石蠟切片的制作步驟
石蠟切片的制作步驟如下：
1、組織包埋。
（1）乙醇脫水：組織經不同濃度的乙醇溶液進行逐級脫水70％、80％、90％、95％、100％、100％，各級乙醇 40min（注意：骨性及鈣化組織需在JYBL-Ⅱ脫鈣液中浸泡24h，待組織軟化后再進行乙醇脫水步驟）；
（2）透明：組織依次浸泡于三個二甲苯中，每缸各1h；
（3）浸蠟：組織依次浸泡于三個石蠟缸中，每缸各1h；
（4）包埋：將液態的石蠟倒入模具盒中，再將浸好蠟的組織塊平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蠟凝固后去掉包埋框，完全冷卻變硬后再修整蠟塊，組織外圍的石蠟保留適中以便切片。
2、切片制作將預冷的蠟塊固定在石蠟切片機上，使蠟塊的切面與刀口成平行方向，刀的傾斜度通常15℃，轉動輪轉推進器，調節切片厚度為 4μm，切成厚度均勻的切片。
左手持毛筆，右手旋動切片機轉把，切片帶出來之后，用毛筆輕輕托起，再用鑷子輕鑷蠟片，以正面放入展片箱中，其水溫 45℃左右。待攤平整后撈片。貼附切片左手持載玻片之一端，垂直入水去附貼切片，右手用鑷子輔助推動，附貼至玻片上的三分之二處。
切片貼附后，放在空氣中稍晾干，放置 65℃烤片機上烤1h，再放置烘箱內烘烤2h。
3、石蠟切片脫蠟至水
依次將石蠟切片放入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-二甲苯Ⅲ10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-50%酒精5min梯度脫蠟。
4、HE染色
石蠟切片入蘇木素染0.5-1分鐘min，自來水漂洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水漂洗，然后1%氨水水溶液返藍1min，流水沖洗數秒，放入伊紅染液中染色數秒，流水漂洗。
5、脫水封片
石蠟切片依次放入75%乙醇 2min -85%乙醇 2min-無水乙醇5min -無水乙醇5min -二甲苯5min 透明，將切片從二甲苯拿出來中性樹膠封片。
6、結果判讀
細胞核為藍色，細胞質為紅色。
石蠟切片制作過程有哪些步驟
石蠟切片的制作過程的步驟包括：
取材，固定，脫水，透明，透蠟，包埋，切片，貼片，染色，透明，封藏等步驟。
具體是：
1．取材
材料的好壞直接影響到切片的質量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。
（1）植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或將動物殺死后迅速取出所需要的組織。
（2）取材必須新鮮，這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要，應該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。
（3）切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。
（4）切取的材料應該小而薄，便于固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm，大小不超過5×5mm2。
2．固定
組織和細胞離開機體后，在一定時間內仍然延續著生命活動，會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態，必須盡早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，并將結構成分轉化為不溶性物質，防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當硬化以便于隨后的處理，還會改變細胞內部的折射系數并使某些部分易于染色。
固定劑的作用對象主要是蛋白質，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時不加考慮，如要觀察這些物質，可用特殊的方法將其固定下來。
3．脫水
生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。
脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。
常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。
4．透明
組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。
透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
5．透蠟和包埋
透蠟須在恒溫箱中進行，恒溫箱的溫度調節至高于石蠟熔點3度，使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理2～3次，透蠟的時間依材料性質而定，一般每次需15～30min。
透明的關鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟凝固無法滲透，溫度過高使組織收縮發脆。
包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是；先準備好紙盒（具體折法見圖1-3及說明），將熔蠟倒入盒內，迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟凝固后立即將紙盒按入水中，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。
包埋用蠟的溫度應略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產生結晶。以后切片時引起碎裂。
6．切片
切片前，將刀口置放大鏡下觀察，選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度，調節時應注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉動轉輪，左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內，注意切片速度不宜太快，搖動轉輪用力應均勻，防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻，還應注意轉動的方向，以防標本臺后移而切不到片子。切片完畢，應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。
石蠟切片制作過程有哪些步驟？
石蠟切片操作步驟：
1、取材
2、固定
3、脫水：30%--50%---70%（每步60分鐘）---85%---95%--100%---100%（每步30鐘）。
4、透明：轉入1/2二甲苯＋1/2無水酒精混合液20ml透明1h，純二甲苯20ml透明1h，再用純二甲苯20ml透明40min，并回收各液。
5、浸蠟：
（1）將材料分別放入25%、50%、75%的石蠟-二甲苯溶液中，每級30分鐘。該過程在高于石蠟熔點3℃的溫箱中進行；
（2）將材料放入溶解的純蠟中，時間為30分鐘，該過程再重復兩次。在高于石蠟熔點3℃的溫箱中進行。
6、包埋
（1）將溶解好的石蠟在加入預先折好的紙船中，石蠟溶解后應過濾后使用，以免含雜質影響切片；
（2）材料放入紙船，并擺好在蠟中的位置，如果包埋的組織塊較多，應進行編號；
（3）將紙船放置在冷水上加速冷卻過程。
7、切片
（1）修整：用刀片修成方形或長方形蠟塊；
（2）以少許熱蠟液，將蠟塊底部粘附于小木塊上，以少許石蠟融化在蠟塊邊緣，加強粘附的強度；
（3）木塊粘附于切片機上，調整切片機，使蠟塊切面與切片刀刃平行；
（4）切成連續的蠟帶，切片刀的銳利度、蠟塊的硬度都會影響切片質量，可用熱水或冷水適當改變石蠟的硬度，也可在冰箱中放置一段時間；
（5）分割蠟帶，分開的蠟片放在45℃溫水上，使蠟片展開。
8、粘片與烤片
（1）可用粘片劑防止蠟片滑脫，但粘附劑通常容易被染色而使切片背景有顏色，影響觀察，實驗表明，載玻片洗的足夠干凈，一般不會滑片；
（2）用載玻片撈取展開后的蠟片，調整蠟片的位置使位于載玻片中央，自然干燥。
9、脫蠟與醇化
（1）將切片放入純二甲苯溶液中10分鐘，使石蠟完全溶解，共2次；
（2）溶去石蠟的切片依次放入75%、50%、25%二甲苯-乙醇溶液中，每級10分鐘；
（3）再將切片依次放入100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%的乙醇溶液中進行醇化，每級10分鐘。
10、染色
（1）將切片放入番紅染液中30分鐘，番紅染色后，將切片依次放入50%、60%、70%、80%的乙醇溶液中分級洗脫，每級10分鐘；
（2）洗脫后的切片放入固綠染液中染色1分鐘；
11、脫水、透明與封片
（1）染色后的切片依次放入90%、90%、95%、100%乙醇溶液中分級洗脫，每級10分鐘；
（2）洗脫后的切片依次放入25%、50%、75%、100%、100%二甲苯溶液中透明，每級10分鐘，出現渾濁表示脫水不徹底，需重來；
（3）滴1-2滴中性樹膠，將潔凈的蓋玻片傾斜放下，封片，鏡檢，選擇好的貼上標簽，性切片制作完成。
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石蠟切片的簡介
