不同的CYP51氨基酸替換見(jiàn)諸文獻(xiàn)報(bào)道，但是

大約只有一半僅存在于對(duì)唑類(lèi)藥物敏感力弱的菌株中（表1）［16］。雖然臨床

上菌株含有的氨基酸替換通常不止一個(gè)，但替換的位點(diǎn)大部分都位于3個(gè)區(qū)域

［17］：氨基酸殘基105-165、266-287和405-488。一些點(diǎn)突變體已在大腸桿

菌中被表達(dá)出來(lái)，用于研究氨基酸替換對(duì)CYP51的活性和對(duì)藥物敏感性的影響、

突變體與唑類(lèi)的結(jié)合位點(diǎn)及動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。其中包括Y132H［18］、F145L［19］、

I471T［20］和S279F［21］。另外，一些突變體如G464S［22］、R467K［23］

和T315A在啤酒酵母菌中被表達(dá)，可用于對(duì)唑類(lèi)耐藥的研究［24］。

3.2 煙曲霉菌 與白念珠菌不同，煙曲霉的耐藥機(jī)制僅與CYP51變異有關(guān)［25］，

其CYP51酶有2種同源蛋白CYP51A和CYP51B。但研究表明，大部分耐藥的煙

曲霉菌株通常只含有CYP51A的單個(gè)突變體［26］。煙曲霉菌在臨床上與耐藥有

關(guān)的CYP51的氨基酸取代（表1）雖然少于白念珠菌屬，但也有30多種［27，

28］，其中最常見(jiàn)的氨基酸替換有 G54、L98、G138和M220［27］。從臨床上

耐藥的菌株中發(fā)現(xiàn)，氨基酸G54和M220有不同的取代。部分煙曲霉菌CYP51

的突變體也在啤酒酵母菌中表達(dá)。通過(guò)活性研究發(fā)現(xiàn)，G54的突變能?chē)?yán)重影響菌

株對(duì)伊曲康唑和泊沙康唑的敏感性，但對(duì)伏立康唑的活性影響不大［28］。對(duì)于

M220的突變，M220K 和M220T能降低菌株對(duì)所有藥物的敏感性，M220I能特

異地影響伊曲康唑，M220V能影響伊曲康唑和泊沙康唑。有分析表明，在同一位

置的不同取代能特異地影響藥物與靶標(biāo)的相互作用。

3.3 新生隱球菌 目前只在臨床菌株中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)介導(dǎo)耐藥的新生隱球菌CYP51的

氨基酸取代，G484S［29］和Y145F［30］（表1）。G484S能引起新生隱球菌

對(duì)FCZ的耐藥［29］，Y145F能使真菌對(duì)FCZ和伏立康唑耐藥，但能增強(qiáng)真菌對(duì)

伊曲康唑和泊沙康唑的敏感性［30］。

利用同源模建構(gòu)建致病性真菌CYP51酶的三維結(jié)構(gòu)，并通過(guò)分子對(duì)接研究有利于

更好地了解靶酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，同時(shí)也有利于為新型抗真菌藥物的研發(fā)建立高

通量的篩選體系。但不同種的CY P51基因序列的一致性普遍較低，表明同源模建

的CYP51用于藥物設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確度并不高。利用基因克隆與表達(dá)技術(shù)，純化得到相

應(yīng)的靶酶重組體，為酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)提供了更準(zhǔn)確和更可靠的信息。另外，

CYP51突變與耐藥的關(guān)系能為設(shè)計(jì)抗真菌耐藥的藥物提供基礎(chǔ)。目前還需要利用

現(xiàn)有的先進(jìn)技術(shù)對(duì)靶酶的性質(zhì)做進(jìn)一步闡述，為設(shè)計(jì)研發(fā)新型的具有高度特異性的

抗真菌藥物提供平臺(tái)。

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