化學合成多肽(化學合成多肽藥物)

多肽合成方法有什么？

現在，人們已經發現和分離出一百多種存在于人體的肽，對于多肽的研究和利用，出現了一個空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結構；設計新的多肽，用于研究結構域功能的關系；為多肽生物合成反應機制提供重要的信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。

二、合成方法

多肽的合成主要有兩種途徑：化學合成和生物合成。化學合成主要通過氨基酸縮合反應來實現。為得到具有特定順序的合成多肽，當合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體時，應將不需要反應的基團暫時保護起來，然后再進行連接反應，以保證合成的定向進行。多肽的化學合成有固相合成和液相合成，其主要的區別在于是否使用固相載體。多肽液相合成主要有逐步合成和片段組合兩種策略，

多肽合成的基本原理是什么？

多肽合成

多肽合成又叫肽鏈合成，是一個固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。合肥合生生物多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。

多肽合成的原理

多肽合成就是如何把各種氨基酸單位按照天然物的氨基酸排列順序和連接方式連接起來。由于氨基酸在中性條件下是以分子內的兩性離子形式(H3+NCH(R)COO-)存在，因此，氨基酸之間直接縮合形成酰胺鍵的反應在一般條件下是難于進行的。

氨基酸酯的反應活性較高。在100℃下加熱或者室溫下長時間放置都能聚合生成肽酯，但反應并沒有定向性，兩種氨基酸a1和a2的酯在聚合時將生成a1a2…、a1a1…、a2a1…等各種任意順序的混合物。

為了得到具有特定順序的合成多肽，采用任意聚合的方法是行不通的，合肥合生生物而只能采用逐步縮合的定向多肽合成方法。一般是如下式所示，即先將不需要反應的氨基或羧基用適當的基團暫時保護起來，然后再進行連接反應，以保證多肽合成的定向進行。

式中的X和Q分別為氨基和羧基的保護基，它不僅可以防止亂接副反應的發生，還具有能消除氨基酸的兩性離子形式，并使之易溶于有機溶劑的作用。

Q在有的情況下也可以不是共價連接的基團，而是由有機強堿(如三乙胺)同氨基酸的羧基氫離子組成的有機陽離子。Y為一強的吸電子基團，它能使羧基活化，而有利于另一氨基酸的自由氨基，對其活化羧基的羧基碳原子進行親核進攻生成酰胺鍵。

由此所得的連接產物是N端和C端都帶有保護基的保護肽，要脫去保護基后才能得到自由的肽。如果肽鏈不是到此為止，而是還需要從N端或C端延長肽鏈的話，則可以先選擇性地脫去X或Q，然后再同新的N保護氨基酸(或肽)或C保護的氨基酸(或肽)進行第二次連接，并依次不斷重復下去，直到所需要的肽鏈長度為止。

對于長肽的多肽合成來說，一般有逐步增長和片段縮合兩種伸長肽鏈的方式，前者是由起始的氨基酸(或肽)開始。每連接一次，接長一個氨基酸，后者則是用N保護肽同C保護肽縮合來得到兩者長度相加的新的長肽鏈。

對于多肽合成中含有谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、半胱氨酸等等帶側鏈功能團的氨基酸的肽來說，為了避免由于側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。

多肽合成方法分類

多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。

化學合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時應將不需要反應的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應，這樣保證了多肽合成目標產物的定向性。多肽的化學合成又分為液相合成和固相合成。

多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發展迅速，在多肽和蛋白質合成領域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據多肽片段的化學特定性或化學選擇性，多肽片段能夠自發進行連接，得到目標多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。

多肽的生物合成方法主要包括發酵法、酶解法，隨著生物工程技術的發展，以DNA重組技術為主導的基因工程法也被應用于多肽的合成。

多肽的固相合成

多肽的合成是氨基酸重復添加的過程，通常從C端向N端(氨基端)進行合成。多肽固相合成的原理是將目的肽的第一個氨基酸C端通過共價鍵與固相載體連接，再以該氨基酸N端為合成起點，經過脫去氨基保護基和過量的已活化的第二個氨基酸進行反應，接長肽鏈，重復操作，達到理想的合成肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，分離純化，獲得目標多肽。

1、Boc多肽合成法

Boc方法是經典的多肽固相合成法，以Boc作為氨基酸α-氨基的保護基，芐醇類作為側鏈保護基，Boc的脫除通常采用三氟乙酸(TFA)進行。多肽合成時將已用Boc保護好的N-α-氨基酸共價交聯到樹脂上，TFA切除Boc保護基，N端用弱堿中和。

肽鏈的延長通過二環己基碳二亞胺(DCC)活化、偶聯進行，最終采用強酸氫氟酸(HF)法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc多肽合成法中，為了便于下一步的多肽合成，反復用酸進行脫保護，一些副反應被帶入實驗中，例如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側鏈在酸性條件不穩定等。

