蛋白純化步驟(蛋白純化流程)

蛋白質(zhì)純化的程序

分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級、細(xì)分級三步。
前處理
分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。為此，動物材料應(yīng)先剔除結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免受單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⒔M織和細(xì)胞破碎。動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較麻煩，因?yàn)檎麄€細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。
粗分離
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒?，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。
細(xì)分離
樣品經(jīng)粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。
結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過程中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。
離子層析法
蛋白純化離子交換層析法有劑和離子交換劑當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。
有機(jī)溶劑提取
蛋白質(zhì)純化有機(jī)溶劑提取的原理是:與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下,引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同,因此,控制有機(jī)溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì)。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白。由于在室溫下,有機(jī)溶劑不僅能引起蛋白質(zhì)的沉淀,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機(jī)溶劑冷卻,然后在不斷攪拌下加入有機(jī)溶劑防止局部濃度過高,蛋白質(zhì)變性問題就可以很大程度上得到解決。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中極性側(cè)鏈較多、不溶于水的蛋白質(zhì),可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑提取,它們有一定的親水性和較強(qiáng)的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是WHO規(guī)程和中國生物制品規(guī)程推薦的方法,不僅分辨率高、提純效果好、可同時(shí)分離多種成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用。

蛋白質(zhì)分離純化的四種方法

1、鹽析法：

鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。

2、有機(jī)溶劑沉淀法：

有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。

3、蛋白質(zhì)沉淀劑：

蛋白質(zhì)沉淀劑僅對一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。

4、聚乙二醇沉淀作用：

聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。

擴(kuò)展資料：

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動的主要承擔(dān)者。沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。

機(jī)體中的每一個細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.6~12kg。

人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。

參考資料來源：百度百科-蛋白質(zhì)分離純化

蛋白過鎳柱純化的原理和步驟是什么

Ni柱中的氯化鎳可以與有HIs（組蛋白）標(biāo)簽的蛋白結(jié)合，也可以與咪唑結(jié)合。
步驟是：過柱子前可以選擇Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化鎳，一個柱長體積就行了，然后平衡柱子，拿你自己的buffer，給蛋白提供最適的環(huán)境，我一般平衡4個柱長，然后蛋白上樣，你可以讓他自己掛，這樣掛柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加個恒流泵，但是一定不能太快，太快掛柱效果差，當(dāng)然你也可以選擇循環(huán)掛柱，就是恒流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯，從柱子中留下來的液體還用同一個燒杯接回去。掛完之后，按理想來講，你的蛋白在Ni柱中與Ni就結(jié)合了，雜蛋白多數(shù)在燒杯里，留下來了，當(dāng)然肯定有少量雜蛋白也掛上了，這時(shí)候你要梯度洗脫，拿咪唑和你的buffer配，一般從0
20mM
40mM。。。。100mM這樣洗脫（當(dāng)你不知道你的蛋白大概在什么時(shí)候出來的時(shí)候）我指的是咪唑的終濃度。咪唑加入之后，會和蛋白爭奪與Ni的結(jié)合位點(diǎn)，雜蛋白、你的目的蛋白，會在不同的濃度被洗脫下來，洗完之后，你可以用200mM咪唑洗柱子，清理一切蛋白，然后平衡幾次，是否選擇重生你自己定咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~
過的蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page檢測在哪個管子里。
這是我的經(jīng)驗(yàn)，樓主可以多方面參考下別人的。喜歡推薦我的答案哦，~\(≧▽≦)/~

蛋白質(zhì)的純化實(shí)驗(yàn)

不發(fā)生電泳現(xiàn)象，蛋白質(zhì)粒子帶負(fù)電荷，在電場中向負(fù)極移動，蛋白質(zhì)粒子帶正電荷；在等電點(diǎn)偏堿性溶液中，在電場中向正極移動，可以將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)電泳(Electrophoresis).蛋白質(zhì)的分離純化的一般原則
①高回收率
②高純度
③高活性
④方便與快捷
⑤經(jīng)濟(jì)
蛋白質(zhì)的分離純化的一般步驟
①前處理
②粗分
③細(xì)分
④結(jié)晶
蛋白質(zhì)沉淀方法
①鹽析法
②等電點(diǎn)沉淀法
③有機(jī)溶劑沉淀法
④非離子型聚合物沉淀法
⑤聚電解質(zhì)沉淀法
⑥高價(jià)金屬離子沉淀法
2
根據(jù)分子大小不同的純化方法
①透析與超過濾
②密度梯度離心
③凝膠過濾
3
根據(jù)電荷不同的純化方法
在不同的pH環(huán)境下1。利用蛋白質(zhì)的電泳現(xiàn)象。
蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)pH條件下。在等電點(diǎn)偏酸性溶液中，蛋白質(zhì)的電學(xué)性質(zhì)不同

蛋白質(zhì)分離純化的5種方法主要有什么?

