dgge

.1

Jan.

，

2020

第48卷第1期釀酒

*°*

"年"月LIQUORMAKING

文章編號:1°°2

—8110(2)21

)°1—

°°37-°5首屆“

川酒杯

”全國白酒技術(shù)

論文有獎?wù)魑拇筚惈@獎?wù)撐?/p>

PLFA法和DGGE法分析制曲過程微生物群落變化

趙金松",劉茗銘2,周榮清$

(1.四川輕化工大學，四川自貢

643000;2.

四川省酒業(yè)集團有限責任公司，四川瀘州646000;

3.四川大學輕紡與食品學院，四川成都610065)

摘要:同時采用PLFA(Phospholipidfattyacid)譜圖分析法和DGGE(Denaturinggradientgelelectrophoresis)法

分析大：制：過程中微生物群落的變化

。結(jié)果表明：真菌類微生物生物量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，發(fā)酵第7天各

種微生物含量達到極限值,隨后呈下降的趨勢

。通過貯存期間的不斷篩選和馴化，逐漸形成了大：

制作過程中穩(wěn)

定的微生物群落結(jié)構(gòu)。通過DGGE對大：制：過程的微生物群落結(jié)構(gòu)分析,細菌共檢測到20條帶，包括魏斯氏

菌屬、芽抱桿菌屬、乳酸菌屬、桿菌屬、球菌屬，其中芽抱桿菌所占的比例最高，其次為乳酸菌屬。在制：過程中的

真菌優(yōu)勢譜帶在各個培養(yǎng)階段是基本相同的，僅初始階段強度相對較弱的譜帶在后期消失了。

雖然顯示的信息

兩種方法并不完全吻合，但也說明了不同方法表征的信息并不是絕對的，采用兩種方法組合研究大

：微生物的

信息變化是很有必要的。

關(guān)鍵詞：DGGE法;PLFA法；大：；微生物群落

中圖分類號:TS262.3;TS261.1文獻標識碼:A

ChangesofMicrobialCommunitiesinDaquBrewingbyPLFAandDGGE

Methods

ZHAO

Jinsong1,2

,LIUMingming2,ZHOURongqing3

(e

of

Bioengineering,SichuanUniversity

ofScienceandEngineering,Zigong643000,Sichuan,China;

nLiquorgroupCo.,Ltd.,Luzhou646000,Sichuan,China;

eofLightIndustry,Textile&FoodEngineering,SichuanUniversity,Chengdu610065,Sichuan,China)

Abstract：

Microbialcommunitystructureislittleknownatdifferentstagesduringthe

compostingprocess

duetodifficulttoculture

microbes

e-independentmethodsincludingphospholipidfattyacid(PLFA)anddenaturinggradientgelelectrophoresis

