dnastar(dnastar序列比對(duì))

做過(guò)分子實(shí)驗(yàn)的人都知道，要想做的有效率有質(zhì)量是很苦逼的，1個(gè)月做100個(gè)克隆那都是小ca，沒(méi)點(diǎn)看家的本事怎么行。如果再遇到比較極品的稀有基因，周旋個(gè)把月，那也是家常便飯。下面就和大家分享一些載體構(gòu)建的經(jīng)驗(yàn)，從此邁向科研達(dá)人：

1. 準(zhǔn)備工作

俗話說(shuō)：用欲善其事，必先利其器。建議大家在做構(gòu)建之前先找好工具，效果事半功倍哦。推薦兩個(gè)工具，一個(gè)是oligo軟件，常用于引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析；另一個(gè)是DNAstar軟件，工具極強(qiáng)大，一款全面的生物醫(yī)學(xué)軟件，用作DNA和蛋白質(zhì)序列分析、重疊群拼接和基因工程管理。

插播個(gè)笑話：聽(tīng)說(shuō)隔壁實(shí)驗(yàn)室里有個(gè)學(xué)醫(yī)的學(xué)生來(lái)做課題，很聰明很刻苦，但除了他以外，包括老板在內(nèi)都是生物物理背景，整個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)分子生物就只有一個(gè)粗淺的概念，這個(gè)學(xué)生就想把一個(gè)質(zhì)粒上的基因插到另一個(gè)質(zhì)粒上去，要是我就先查查有沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)，要沒(méi)有就改造一下質(zhì)粒一切搞定，這學(xué)生他不懂啊（要命的是她老板固然牛，對(duì)這方面也不懂），自己辛辛苦苦設(shè)計(jì)了PCR引物去做PCR，P了將近5K的產(chǎn)物去測(cè)序，結(jié)果測(cè)的結(jié)果中間有個(gè)突變，要懂的就找找酶切位點(diǎn)，從原來(lái)的替換上去，然后測(cè)這下這段就行。他呢，又送去了若質(zhì)粒一個(gè)接一個(gè)的測(cè)，他光測(cè)序就要花好幾千（你得佩服她老板真有錢(qián)呀）。這件事教育我們準(zhǔn)備工作是多么重要。

2. 設(shè)計(jì)引物

1) 注重要：看懂質(zhì)粒圖譜！拿大家比較熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。

想用N1質(zhì)粒，設(shè)計(jì)引物就得把下游引物上的中止密碼子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下來(lái)結(jié)果根本不表達(dá)融合蛋白，你就死了；C1質(zhì)粒，注意閱讀框，要是移碼了，你也死了。而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚別弄竄了。一句話，要看懂你的圖譜！

其他需要注意：

設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)時(shí)要加保護(hù)堿基（大家要用T載體就當(dāng)我沒(méi)說(shuō)）;酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)原則：盡量用粘性末端，實(shí)在不行就用一些常用平端酶，如EcoRV和SnaB1等，要是以后還有別的用處就多加點(diǎn)酶切位點(diǎn)，曾一口氣在引物上加了五個(gè)酶切位點(diǎn)以防以后要用到，注意計(jì)算TM值的時(shí)候要減去這些不匹配的序列；注意KOZAK序列的問(wèn)題，很多質(zhì)粒沒(méi)有提供KOZAK序列，這要在設(shè)計(jì)的時(shí)候直接在引物上加好。擅用Gene Overlap，比方說(shuō)加個(gè)flag標(biāo)簽，his標(biāo)簽，my標(biāo)簽之類(lèi)的，直接設(shè)計(jì)三引物overlap一下就可以，省得還要再多構(gòu)建一步，這些都是設(shè)計(jì)引物時(shí)候就要考慮好的。引物長(zhǎng)一點(diǎn)不要緊（我最喜歡兩步法了），尤其是對(duì)GC比高的序列，有時(shí)候引物不長(zhǎng)PCR根本不出結(jié)果，注意如果GC比較高，這個(gè)時(shí)候Gene Overlap就不要做了，很麻煩，克隆很難挑。沒(méi)有合適的酶切位點(diǎn)？很簡(jiǎn)單，用同尾酶策略，比方說(shuō)Bgl2和BamH1，Nhe1和spe1，Xho1和Sal1（注意連上了切不下來(lái)），實(shí)在不行就平端吧。