2、Fmoc多肽合成法

Carpino和Han以Boc多肽合成法為基礎發展起來一種多肽固相合成的新方法——Fmoc多肽合成法。

Fmoc多肽合成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的保護基。其優勢為在酸性條件下是穩定的，不受TFA等試劑的影響，應用溫和的堿處理可脫保護，所以側鏈可用易于酸脫除的Boc保護基進行保護。

肽段的最后切除可采用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹脂上定量完成，避免了采用強酸。同時，與Boc法相比，Fmoc法反應條件溫和，副反應少，產率高，并且Fmoc基團本身具有特征性紫外吸收，易于監測控制反應的進行。Fmoc法在多肽固相合成領域應用越來越廣泛。

多肽液相分段合成

隨著多肽合成的發展，多肽液相分段合成(即多肽片段在溶液中依據其化學專一性或化學選擇性，自發連接成長肽的合成方法)在多肽合成領域中的作用越來越突出。其特點在于可以用于長肽的合成，并且純度高，易于純化。

多肽液相分段合成主要分為天然化學連接和施陶丁格連接。天然化學連接是多肽分段合成的基礎方法，局限在于所合成的多肽必須含半光氨酸(Cys)殘基，因而限定了天然化學連接方法的應用范圍。天然化學連接方法的延伸包括化學區域選擇連接、可除去輔助基連接、光敏感輔助基連接。

施陶丁格連接方法是另一種基礎的片段連接方法，其為多肽片段連接途徑開拓了更廣闊的思路。正交化學連接方法是施陶丁格連接方法的延伸，通過簡化膦硫酯輔助基來提高片段間的縮合率。

其他多肽合成方法

1、氨基酸的羧內酸酐法(NCA)

氨基酸的羧內酸酐的氨基保護基也可活化羧基。

NCA的原理:在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結合，反復進行。

NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術也較為通用。

2、組合化學法

20世紀80年代，以固相多肽合成為基礎提出了組合化學法，即氨基酸的構建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學庫，并從中篩選出具有某種理化性質或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。

組合化學法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學法的最大優點在于可同時合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體。

3、酶解法

酶解法是用生物酶降解植物蛋白質和動物蛋白質，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產量低、投資大、周期長、污染嚴重，未能實現工業化生產。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質原有的營養價值，并且可以獲得比原蛋白質更多的功能，更加綠色，更加健康。

4、基因工程法

基因工程法主要以DNA重組技術為基礎，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。

利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。

基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛生，原料來源廣泛和成本低等優點，但因存在高效表達，不易分離，產率低的問題，難以實現規模化生產。

5、發酵法

發酵法是從微生物代謝產物中獲得多肽的方法。雖然發酵法的成本低，但其應用范圍較窄，因為現在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細菌肽。

合肥合生生物主要提供：多肽合成、定制多肽、同位素標記肽、人工胰島素、磷酸肽、生物素標記肽、熒光標記肽（Cy3、Cy5、Fitc、AMC等）、目錄肽、偶聯蛋白（KLH、BSA、OVA等）、化妝品肽、多肽文庫構建、抗體服務、糖肽、訂書肽、藥物肽、RGD環肽等。請移步百度搜“合肥合生生物”即可

多肽合成的基本原理?

現如今多肽合成的辦法首要有兩種：即 Fmoc 和 t Boc 。因為 Fmoc 比 tBoc 具有更多的優勢，所以讓大家比較認可的是 Fmoc 法。而多肽合成是一個重復添加氨基酸的進程，合成方向是從 C 端（羧基端）向 N 端（氨基端）進行；從前多肽合成大多是在液相中進行，而如今大多選用固相合成，然后大大的降低了每步商品提純的難度；為了防止副反響的發作，合成柱和添加的氨基酸的側鏈都是預先被維護的，只要羧基端是游離的，并且在反響之前有必要先用化學試劑活化它。

多肽合成基本原理示意圖

具體合成過程如下：

1、去維護：Fmoc 維護的柱子和單體有必要用一種堿性溶劑（ piperidine ）去除氨基的維護基團。

2、激活和交聯：下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活溶解，激活的單體與游離的氨基在交聯劑的作用下交聯，構成肽鍵。

3 、循環：這兩步反響重復循環直到整條肽鏈合成結束。
4 、洗脫和脫維護：依據肽鏈所含的殘基不一樣，用不一樣的脫樹脂溶劑從柱上洗脫下來，其維護基團被一種脫維護劑（ TFA ）洗脫和脫維護。
多肽是復雜的大分子，因而每條序列在物理和化學特性上都是共同的，有些多肽合成很艱難 ，另有些多肽雖然合成相對簡單，但純化艱難；最常見的疑問是很多肽不溶于水溶液，因而在純化中，這些疏水肽有必要溶于非水溶劑中或特別的緩沖液，而這些溶劑或緩沖液很也許不適合應用于生物試驗體系，因而研究人員不能運用該多肽到達自個的意圖，因而下面是關于研究人員規劃多肽的一些建議。