(DGGE)had

beenemployedtocharacterizethechanges

resultsshowed出at：出efungal

7thday

of

fermentation,thecontentofvariousmicroorganisms

reachedthelimitvalue,hcontinuousscreening

and

acclimationduringstorage,astablemicrobial

community

hDGGEanalysisofthemicrobialcommunitystructure

duringtheprocessof,bacteriadetectedatotalof

20bands,

includingWeislla,Bacillus,Lactobacillus,Bacillus,andCoccus,withBacillus

galdominantbandsintheprocessofDaquproductionarebasically

thesamein

eachstageofcultivation,andonlythebandswithweakerintensityin

theinitialstage

disappeared

differencesrevealedbyPLFAprofileandDGGEmethodsindicatedthatthetwomethodsis

notcompletelyconsistent,italsoshowsthatthe

cessarytou

two

methods

tostudytheinformationchangesofDaqu

igai

Keywords:DGGEmethod;PLFAmethod;Daqu;community

在大曲生產(chǎn)過程中，通過控制環(huán)境濕度、溫度和反應(yīng)，賦予了大曲特殊的功能。通常大曲生產(chǎn)過程分

溶氧等參數(shù)，微生物繁衍及致使發(fā)生的一系列生化為低溫培菌、高溫轉(zhuǎn)化、后火排潮生香等主要階段叫

收稿日期：2020—03—0E

作者簡介:趙金松(1FE0-)，男，安徽壽縣人，博士，教授級高級工程師，碩士生導(dǎo)師，主要從事釀酒生物技術(shù)及風味研究。

37

2021第一期

有學者已經(jīng)報道了PLFA（Phospholipidfattyacid）技

術(shù)在研究糟1訊、窖泥盟、大曲問等釀酒微生物群落

結(jié)構(gòu)及其多樣性方面具有強大的功能。但是,plfa

技術(shù)不能確認具體微生物種群上的變化禍，且在有

些情況下，所得到的plfa譜圖的變化可能不是微

生物種類的變化陰。DNA技術(shù)則彌補了其局限性，

目前在分子生態(tài)學上，揭示大曲微生物群落結(jié)構(gòu)變

化最常用的免培養(yǎng)技術(shù)為DGGE技術(shù)叫呵，該技術(shù)通

過提取大曲的DNA,物的PCR

,能得到微生物群落結(jié)構(gòu)的指

紋圖譜。但是,DGGE-PDR技術(shù)易受環(huán)境微生物生

狀態(tài)“呵。

在本文中，我們采用PLFA與DGGE組合技術(shù),

旨在的曲過程微生物群落結(jié)構(gòu)

