小rna測序(小RNA測序分析)

small RNA測序的詳細內容

Small RNA是一大類調控分子，幾乎存在于所有的生物體中。Small RNA包括：miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等等。Small RNA通過多種多樣的作用途徑，包括mRNA降解、翻譯抑制、異染色質形成以及DNA去除，來調控生物體的生長發育和疾病發生。Small RNA轉錄組測序是鑒定和定量解析small RNA的新方法和有力工具。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以對Small RNA進行大規模測序分析， Illumina Solexa GA IIx 和ABI Solid的讀長正好配合了small RNA的短序列且通量大，可以得到更高的覆蓋率， Illumina Solexa GA IIx在small RNA測序中廣泛應用。
通過對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的Small RNA圖譜，實現包括新Small RNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、Small RNA聚類和表達譜分析等科學應用。
一、small RNA測序樣品要求
(1) 樣品純度要求： OD值應在1.8至2.2之間；電泳檢測28S:18S至少大于1.5。
(2) 樣品濃度： total RNA濃度不低于750 ng/μg；提取總RNA時請不要使用過柱法提取總RNA，樣品總量不低于40 μg (Small RNA: total RNA大于0.3%)。或提供濃度大于2 ng/μg，總量大于180 ng的Small RNA樣品。
(3) Small RNA樣品請置于-20℃保存；請提供Small RNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數據，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數據。如需進行多次樣品制備，需要提供多次樣品制備所需樣品。
(4) 樣品運輸：樣品請置于1.5 ml管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時間，管口使用Parafilm封口。建議使用干冰運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。
二、Small RNA分離的方法
現行的RNA純化方法包括有機溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的RNA(200 nt以上)，Small RNA往往被淘汰掉，因而不適用于Small RNA的分離純化。有機溶劑抽提能夠較好的保留Small RNA，但是后繼的沉淀步驟比較費時費力。目前還有另外一些Small RNA分離專用的試劑盒。如MirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱(glass fiber filter，GFF)，既能夠富集10 mer以上的RNA分子，又兼備離心柱快速離心純化的特點。
對于Small RNA測序，我們采用PAGE膠電泳對小RNA進行分離。客戶可以選擇他們感興趣的Small RNA長度進行研究。Small RNA的長度為18-30nt。我們推薦的測序長度為35bp，之后對序列信息進行修剪，去除接頭序列僅留下Small RNA序列。
三、Small RNA測序文庫的構建方法及質量控制
由于Solexa的讀長足夠滿足Small RNA測序的讀長要求，且數據讀取量大，性價比高，因此Solexa在Small RNA測序方面得到廣泛的應用。采用Solexa進行Small RNA測序其文庫構建方法如下：
(1) PAGE膠純化特定大小的小RNA分子；
(2) 5′接頭連接和純化；
(3) 3′接頭連接純化；
(4) RT-PCR擴增；
(5) Small RNA文庫的純化；
(6) 文庫的檢測。Small RNA文庫需要通過電泳檢測和Agilent Technoligies 2100 分析儀檢測以分析測序文庫中片段的大小、純度和濃度。
四、高通量測序研究sRNA 優勢
目前研究Small RNA的方法主要是通過實時定量PCR以及基因芯片技術，這些方法主要關注microRNA的表達和定量，并僅局限與研究那些序列信息或二級莖環結構信息已知的Small RNA，無法尋找和發現新的Small RNA分子。基于高通量測序技術的Small RNA測序技術突破了目前研究技術手段上的局限性，使研究人員能夠直接對樣本中的Small RNA進行高通量測序，其主要優勢有：
(1) 可以直接從核苷酸水平上研究Small RNA分子，不存在傳統芯片雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題，非常利于區分相同家族以及序列極為相似的不同Small RNA分子；
(2) 可以對任意物種進行高通量分析，無需任何預先的序列信息以及二級結構信息【中國測序論壇】；
(3) 靈敏度高，測序通量大，為Small RNA分子的發現和研究提供了極大的數據深度與覆蓋率，能夠檢測豐度極低的稀有轉錄；
(4) 測序產生的原始數據可以與多種分析軟件兼容，可以注釋Small RNA的基因組信息，并分析其表達水平，能夠隨時使用公用Small RNA數據庫注釋已知的Small RNA，還可以進一步分析未匹配的數據，發現新的Small RNA種類及異構體，尋找更深入的研究信息。
五、Small RNA測序的影響因素
(1) 客戶提供樣本的質量，進行Small RNA測序過程中，需要對Small RNA進行分離，分離Small RNA的質量和純度直接影響測序結果。由于RNA容易降解，因此RNA的抽提、純化等操作一定要嚴格按照實驗要求進行，以保證樣品的質量。
(2) 構建文庫的質量：文庫構建需要PAGE膠分離純化Small RNA，然后連接接頭進行純化后才能進行RT-PCR，在此過程中，要小心操作保證Small RNA無降解，同時純化過程要保證接頭去除干凈，殘余的接頭會對后續的測序產生影響。
(3) 測序文庫的上樣量控制：這個因素也會很大程度影響簇生成的密度，由于上樣量非常小，只有1-8 pg，所以能否準確定量微量樣品也成為影響測序通量的重要因素。