怎么下降肽鏈合成的難度？

1. 削減序列長度
因為肽的長度添加會致使粗產品純度下降，小于15個殘基的肽對比簡單得到較高純度的初產品，當肽鏈長度添加到20個殘基以上時，準確產品的量即是一個首要思考的疑問。在很多試驗中，下降殘基數低于20 往往能得到非常好的試驗成果。
2. 削減疏水性殘基數
疏水性殘基占顯著優勢的肽，尤其在距C端7-12個殘基的區域，常常導致合成艱難。這一般被認為是因為合成中構成b折疊片，這么會發生不完全配對。用1個或幾個極性殘基置換 或參加Gly或Pro以翻開肽構造也許會有協助。
3. 削減“艱難”殘基

多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化學的一個重大的突破。它的最大特點是不必純化中間產物，合成過程可以連續進行，進而為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前全自動多肽的合成，基本都是固相合成。其基本過程如下：
基于Fmoc化學合成，先將所要合成的目標多肽的C-端氨基酸的羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這一氨基酸的氨基作為多肽合成的起點，同其它的氨基酸已經活化的羧基作用形成肽鍵，不斷重復這一過程，即可得到多肽。根據多肽的氨基酸組成不同，多肽后處理方式不同，純化方式也有差異。

多肽合成方法有哪些

多肽合成方法：

酰基疊氮物法

早在1902年，TheodorCurtius就將酰基疊氮物法引入到肽化學中，因此它是最古老的縮合方法之一。在堿性水溶液中，除了與酰基疊氨縮合的游離氨基酸和肽以外，氨基酸酯可用于有機溶劑中。與其他許多縮合方法不同的是，它不需要增加輔助堿或另一等當量的氨基組分來捕獲腙酸。

長期以來，一直認為疊氮物法是唯一不發生消旋的縮合方法，隨著可選擇性裂解的氨基酸保護基引入，該方法經歷了一次大規模的復興。該方法的起始原料分別是晶體狀的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通過肼解相應的酯很容易得到。在－10℃的鹽酸中，用等當量的亞硝酸鈉使酰肼發生亞硝化而轉化為疊氮化物65,依次洗滌、干燥，然后與相應的氨基組分反應。有些疊氮化物可用冰水稀釋而沉淀出來。 二苯磷酰基疊氮化物（DPPA）也可以用于酰基疊氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亞硝酸叔丁作為亞硝化試劑，并且使疊氮縮合反應可在有機溶劑中進行。因酰基疊氮化物的熱不穩定性，縮合反應需在低溫下進行。當溫度較高時，Curtius重排，即酰基疊氮轉化為異氰酸酯的反應成為一個主要的副反應，最終導致生成副產物脲。由于反應溫度低（如4℃）而導致反應速率相當慢，使得肽縮合反應通常需要幾天才能完全。 對于較長的N端保護的肽鏈，酯基的肼解一般比較困難，因此，使用正交的N保護肼衍生物是一種選擇。在肼基的選擇性脫除后，按倒接（backing-off）策略組合的肽片段可以用于疊氮縮合。

如前所述，雖然疊氮法一直被認為是消旋化傾向最小的縮合方法，但在反應中，過量的堿會誘發相當大的消旋。因此，在縮合反應期間要避免與堿接觸，例如，氨基組分的銨鹽應采用N，N－二異丙胺或N－烷基嗎啉代替三乙胺來中和。

雖然有上述局限性，但該方法仍很重要，尤其對于片段縮合而言，因為該方法具有較低的異構化傾向，適用于羥基未保護絲氨酸或蘇氨酸組分時，Nˊ保護的本行酰肼還具有多種用途。

酸酐法

在多肽合成中，最初考慮應用酸酐要追溯到1881年TheodorCurtius對苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。從氨基乙酸銀與苯甲酰氯的反應中，除獲得苯甲酰氨基乙酸外，還得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾認為，當用苯甲酰氯處理時，N－苯甲酰基氨基酸或N－苯甲酰基肽與苯甲酸形成了活性中間體不對稱酸酐。 大約在70年后，TheodorWieland利用這些發現將混合酸酐法用于現代多肽合成。目前，除該方法外，對稱酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子內形成的N－羧基內酸酐（NCA,Leuchsanhydrides）也用肽縮合。最后應該提到，不對稱酸酐常常參與生化反應中的酰化反應。