分究，提為全面的微生物群落組

及變化的，有揭示大曲釀過

大曲用的。

1材料與方法

1.1!品來源

大曲培取樣，分取=

天（）、2天（前）、3天（）、7天（高

）、9天（

降溫期）10天（）的大曲，為曲

過的。取曲、靠

曲房中間的，得到的

大曲,過20目篩,-201用。

1.2PLFA分析

采用修正的Bligh-Dyer法㈣。按0.8：1：2的體

積比向一定量樣品中依次加入磷酸鹽緩沖液、氯仿

和甲醇,250r/min條件下振蕩2ho先后加入緩沖液

和氯仿，靜置過夜。氯仿相轉(zhuǎn)移至試管，氮氣吹

干。提取出的脂肪酸用氯仿溶解，轉(zhuǎn)移至硅酸

鍵合固相抽提小柱，分用氯仿、丙酮、無水甲醇

洗脫，收甲醇洗脫液，氮氣吹干。干燥所得

中依次加入甲苯：甲醇混合液1mL,1mL0.2mol/L

氫氧化鉀-甲醇,37V水浴15mino冷卻后，加

入2mL超純水和0.3mL乙酸溶液（1mol/L）,用4mL

己烷分兩萃取脂肪甲酯，取有相，氮

氣吹干，加入內(nèi)標物正十九酸甲酯，供GC-MS檢測。

1.3DGGE分析

采用改的蛋白酶K-CTAB法提取細菌總

DNA并純化217-186,PCR反應(yīng)體系為50^L：5.0'L

10xBuffer,3.0cL25mmol/LMgCl2,4.0dL25mmol/L

dNTP混合物,1.0eL5U/gLTaq酶，引物

（10imol/L）各2.0jL,10ngDNA模板,31.0kL滅菌

雙蒸水。選取引物對為27f和1492r、357f-GC和

517roPCR擴增程序，采用降落PCR：95P預(yù)變性

8min,93°C變性1min,55~45°C退火lmin,每一個循

環(huán)降低0.5°C,72°C延伸3mino共計29循環(huán)，

在最

后的循環(huán)中變性為45Z,lmin。最后

72°C延伸10mino用1%的脂檢測。

總基因組DNA電泳條件：95V,電泳時間

30~35min,PCR產(chǎn)物DNA電泳條件：90V,電泳時間

30~35min。電泳結(jié)束后，將DGGE膠用SYBRGreenl

染色30min，總共染3次，每次染色10min，將染色后

的置系下并，圖用

Quantityone軟件分。對條帶切膠回收，

置于1.5mL的滅菌離心管中，加入30~50|jiL的無菌

去離子水稀釋溶解4。

（2過夜,然后對回收的DNA片

PCR物并PCR物DGGE，

之后用DNA純化試回收的DNA片

物純化,純化的DNA用于測序。

1.4數(shù)據(jù)分析

PLFA的定性以PLFA19：0做內(nèi)標物進行定量

計算。DGGE圖譜采用Quantity0ne2.0軟件進行分

,類分析應(yīng)用SPSS16.0軟件進行分。

2結(jié)果與討論

2.1制曲過程微生物PLFA信息分析

曲曲至10天，取測PLFA

及各類微生物PLFA，結(jié)圖1所示。在

所有大曲樣品中，共計檢出18種PLFA，包含14~20

的脂肪、脂肪、

脂肪酸、多脂肪酸及環(huán)丙烷脂肪。

其中8

種PLFA13：0、14：0、17：0、18：0、16：1

18：2

大曲（1'）,其18：26,9189

PLFA的含量較高，分別為400.53nmol/g和

66.24nmol/g。發(fā)酵的下降，4

，到7最，為

485.49nmol/g和80.39nmol/g。發(fā)酵第3天后，PLFA

的種類及有的，PLFA的增

加了1.77倍,18:236,9和18：139分別增加了

1.60及1.67倍。此外，3種PLFA（cl5：0、il5：0和

第一期

趙金松，等:PLFA法和DGGE法分析制曲過程微生物群落變化

2021

il6：

0）在發(fā)酵過程中沒有被檢出。在發(fā)酵過程大曲

中,16

：0、16：1+9、18：2+6,9及總PLFA含量,從制曲

初始階段到成熟曲階段均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。

按照Frostegard等㈣人所的方法估算樣品中G@、

GB、真菌生物量及它們的比例關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。

整個過程中,表征總生物量、真核（18：2d9;18：1f9）、

G-菌（16：1i9;cyl7：0；18：1o7；cyl9：0）和G@

（al4：0、

il4：0、il5:0、il6:0和a16:0）特征的PLFA含量的變

化趨勢相同。入曲房至第3天總PLFA和各類微生

物特征的PLFA減少，培至第3天開始增加，第7

天到,后減少

各類微生物比例的變遷趨勢表明，真核生物量

（F）菌生物量（B）的比減少,G@細菌和

G-菌的比比較穩(wěn)定,G+和G-菌后期增

幅均較大。在曲坯中測的真菌PLFA含量非常，

F/B比值較大，等的細胞中也含有較高

18：2a9和18：lc9PLFA,微生物繁衍，部分真核生

物的特征PLFA被轉(zhuǎn)化，所在初期含量減少，

培增,真菌量增加,相

的

PLFA含量增加。在培養(yǎng)后期、

的高

溫在后的培中、菌和酵的，有

菌/菌，所PLFA又減少。曲坯

中檢出的G@和G-菌的總量均在最初階段是減少。

cl5：0和i16：0PLFA也用于表征G+,但在所有的樣

品中均未檢出，且在第5天檢出G@菌的i15：0

PLFA。試驗的結(jié)果表明，培養(yǎng)過程中不僅是微生物

的，在同階段，同類的微生物、

大曲的水分等變化,也導(dǎo)致了群落結(jié)構(gòu)的變遷。

圖1不同制曲階段大曲樣品磷酯脂肪酸組成及含量

g1000

-

J900-

媲800-

700-

600-

fngi^5-”G@/G-

PLFA?Fungi/Bacteria

時間/d

500

400

圖2制曲過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

2.2制曲過程微生物DGGE

信息分析

樣品提取DNA分別以細菌引物（27f和1492r）

和真菌引物（NS3-GC和YM95r）擴增，結(jié)果如圖3

進行第二輪PCR擴增，DGGE圖譜如圖4所示。

所示。擴增的產(chǎn)物以引物357F-GC/517r和NS1/FR1

2000bp

lOOObp

細菌16srDNA和真菌18srDNAPCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜

圖3

在整個過程中，主要各樣品間的細菌DGGE圖

曲坯中總檢出的20條，在其

過程中減后增培1天后從6

增至9，檢出5，8和13，

3、譜帶11和14的增加。相對第2天樣品，

從培3天的樣品中的增，譜帶3、

39

第一期

2021

帶4、譜帶11和譜帶14等4條譜帶的強度減弱，而

譜帶8和譜帶9兩條譜帶的強度增強。培養(yǎng)7天樣

品則是譜帶3、

譜帶4、譜帶8、譜帶10、譜帶13和

譜帶14等6條譜帶的強度降低,僅有譜帶9和譜帶

11兩條譜帶的強度增強。培養(yǎng)9

天和10天樣品的

DGGE圖譜及代表性譜帶的強度未觀察到顯著的區(qū)

別，但相對第7天的樣品，可視化譜帶數(shù)量顯著增

多，部分譜帶的強度變化較大(譜帶4、譜帶6、譜帶

7、譜帶15、譜帶16、譜帶18和20)。

切割代表性的

20條譜帶測序后(表1),通過

Blast程序進行比對檢索，相似性＞97%的細菌類含

有13個種，分別屬于壁厚菌門(可如1屍463)的桿菌

(bacilli)綱和變形菌(Proteobacteria)門的y-變形菌

(C

-Proteobacteria)綱。壁厚菌門包括乳桿菌(Lac-

tobaciUIes)和芽胞桿菌(Bacillales)目，

其中Lacto-

baeillles則是由腸球菌科(Lecuconostocaceae)和乳酸

桿菌科(Lactobacillaceae)，前者是魏斯氏菌屬(Weis-

lla)，后者則包括片球菌屬(Pedioccus)和乳酸桿菌

屬(Lactobacillus)，芽抱桿菌目則是桿菌屬(Bacil-

lus)和葡萄球菌科(Staphyloccaceae)中的葡萄球菌

屬。h-變形菌綱則是胞菌目(Pcudomon-

adales)的莫拉菌科(Moraxellaceae)中的不動桿菌屬

(Acinetobact^)和腸桿菌目(Enterobacteriales)的腸桿

菌科(Enterobacteriaceae)中腸桿菌屬(Enterobacter)

