Octet BLI 小分子結合動力學檢測實驗設計Small Molecule Kinetics

Small Molecule Kinetics Assay:

概述：

Octet RED系列可檢測分子量為150 Da~1000 Da的小分子與蛋白間相互作用。該SOP的目的在于為小分子動力學檢測提

供通用標準化流程，針對具體分子及特殊情況，可能需要進一步考慮更多細節及優化。此外，該SOP假定所有使用者

已經過ForteBio應用科學家上機培訓，如若不然，請在培訓完成后參考該SOP。

考量及建議：

1. 采用RED系列檢測小分子時，應當使用SSA nsor（Cat# 18-0008 and 18-0009），該nsor是ForteBio公司目前唯

一具備檢測小分子靈敏度的傳感器。

2. 用于與小分子結合的蛋白或抗體必須生物素化。請參閱ForteBio技術說明書。

3. 建議assay buffer為PBS+5%DMSO；

4. 設置protocol時，須設置兩組SSA nsor，運行中第1組為實際檢測用nsor，第2組為生物胞素（biocytin）封閉

后、用作陰性對照的nsor。

5. 至關重要的是，檢測nsor與對照nsor間運行步驟數以及各步運行時間必須一致-任何偏差將導致所得數據無法

于Octet RED軟件上分析。

6. 用于loding的生物素化蛋白濃度建議采用50ug/ml。如蛋白很小或容易產生空間位阻，可能需要進行定量。如蛋白

較寶貴，其用量可以更低，但隨后的結合效率可能會有所折扣（17kDa的蛋白在推薦濃度下3min后可產生2nm的

shift）。

7. 稀釋樣品，DMSO最終濃度為5%（例如：溶于100%DMSO中20mM的樣品，按照1:20溶于PBS后其濃度為

1mM，DMSO為5%）。

8. 建議對樣品進行兩輪篩選。例如，第1輪寬泛篩選，濃度為100,10,1,0.1uM，確定樣品大概Kd范圍；第2輪更精

細篩選：30,10,3.3,1.1uM，獲取高度可信的Kd。（注意：所用濃度僅用于發揮導向性作用，實際濃度取決于初篩所

獲得Kd）。實際實驗中，在篩選前可采用1個相對高濃度樣品或陽性對照，先測定相互作用有無，然后執行如上

篩選。

9. 注意：兩組SSA nsor必須為同一批次。

1. 實驗目的：

采用Octet RED檢測小分子與蛋白間相互作用。

2. 實驗材料：

2.1 儀器：

Octet RED；

2.2 傳感器：

SSA傳感器；

2.3 樣品：

蛋白：MW（kDa），濃度，buffer（不可為Tris或其他含氨基的buffer），總量；小分子：MW（Da），濃

度，總量；

2.4 緩沖液：

Assay buffer=AB（一般為PBS）；

2.5 其他試劑與耗材：

biotin-LCLC-NHS，5mg/ml biocytin、 Greiner 96孔板，BSA，Tween-20， EP管，PD-10 Desalting

Columns（或Zeba? Spin Desalting Columns），移液器1套。

3. 實驗方法：

3.1 蛋白生物素化：

參閱ForteBio公司技術說明書。

3.2 樣品配制：

4. 實驗步驟：

4.1 按照操作須知打開電腦，開機；點開數據采集軟件，初始化結束后儀器顯示為Ready狀態。選擇Basic Kinetics，點

擊右向圖標進入protocol設置界面。

最大化，可看見流程化設置窗口，分別為Plate Definition，Assay Definition，Sensor Assignment，ReView Experiment和

Run Experiment ：

4.2 Plate Definition:在該窗口定義如何加樣，對于小分子檢測，可排列如下:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A AB Biotin-P BCT AB AB AB AB AB S1 S2 S3 S4

B AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

C AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

D AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

E AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

F AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB … … … …

G AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB Sa Sb Sc Sd

H AB Biotin-PBCT AB AB AB AB AB AB AB AB AB

AB=Assay buffer, Biotin-P=biotin-protein, BCT=biocytin, S=sample;1,2,3,4 and a,b,c,d are different concentrations from low to

high.

左鍵點擊左上方微孔板列標數字1，隨即點擊右鍵彈出如下樣品類型菜單，根據如上樣品排列，選擇類型依次為

Buffer，Loading，Quench，Buffer，Buffer，Buffer，Buffer，Buffer，Sample，Sample，Sample，Sample。H行9-12列設

為buffer。

依此類推，將樣品及所用試劑信息盡量填寫完整：

在該窗口右上側將樣品濃度單位調整合適，輸入樣品濃度；按照樣品板排列加樣，注意：微孔板須

采用ForteBio推薦廠家與貨號。

如樣品濃度為倍比稀釋，可按照如下操作，填寫最高（或最低）濃度，除以（或乘以）稀釋因子即可：

左鍵選中填寫框后右鍵彈出上圖所示菜單，選擇Set Well Data，

本例中最高濃度為100uM，從低到高檢測，因此起始值為100，除以2，選擇Up，點擊OK即可：

4.3 Assay Definition:在該窗口定義操作類型及運行步驟；

在Step Data List下點擊Add，添加所需檢測步驟：

運行第1步，nsor從nsor tray到樣品板第1列buffer中檢測基線，然后loading，因此添加步驟選擇Loading，時間

設置為300s（loading時間可根據預實驗確定；在完全未知時，可以根據需要設置為120s，180s或300s，不要太短或太

長即可），點擊OK確定。

添加Quenching步驟，時間60s，