混合酸酐法

有機羧酸和無機酸皆可用于混合酸酐的形成。然而，僅有幾個得到了廣泛的實際應用，多數情況下，采用氯甲酸烷基酯。過去頻繁使用的氯甲酸乙酯，目前主要被氯甲酸異丁酯所替代。

由羧基組分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐，其氨解反應的區域選擇性依賴依賴于兩個互相競爭的羰基的親電性和（或）空間位阻。在由N保護的氨基酸羧酸鹽（羧基組分）和氯甲酸烷基酯（活化組分，例如源于氯甲酸烷基酯）形成混合酸酐時，親核試劑胺主要進攻氨基酸組分的羧基，形成預期的肽衍生物，并且釋放出游離酸形式的活性成分。當應用氯甲酸烷基酯（R1＝異丁基、乙基等）時，游離的單烷基碳酸不穩定，立即分解為二氧化碳和相應的醇。然而，對于親核進攻的區域選擇性，也有一些相反的報道，產物為氨基甲酸酯和原來的N保護氨基酸組分。 為了形成混合酸酐，將N保護的氨基酸或肽分別溶于二氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環、乙腈、乙酸乙酯或DMF中，用等當量的三級堿（N－甲基哌啶、N－甲基嗎啉、N－乙基嗎啉等）處理。然后，在－15℃－－5℃，劇烈攪拌的同時加入氯甲酸烷基酯以形成不對稱酸酐（活化）。經短時間活化后，加入親核性氨基酸組分。如果作為銨鹽使用（需要更多的堿），必須避免堿的過量使用。如果嚴格按照以上的反應條件，混合酸酐法很容易進行，是最有效的縮合方法之一。

對稱酸酐法

Nα－酰基氨基酸的對稱酸酐是用于肽鍵形成的高活性中間體。與混合酸酐法相反，它與胺親核試劑的反應沒有模棱兩可的區域選擇性。但肽縮合產率最高，為50%（以羧基組分計）。

雖然由對稱酸酐氨解形成的游離Nα－酰基氨基酸可以和目標肽一起，通過飽和碳酸氫鈉溶液萃取回收，但在最初，這種方法的實用價值極低。對稱酸酐可以用Nα－保護氨基酸與光氣，或方便的碳二亞胺反應制得。兩當量的Nα－保護氨基酸與－當量的碳二亞胺反應有利于對稱酸酐的形成，對稱酸酐可以分離出來，也可不經純化而直接用于后面的縮合反應。基于Nα－烷氧羰基氨基酸的對稱酸酐對水解穩定，可采用類似上述純化混合酸酐的方法進行純化。

由于Boc-保護氨基酸的商品化和合理的價格，在肽鏈的逐步延長中，使用對稱酸酐法日益受到重視。雖然可以買到晶狀的對稱酸酐，但原位制備仍然是一種不錯的選擇。

碳二亞胺法

碳二亞胺類化合物可用于氨基和羧基的縮合。在該類化合物中N，Nˊ－二環己基碳二亞胺（DCC）相對便宜，而且可溶于肽合成常用的溶劑。在肽鍵形成期間，碳二亞胺轉變為相應的脲衍生物，N，Nˊ－二環己基脲可以從反應液中沉淀出來。顯然，碳二亞胺活化后的活性中間體氨解和水解速率不同，使肽合成能在含水介質進行。經幾個課題組的大量研究，確立了以碳二亞胺為縮合劑的肽縮合反應機理，羧酸根離子加成到質子化的碳二亞胺，形成高活性的O－酰基脲；雖然還沒有分離出這個中間體，但通過非常類似的穩定化合物推斷了它的存在。O－酰基脲與氨基組分反應，產生被保護的肽和脲衍生物。或者，與質子化形式處于處于平衡狀態的O－酰基異脲,被第二個羧酸酯親核進攻，產生對稱的氨基酸酐和N，Nˊ－二取代脲。前者與氨基酸反應得到肽衍生物和游離氨基酸。在堿催化下，使用DCC的副反應使酰基從異脲氧原子向氮原子轉移，產生N－酰基脲71,它不再發生進一步的氨解。不僅過量的堿可催化O－N的酰基轉移，而且堿性的氨基組分或碳二亞胺也可催化該副反應。

另外，極性溶劑有利于這一反應途徑。

多肽合成的多肽的定義

多肽是一種與生物體內各種，它的分子結構介于氨基酸和蛋白質之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的化合物。多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質的總稱，常常被應用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發等領域。
多肽合成服務包括標準化學多肽合成、多肽修飾、多肽文庫以及重組多肽表達。逐步固相多肽合成能合成5-50aa的多肽，對于大于200aa的多肽，通過片段濃縮及連接技術來合成。