small RNA測序的原理簡介

Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs等）是生命活動重要的調控因子，在基因表達調控、生物個體發育、代謝及疾病的發生等生理過程中起著重要的作用。Illumina能夠對細胞或者組織中的全部Small RNA進行深度測序及定量分析等研究。實驗時首先將18-30 nt范圍的Small RNA從總RNA中分離出來，兩端分別加上特定接頭后體外反轉錄做成cDNA再做進一步處理后，利用測序儀對DNA片段進行單向末端直接測序。通過Illumina對Small RNA大規模測序分析，可以從中獲得物種全基因組水平的miRNA圖譜，實現包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的預測和鑒定、樣品間差異表達分析、miRNAs聚類和表達譜分析等科學應用。

正常的轉錄組測序包含小rna嗎

有專門針對小RNA進行測序的，采用高通量測序技術，一次性獲得單堿基分辨率水平的數百萬條小RNA序列信息，依托強大的生物信息分析平臺，鑒定已知小RNA，并預測新的小RNA及其靶標基因。

轉錄組測序的方法很多，而RNA-q是當前轉錄組測序的一種測序方法，又稱為二代測序，包括454，solexa等。RNA-q即轉錄組測序技術，就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術把它們的序列測出來。反映出它們的表達水平。

樣品要求：

⑴樣品純度要求： total RNAOD值應在1.8至2.2之間；電泳檢測28S：18S至少大于1.5。

⑵樣品濃度： total RNA濃度不低于400ng/ul；樣品總量不低于15ug；最新的樣品建庫要求降低到1ug，濃度大于50ng/ul即可。

⑶請提供total RNA樣品具體濃度、體積、制備時間、溶劑名稱及物種來源。請同時附上QC數據，包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop儀器檢測數據。如需進行多次樣品制備，需要提供多次樣品制備所需樣品。

第3周：利用大豆小RNA圖譜鑒定來自編碼基因區的phasiRNA

理解為產生phasiRNA的PHAS位點與編碼蛋白的基因區有重疊可能更準確。
侵刪

  小RNA是一類普遍存在的，多功能的抑制物，包括（1）microRNA（miRNA），由mRNA形成的莖環結構加工而成; （2）小干擾RNA（siRNA），在植物中通常由需要依賴RNA的 RNA聚合酶的過程衍生。我們構建并分析了大豆小RNA的表達圖譜，鑒定了超過500個產生21個核苷酸的phad siRNAs（phasiRNA;來自PHAS位點）的位點，其中483個與注釋的蛋白質編碼基因有重疊。 通過整合miRNA與RNA end（PARE）數據的分析，檢測到127個PHAS位點上的20個miRNA靶標 。 PHAS位點的主要類別（208，占41％）與NB-LRR基因相對應；這些小RNA中的一部分優先在根瘤中積累。在PHAS位點中，還觀察到TAS3的新代表和非經典相位模式。由miR4392觸發的非編碼PHAS位點優先在花藥中積累；預測phasiRNA靶向轉座因子，在大豆生殖發育中具有峰值豐度。因此，phasiRNA在雙子葉植物中顯示出巨大的多樣性。我們鑒定了新的miRNA并評估了miRBa中記錄的大豆miRNA的準確性，顯著改善了大豆miRNA注釋，促進了miRBa注釋的改進并鑒定了高嚴謹性的新miRNA及其靶標。