和沙雷氏菌屬(Serratia)。這些種屬的菌株中，除

和Serraiasp，

性。

Iday2day3d?y7day9dayIOday咽I十I

圖4細菌16SrRNA的

PCR-DGGE圖譜

曲坯的樣品中的優(yōu)勢菌主要是Weislla和

Lactobacillus,均是乳酸的生產(chǎn)者。培養(yǎng)1天后，群落

結(jié)構(gòu)稍有變化，Acinetobacter、StaphyIococcus和Pe-

等屬，的多樣性增加。培養(yǎng)

3天的樣品，菌數(shù)目未增，的

40

Bacillus成為優(yōu)勢菌之一-o培養(yǎng)7天的樣品中檢出的

優(yōu)勢菌Bacillus中的主要是Blicheniformis，而第9天

和10天的樣品則包括Blicheni

ormis和Bamyloli-

，樣品中檢eo

ae和Seaia是

菌，但樣品中菌Pedioos則

°

圖5真菌18SrRNA的DGGE-PCR圖譜

表1細菌

DGGE條帶序列分析結(jié)果

BandIdentification

Simiariy%

Aessi

1Weisllacibaria100KC110687.1

2Weieaca100HF562956.1

3

Unculturedbacterium1001232391

4Staphylococcussp.100114811

1

5eWeiea

97

A4217951

6,12BacilluslicheniBrmis

99

JX994184.1

7Sahyxy1000207401

8Pediococcuspentosaceus1001421511

9Aiebaebe

ii

99

86775461

10Lactobacillusplantarum100JN671595.1

11Lactobacillusfermentum

97

1458291

13Lacobaciscrsorm1002457071

14Lacobacisponis100

M2184201

15Bacispichino

yi100KC019189.1

16Bacissp100

E6105031

17Klebsiellasp.100

D9892152

18Bacillusamyloliquefaciens

99

A0552231

19

Baissbiis100JQ916087.1

20

Serraiamares100448402

1

對大過程中細菌分的，

對大中的菌進行DGG分，其

DGGE圖譜如圖5所示。

比較細菌的DGGE圖譜，我

菌的DE圖譜較，僅10條

帶。，后(1d和2d)大曲條帶中的

菌數(shù)量較多，可這，，養(yǎng)

，大部分，菌度

第一期

趙金松，等:PLFA法和DGGE法分析制曲過程微生物群落變化2021

速增加，這與王世寬等㈣通過傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法的

研究結(jié)果一致。發(fā)酵第3&7內(nèi)真菌條帶數(shù)和豐度迅

速降低，由于此時大曲處于高溫轉(zhuǎn)化期，大多數(shù)微生

物不能生長,霉菌和酵母菌均大幅下降，

導(dǎo)致這一時

期的豐度值略微下降。在培養(yǎng)第9天達到高峰，其條

帶數(shù)和亮度最高。發(fā)酵10d后，大曲進入貯存過程

中，曲房溫度、濕度下降，微生物活降低，條

帶數(shù)大的化，真菌的化其

豐度的化DGGE的條帶量進行聚類分

析，從表1的結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，大曲曲過程中的真菌

化分3類，其中發(fā)酵期(1d和2d)、發(fā)酵

第9

天和第10天聚一類,發(fā)酵第7天單獨聚一

類。在培養(yǎng)過程中，帶在培養(yǎng)

的，度的帶在后

期

3結(jié)論

3.1本章借助DGGE和PLFA技術(shù)對制曲過程中

不同發(fā)酵時間的細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)進行了分析。

結(jié)果發(fā)真菌類微生物生物量下降后

，發(fā)酵第7天微生物量達到值，后

下降的通過貯存期的不和化，

大曲過程中微生物結(jié)

3.2通過DGGE對大曲制曲過程的微生物群落結(jié)

構(gòu)分析，細菌共檢測到20條帶，包括魏斯氏菌屬、

菌、菌菌菌，

其中

菌最高，其菌在曲過程中

真菌帶在培養(yǎng)，

度帶在后期

3.3雖然兩種方法顯示的信息并不完全吻合，但也

此不方法的不的

用多方法研究大曲微生物化

必要的。

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