石蠟切片（paraffin ction） 組織學常規制片技術中最為廣泛應用的方法。石蠟切片不僅用于觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用于其他許多學科領域的研究中。教學中，光鏡下觀察切片標本多數是石蠟切片法制備的。活的細胞或組織多為無色透明，各種組織間和細胞內各種結構之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區別出；組織離開機體后很快就會死亡和產生組織腐敗，失去原有正常結構，因此，組織要經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞組織死亡，而能清晰辨認其形態結構。
如何制作石蠟切片？
1. 取材：切取一小段需要的組織，組織塊的規格為 3-5mm×3-5mm×10-15mm。
2. 固定：固定液用量一般為組織塊體積的10-20倍。
3. 沖洗：固定12-24小時后，將材料自固定液中取出后，在70%酒精中換洗幾次，可在酒精中加幾滴氨水至洗去黃色為止。
4. 脫水：70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精→無水乙醇Ⅰ（→無水乙醇Ⅱ
5. 透明：無水乙醇與二甲苯溶液（1:1）→二甲苯Ⅰ→二甲苯Ⅱ
6.浸蠟：浸蠟的全過程應在恒溫設備中進行，將恒溫箱調至58℃。
二甲苯與石蠟混合液（1:1）→石蠟Ⅰ→石蠟Ⅱ浸蠟必須徹底，否則組織內殘留透明劑會造成切片過程的困難和影響切片的質量。
7. 包埋：在盒內注入溶化的石蠟，將已浸蠟的組織塊置入其內，使蠟塊迅速冷卻硬固，組織塊在蠟塊中可長期保存。
8. 切片：包埋后的組織塊經修正后，用切片機切成5-7μm的石蠟帶。
9. 粘片：將組織石蠟帶在50攝氏度的溫水中展片，然后用經1%氯化氫溶液處理干凈的載玻片撈片，組織帶即可粘在載玻片上。
10. 烤片：將粘好的載玻片置于35℃左右的溫箱中烤干，待2-3小時。
11. 蘇木精—伊紅染色：將烤干的片進行染色。
石蠟切片制作超詳細步驟
1．取材
頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。
切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2－3mm厚。
注意事項：
（1）取材動作要迅速，不宜拖太久，以免組織細胞的成分、結構等發生變化。
（2）切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。
2．固定
將切好的肝組織用生理鹽水洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定30－50min。
注意事項：
（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成分之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1-2次新液。
（4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外貼上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應的標簽，以免混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，用黑色鉛筆寫。
3.洗滌
材料經固定后,流水沖洗，數小時或過夜。
4.脫水
材料依次經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
注意事項：
（1）脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進行，防止吸收空氣中的水分。
（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。
（3）在低濃度酒精中，每級停留時間不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
（5）如需過夜，應停留在70%酒精中。
（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象
5．透明
純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。
由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。
透明注意事項
（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。
（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應退回純酒精中重新脫水，然后再透明。
6．透蠟
放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。
透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。透蠟應在恒溫箱內進行，并保持箱內溫度在55-60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。一般置于恒溫箱0.5h。
透蠟注意事項
（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；
（3）操作要迅速，盡量在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。
7.包埋
包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。
8.切片
①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。
②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。
③搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。
④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。
⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。
⑥一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40-50r/min為宜。
⑦切成的蠟帶到20-30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。
⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。
⑨切片工作結束后，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。
9.展片、貼片
打開水浴鍋，使水溫維持在40-45℃，另準備30%乙醇溶液。
① 切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。
② 用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。
③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。
④ 另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。
10.脫蠟復水
將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時，將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30min至蠟熔化。
之后，石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。
11.染色
切片放入蘇木精中染色約10-30min。
染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。
12.水洗
用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可），但要注意流水不能過大，以防切片脫落。
13.分化
將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。
14.漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。
15.脫水Ⅰ
切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。
16.復染
用0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min。
伊紅主要染細胞質，著色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易著色，并且經乙醇脫水時不易褪色。
17.脫水Ⅱ
將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。
18.透明
切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。
二甲苯應盡量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。
19.封藏 ：中性樹膠封存
因切片經二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。
封藏的方法：
封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。
染色結果 ：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。