文章做了些什么：

   小非編碼RNA在發育，細胞分化，適應生物和非生物脅迫以及基因組穩定性方面具有重要作用。 小RNA的主要活性是通過靶標降解，翻譯抑制或通過指導染色質修飾來對特定mRNA或基因表達模式進行負調控。迄今已鑒定出幾種不同類型的小RNA。在植物中，研究最多的小RNA是microRNA（miRNA）和小干擾RNA（siRNA）;這些是由不同的前體和不同的途徑產生的。 通常長度為21至22個核苷酸的miRNA 衍生自通過RNA聚合酶II從MIRNA基因轉錄的長非編碼RNA前體。miRNA前體形成由DICER-LIKE1（DCL1）或其他DCL酶（極少數）加工的莖環結構，產生3’具有兩個核苷酸突出的單個小RNA雙鏈體（miRNA / miRNA *）。小RNA雙鏈體的一條鏈是成熟miRNA，被稱為引導鏈，它會結合到Argonaute（AGO）蛋白上以形成效應復合物（所謂的用于RNA誘導的沉默復合物——RISC），其指導miRNA靶標降解或翻譯抑制。雙鏈體的另一條鏈，即miRNA *或pasnger strand，迅速降解，通常不會積累。 siRNA通常來自完全互補的長雙鏈RNA（dsRNA）前體，這些前體一般由RNA依賴性的RNA聚合酶（RDR）形成，也可能由退火了的正義/反義轉錄物形成。已經在植物中定義了幾類siRNA，主要類別是異染色質siRNA，它在胞嘧啶甲基化和抑制性組蛋白修飾的建立和維持中起關鍵作用。 siRNA還能夠作為移動信號起作用，通過siRNA的運動使沉默效應從細胞擴散到其它細胞或更長距離。

  科學家已經鑒定了一類相當有趣的siRNA，它們是長雙鏈RNA前體以21個核苷酸為增量來逐步裂解的產物，產生定相的或完全間隔排列的小RNA。這些siRNA，即所謂的相位排列siRNA（phasiRNA），由特定的引導miRNA切割而產生，遵循單擊或雙擊模式，分別對應一個22nt或兩個21nt的miRNA的靶位點。切割的未加帽的mRNA產物用作RDR6的底物，產生dsRNA前體，然后被DCL4切割以產生21-核苷酸的定相siRNA。 一些定相siRNA已經顯示在靶基因的反式調節中起作用;因此，這類siRNA最初被稱為tasiRNA，但是更多的基因位點產生具有未知反式作用的相同相位模式（PHAS基因座）的siRNA，因此一般用“phasiRNA”進行描述。 tasiRNA通過對互補靶位點進行切割來調節mRNA，這如同許多植物miRNA一樣。 最著名的tasiRNA是由TRANS-ACTING SIRNA GENE3（TAS3）產生的反式小干擾RNA-生長素響應因子（tasiARF）的集合。tasiARF在抑制生長素響應因子基因（ARF2，ARF3 / ETTIN和ARF4）中起作用 。已經在許多植物物種中鑒定出許多phasiRNA，包括擬南芥，水稻（Oryza sativa）和葡萄（Vitis vinifera）。已知PHAS基因座的數量在物種之間差異很大，從野生稻（Oryza rufipogon）中的800多個到擬南芥中的不到30個。在豆科植物中，分別在Medicago truncatula和大豆（Glycine max）中鑒定出114和41個PHAS基因座。

  大豆在經濟上是世界上最重要的豆類，它是蛋白質和食用油的主要來源之一。大豆的基因組序列現在可公開獲得。基因組序列與下一代測序技術產生的數據一起，使得能夠在全基因組范圍內鑒定和定量小RNA。迄今為止，已在大豆中鑒定出數百種miRNA。然而，許多新注釋的miRNA及其靶標尚未得到很好的驗證，甚至注釋的miRNA也經常在更強大的實驗數據后進行校正。PHAS基因座比miRNA的注釋更差。與Medicago truncatula相比，在大豆中鑒定出的PHAS位點要少得多。憑借廣泛的小RNA數據和更高的測序深度，可以發現更多的PHAS。在這項研究中，我們分析了從不同組織中創建的大量小RNA文庫，以構建小RNA的表達圖譜并全面鑒定大豆中的PHAS基因座。 我們證明大豆中的許多蛋白質編碼基因是PHAS基因座。 除了先前被鑒定為豆科植物PHAS基因座的NB-LRR之外，我們發現了數百種其他產生phasiRNA的蛋白質編碼基因。 我們整合了RNA末端（PARE）數據的并行分析，以確定這些PHAS基因座的miRNA觸發因子。 從這些數據中，我們驗證了在miRBa（版本20）中記錄的大豆miRNA并且鑒定了新的miRNA，證明了許多先前報道的miRNA具有siRNA的特征。基于表達分析，我們證明了phasiRNA以及已知和新發現的miRNA在不同組織和不同處理下的特異性表達。

