凱氏定氮法測定蛋白質含量(凱氏定氮法測定蛋白質含量實驗報告)

凱氏定氮法測定蛋白質含量的基本原理

樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中碳、氫被氧化為CO2和H2O逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨，硫酸銨用NaOH中和生成NH3`H2O，加熱又分解為氨，用硼酸吸收，吸收氨后的硼酸再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定，根據標準酸消耗量計算蛋白質的含量。

國家標準檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測N元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使“蛋白質”含量提高的。

國家標準檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 堿蒸餾采用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至干燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火后，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然后繼續加熱0.5小時。取出并冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然后用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

2.裝好定氮裝置

根據附圖安裝氮固定裝置。 在約2/3的水蒸氣發生器中加入幾滴甲基紅指示劑和幾毫升硫酸以保持水呈酸性。 添加幾個玻璃珠以防止突然沸騰。 蒸汽發生瓶中的水由壓力調節器加熱。

3.向接收瓶內加入試劑

將10ml 2％硼酸溶液和一滴混合指示劑加入到接收瓶中，并將冷凝管的下端插入液面下。將10.0ml樣品消化液從小玻璃吸收到反應室中，用10ml水洗滌小燒杯以流入反應室，并擰緊小玻璃棒玻璃塞。

將10ml 40％氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯中，抬起玻璃塞使其緩慢流入反應室，不能立即將玻璃蓋塞緊，這樣容易使玻璃塞粘在樣品入口處，應先用蒸餾水清洗然后蓋上，并在小玻璃杯中加水以防止泄漏。

夾緊螺旋夾并開始蒸餾。蒸汽進入反應室，氨通過冷凝管進入接收瓶。蒸餾持續5分鐘。移動接收瓶，使冷凝管的下端離開液體容器，然后蒸餾1分鐘，然后用少量水沖洗冷凝管下端的外端。取下接收瓶，將其置于0.05N硫酸或0.05N鹽酸標準溶液中，以灰色或藍紫色為目的地。

擴展資料

除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標準系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

參考資料：食品中蛋白質的測定百度百科

凱氏定氮儀可以測蛋白質含量嗎?

可以。凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣餾出并為過量的酸液吸收，再以標準堿滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。
凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最后有機氮轉變為無機氮硫酸銨，這一過程稱為有機物的消化。為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物氧化。消化完成后，將消化液轉入凱氏定氮儀反應室，加入過量的濃氫氧化鈉，將NH4+轉變成NH3，通過蒸餾把NH3驅入過量的硼酸溶液接受瓶內，硼酸接受氨后，形成四硼酸銨，然后用標準鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復原來的氫離子濃度。滴定消耗的標準鹽酸摩爾數即為NH3的摩爾數，通過計算即可得出總氮量。在滴定過程中，滴定終點采用甲基紅-次甲基藍混合指示劑顏色變化來判定。測定出的含氮量是樣品的總氮量，其中包括有機氮和無機氮。

為什么標準蛋白質必須用凱氏定氮法測定純度

首先，因為蛋白質當中含有氮，而且因為氮的含量與蛋白質的含量幾乎呈線形相關，所以標準蛋白質通常用凱氏定氮法測定純度。

生物材料的含氮量測定在生物化學研究中具有一定的意義，如蛋白質的含氮量約為16％，測出含氮量則可推知蛋白含量。生物材料總氮量的測定，通常采用微量凱氏定氮法。

凱氏定氮法由于具有測定準確度高，可測定各種不同形態樣品等兩大優點，因而被公認為是測定食品、飼料、種子、生物制品、藥品中蛋白質含量的標準分析方法。

擴展資料：

凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。由于蛋白質含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質含量。

參考資料來源：百度百科-凱氏定氮法

凱氏定氮法測定蛋白質中氨基酸含量的主要步驟有哪些

凱氏定氮法只能檢測蛋白質中氮含量，不能檢測氨基酸的含量。其中蛋白質含量也只是稱為粗蛋白質的含量，只是用氮的含量乘以6.25（系數）得出，不是真正的蛋白質的含量。
凱氏定氮法測氮的方法如下：
1、稱取0.5～1g試樣（含氮量5～80mg）準確至0.0002g，無損失地放入凱氏燒瓶中，加入硫酸銅0.9g，無水硫酸鉀（或硫酸鈉）15g，與試樣混合均勻，再加硫酸25ml和2粒玻璃珠，在消煮爐士小心加熱，待樣品焦化，泡沫消失，再加強火力（360～410℃）直至溶液澄清后，再加熱消化15min。
2、氨的蒸餾
（1）常量直接茂餾法 將上述的試樣消煮液冷卻，加蒸餾水200ml，搖勻，冷卻。沿瓶壁小心加入40％氫氧化鈉溶液100ml，立即與蒸餾裝置相連．蒸餾裝置冷凝管的末端應浸入50ml硼酸吸收液lcm。加混合指示劑2滴，輕搖凱氏燒瓶，使溶液混勻，加熱蒸餾，直至餾出液體積約150ml。先將吸收液取下，再停止加熱。
（2）半微量水蒸汽蒸餾法 上述試樣的消煮液冷卻，加蒸餾水20m1轉入100ml容量瓶，冷卻后用水稀釋至刻度，搖勻，為試樣分解液。取2％硼酸溶液20ml，加混合指示劑2滴，使半微量蕉餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液；蒸餾裝置的蒸汽發生器的水中應加甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，且保持此液為橙紅色，否則應補加少許硫酸。準確移取試樣分解液10～20ml注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加10ml40％氫氧化鈉溶液，小心提起玻璃塞使之流入反應室，將玻璃塞塞好，并在入口處加水封密好，防止漏氣，蒸餾4min，使冷凝管末端離開吸收液面，用蒸餾水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液。
3、滴定 用硼酸吸收氨后，立即用0.05mol/L的HCI標準溶液滴定，仍以甲基紅或混合甲基紅為指示劑。
在測定樣本中含氮量的同時，應做一空白對照測定，即各種試劑的用量及操作步驟完全相同，但不加樣本，這樣可以校正因藥品不純所發生的誤差，吸收氨后的吸收液立即用0.05mol/L鹽酸標準溶液滴定，溶液由藍綠色變為灰紅色為終點。
4、空白測定 稱取蔗糖0.0lg，以代替試樣，按上述測定步驟進行空白測定，消耗0.05mol/L鹽酸標準溶液的體積應不得超過0.3ml。
5、計算
N%*6.25=粗蛋白質（%）=（V2-V1）*0.014*6.25*100/m*（V’/ V）
每m1的lmol/L鹽酸標準溶液相當于0.0140g的N。因此，
式中：v2—試樣滴定時所需酸標準溶液的體積（m1）；
v1—空白滴定時所需酸標準溶液的體積(m1)；
c—鹽酸標準溶液的濃度(mol/L)；
m一試樣的質量（g）；
v —試樣的分解液總體積（ml）；
v’—試樣分解液蒸餾用體積（m1）；
0.0140—每ml HCl標準溶液相當于N的克數；
6.25一氮換算成蛋白質的平均系數。
每個試樣取兩個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。 當粗蛋質含量在25％以。上，允許相對偏差為1％；當粗蛋白質含量在l0％～25％時，允許相對偏差為2％；當粗蛋白質含量在10％以下時，允許相對偏差為3％。