蛋白質(zhì)分離純化常用方法有：
1、沉淀,
2、電泳：蛋白質(zhì)在高于或低于其等電點(diǎn)的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負(fù)極移動.根據(jù)支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等.
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法.
4、層析：
a.離子交換層析,利用蛋白質(zhì)的兩性游離性質(zhì),在某一特定PH時(shí),各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同,故可以通過離子交換層析得以分離.如陰離子交換層析,含負(fù)電量小的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來.
b.分子篩,又稱凝膠過濾.小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi),滯留時(shí)間長,大分子蛋白質(zhì)不能時(shí)入孔內(nèi)而徑直流出.
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋白質(zhì)的分子量.不同蛋白質(zhì)其密度與形態(tài)各不相同而分開.

蛋白質(zhì)分離純化主要方法?

分離純化某一特定蛋白質(zhì)的一般程序可以分為前處理、粗分級、細(xì)分級三步。
1.前處理：分離純化某種蛋白質(zhì)，首先要把蛋白質(zhì)從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來并保持原來的天然狀態(tài)（如果做不到呢？比如蛋白以包涵體形式存在），不丟失生物活性。為此，動物材料應(yīng)先提出結(jié)締組織和脂肪組織，種子材料應(yīng)先去殼甚至去種皮以免手單寧等物質(zhì)的污染，油料種子最好先用低沸點(diǎn)（為什么呢）的有機(jī)溶劑如乙醚等脫脂。然后根據(jù)不同的情況，選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，將組織和細(xì)胞破碎。動物組織和細(xì)胞可用電動搗碎機(jī)或勻漿機(jī)破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ɑ蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較麻煩，因?yàn)檎麄€細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一個借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎細(xì)菌細(xì)胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細(xì)胞破碎后，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液把所要的蛋白提取出來。細(xì)胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細(xì)胞組分，如細(xì)胞核、染色體、核糖體或可溶性細(xì)胞質(zhì)等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細(xì)胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細(xì)胞膜或膜質(zhì)細(xì)胞器結(jié)合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結(jié)構(gòu)解聚，然后用適當(dāng)介質(zhì)提取。
2. 粗分級分離：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取液（有時(shí)還雜有核酸、多糖之類）獲得后，選用一套適當(dāng)?shù)姆椒ǎ瑢⑺牡鞍着c其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點(diǎn)沉淀和有機(jī)溶劑分級分離等方法。這些方法的特點(diǎn)是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法進(jìn)行濃縮。
3.細(xì)分級分離：樣品經(jīng)粗分級分離以后，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進(jìn)一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時(shí)還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電點(diǎn)聚焦等作為最后的純化步驟。用于細(xì)分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。
結(jié)晶是蛋白質(zhì)分離純化的最后步驟。盡管結(jié)晶過程并不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數(shù)量上占有優(yōu)勢時(shí)才能形成結(jié)晶。結(jié)晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結(jié)晶又可除去少量夾雜的蛋白。由于結(jié)晶過程中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白，因此蛋白的結(jié)晶不僅是純度的一個標(biāo)志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標(biāo)。
蛋白質(zhì)分離純化的方法：
一、根據(jù)分子大小不同的純化方法
1、透析和超過濾
2、密度梯度離心
3、凝膠過濾
二、利用溶解度差別的純化方法
1、等電點(diǎn)沉淀和pH控制
2、蛋白質(zhì)的鹽析和鹽溶
3、有機(jī)溶劑分級分離法
4、溫度對蛋白質(zhì)濃度的影響
三、根據(jù)電荷不同的純化方法
1、電泳
2、聚丙烯酰胺凝膠電泳
3、毛細(xì)管電泳
4、等電聚焦
5、層析聚焦
6、離子交換層析
四、利用選擇性吸附的純化方法
1、羥磷石灰層析
2、疏水作用層析
五、利用配體的特異生物學(xué)親和力的純化方法
親和層析（affinity chromatography）：
a.凝集素親和層析
b.免疫親和層析
c.金屬螯合層析
d.染料配體層析
e.共價(jià)層析
六、高效液相層析合快速蛋白質(zhì)液相層析