總結

重點是流程圖和過濾條件

探究了不同組織（或組織組合）中的miRNA富集差異。

圖1.新的和組織優先miRNA的表達譜。
（A）在該研究中鑒定的新miRNA包括許多在特定組織或器官中差異富集的miRNA。
（B）對先前描述的大豆miRNA的分析還揭示了花，葉和根瘤中一系列的組織bias。

圖2.編碼蛋白質的PHAS基因。
比起其他研究過的植物基因組，大豆基因組含有更多的編碼蛋白質的產生phasiRNA的基因座。
（A）編碼PHAS基因座的類別和數量。
（B）NB-LRR家族中PHAS基因的表達譜和層次聚類。
（C）大豆基因組中phasi-NB-LRR基因的分布和聚類。

圖3.大豆TAS3 TasiRNA的觸發物和加工機制。
（A）來自大豆基因組中存在的六個TAS3基因座中的tasiRNA的總和在花，葉，根瘤和種子組織中的富集模式。 TAS3a和TAS3b是相同的，因此不能單獨測量。
（B）源自TAS3a / b / c / d / e / f的TasiARF。所有TAS3 598D（+）和597D（+）siRNA的驗證目標均在生長素響應因子（ARF）家族中，與其相對良好的保守序列一致（數據未顯示）。
（C）在大豆TAS3基因座處存在兩個或三個miR390靶位點，并且相對于這些靶位點的定相方向表明在TAS3e和TAS3f處由21個核苷酸的miRNA觸發的siRNA的非典型加工方向。

圖4.由TasiARF觸發的ARF3 PHAS-Locus。
（A）大豆TAS3衍生的tasiARF在兩個相同的位點靶向ARF3，通過PARE驗證切割的59位點（下圖）和未觀察到切割的39位點。這種雙擊的tasiARF活性產生了定相siRNA（中圖）。 y軸是phasing “score”，其是定相顯著性的估計P值（ 參見方法 ）。 較低的兩個圖像是我們的Web瀏覽器，顯示小RNA（中間）或PARE數據（下部），橙色虛線表示tasiARF切割位點。有色斑點是在y軸上顯示豐度的小RNA ；淺藍色斑點表示21個核苷酸的sRNA，綠色表示22個核苷酸的sRNA，橙色表示24個核苷酸的sRNA，其他顏色對應其他sRNA大小。紅色框是帶注釋的外顯子（粉紅色是非翻譯區域）。紫色線表示重復區的k-mer頻數。
（B）來自圖A的數據表明two-hit的phasiRNA生物發生的級聯反應，其中21個核苷酸（nt）miR390觸發21個核苷酸的tasiARF生物發生，并且通過two-hit機制，tasiARF觸發來自ARF3和ARF4的額外二級siRNA的生成（參見補充圖7在線）。 ARF siRNA可以順式或反式起作用。

圖5.源自Arogenate脫氫酶基因座的花藥中高度富集的PhasiRNA。
（A）涉及雄激素脫氫酶的生化途徑。
（B）來自雄激素脫氫酶相關基因座的phasiRNA產生的示意過程。在左側，將形成發夾的基因片段加工成phasiRNA。
（C）來自不同組織中的兩種arogenate dehydrogena PHAS基因的miRNA觸發物和phasiRNA的reads豐度水平（紅色條）和基因表達水平（綠色條），其被標準化為RP5M和RP25M。

如何確定有沒有匹配到tRNA，rRNA，snRNA和snoRNA？

降解組測序： http://www.ebiotrade.com/custom/LC_BIO/100427/index.htm

RNA的測序原理及方法！^~^

DNA和RNA的測序方法

DNA或RNA堿基序列測定方法，包括步驟：
1）將DNA或RNA單鏈固定于平面支持物上；
2）將一束激光聚焦于一條固定化的單鏈上；
3）通過加入含有（i）用于合成DNA互補鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶四種核苷酸的混合物或用于合成RNA互補鏈的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶四種核苷酸的混合物和（ii）一種聚合酶的溶液，用來產生上述被固定的、被聚焦的單鏈的DNA或RNA互補鏈，插入到互補鏈中的每一個被發光標記物標記了的核苷酸用單分子檢測器進行檢測，以及在下一個被發光標記物標記的核苷酸插入之前對前一個被發光標記物標記的核苷酸的發光信號進行檢測。