3. PCR擴(kuò)增

如果沒(méi)有現(xiàn)成的質(zhì)?？晒┟盖?，PCR是最理想也是最方便的策略。目前市面上可選擇的PCR酶實(shí)在太多，每隔一段時(shí)間還會(huì)升級(jí)，正常情況下，高保真的taq酶都能滿足需求。但如果遇到難PCR的高GC基因，可以換不同PCR酶，添加一些 DMSO，甘油等，實(shí)在不行可以考慮Clontech的2 GC rich kit，價(jià)格和實(shí)力都大牛。另外，建議電泳切膠回收純化PCR產(chǎn)物，去除一些非特異性條帶。

4. 酶切

強(qiáng)烈推薦NEB的內(nèi)切酶，記得有一次用別家的酶切過(guò)夜，結(jié)果質(zhì)粒都被切碎了（當(dāng)然當(dāng)時(shí)質(zhì)粒濃度也不高），而用NEB的酶，切個(gè)七十二小時(shí)仍舊一切OK，尤其現(xiàn)在NEB還推出了HF的內(nèi)切酶，沒(méi)有星活性而且統(tǒng)一都用Buffer4。另外TAKARA的酶也還可以。

5. 連接

最常用的是NEB的T4連接酶，很好用，但是注意Buffer里有ATP，反復(fù)凍融ATP失活很快，拿到buffer后就分裝，10uL/管，一次性使用。

載體總量：一般來(lái)說(shuō)，載體濃度在20-100ng/uL較好，太低的話碰撞幾率低，太高的話又會(huì)產(chǎn)生很多非目的克隆，總量從50-100ng就可以，太低失敗幾率很高，太高克隆太多，挑克隆會(huì)很麻煩，反應(yīng)總體積也有講究，體積太大載體和目的片段碰撞幾率太低，而且對(duì)感受態(tài)細(xì)胞也是個(gè)挑戰(zhàn)，通用10-15uL。

載體和插入片段比例：載體和插入片段比例一般是1:7，如果很難連接，比如說(shuō)平端連接，要適當(dāng)提高片段濃度，同時(shí)加大比例1:10。

6. 轉(zhuǎn)化

按照SOP做就行，話說(shuō)實(shí)驗(yàn)室原來(lái)從takara買(mǎi)感受態(tài)（competent cell），后來(lái)發(fā)現(xiàn)還是自己做的效率高（protocol免費(fèi)索?。?。要注意的是LB必須無(wú)菌而且沒(méi)有抗生素，實(shí)驗(yàn)室原來(lái)有個(gè)技術(shù)員，做一次失敗一次，我就奇怪了，后來(lái)才發(fā)現(xiàn)他用的居然是加了kana的LB，直接暈過(guò)去了。

7. 鑒定

想要快速鑒定，建議用菌液PCR，菌液PCR是有一定講究的，很多人做菌液PCR鑒定假陽(yáng)性特多，為什么？因?yàn)槟鉖CR引物選的都在載體上，注意引物必須分別在載體和插入片段上才準(zhǔn)，PCR方法鑒定是極其準(zhǔn)確的，數(shù)百次菌液PCR經(jīng)驗(yàn)。PCR鑒定做起來(lái)也很簡(jiǎn)單，拿個(gè)2mL tube，裝0.5mL 加入相應(yīng)抗生素的LB，搖個(gè)三小時(shí)左后取1uL做模板就行了。如果想更快，直接菌落PCR也不錯(cuò)，效果一樣。

8. 測(cè)序

拿到測(cè)序結(jié)果時(shí)，不僅要核對(duì)序列，還要看測(cè)序峰圖，這很重要。因?yàn)橛袝r(shí)候光看序列對(duì)，實(shí)際上圖顯示的不對(duì)，或者雖然序列結(jié)果不對(duì)，但是圖上出現(xiàn)的峰值本身就很怪異不可信，出現(xiàn)突變也不怕，有很大可能性是簡(jiǎn)并密碼子；

還要重點(diǎn)檢查的地方就是“接頭”的地方，因?yàn)榕紶栆飼?huì)出錯(cuò)，比方說(shuō)少個(gè)堿基什么的，還有時(shí)候酶切之后連接也會(huì)丟一兩個(gè)堿基什么的，如果不仔細(xì)檢查到了后期悔之無(wú)及。

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