定量分析方法

定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

定量分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證

定量分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的含量測(cè)定方法適合于相應(yīng)分析要求，在進(jìn)行定量分析方法學(xué)研究或起草藥品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，分析方法需經(jīng)驗(yàn)證。

驗(yàn)證內(nèi)容有：線性、范圍、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性和重現(xiàn)性）、檢測(cè)限、定量限和耐用性等。

一，線性

線性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與試樣中被測(cè)物質(zhì)濃度直接呈正比關(guān)系的程度。

應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系。可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，制備一系列供試品的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備五

份供試樣品；以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)對(duì)被測(cè)物濃度作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響

應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算。回歸方程的相關(guān)系數(shù)(r)越接近于1，表明線性關(guān)系越好。

用UV法測(cè)定時(shí)，以對(duì)照品配制一定濃度范圍的對(duì)照品系列溶液，吸光度A一般在0.3～0.7，濃度點(diǎn)n＝

5，用濃度C對(duì)A作線性回歸，得一直線方程，方程的截距應(yīng)接近于零，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)大于0.9999。

用HPLC法測(cè)定時(shí)，以對(duì)照品配制一定濃度范圍的對(duì)照品系列溶液，濃度點(diǎn)n＝5～7，用濃度C對(duì)

峰高h(yuǎn)或峰面積A或被測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比進(jìn)行線性回歸或非線性擬合（如HPLC-ELSD），建立方程，

方程的截距應(yīng)趨于零，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)大于0.999。

線性關(guān)系的數(shù)據(jù)包括相關(guān)系數(shù)、回歸方程和線性圖。

二，范圍

范圍系指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性，測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的區(qū)間。

范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作

用的成分，其范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。

三，精確度

準(zhǔn)確度系指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的

范圍內(nèi)測(cè)試。用于定量測(cè)定的分析方法均需做準(zhǔn)確度驗(yàn)證。

1.測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

可用已知純度的對(duì)照品做加樣回收率測(cè)定，即于已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的

被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。

在加樣回率收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的

對(duì)照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對(duì)誤差，過大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

回收率%=[(C-A)/B]*100%

式中，A為供試品所含被測(cè)成分量；B為加入對(duì)照品量；C為實(shí)測(cè)值。

2.數(shù)據(jù)要求

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度的供試品，用6個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制

備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用9個(gè)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，一般中間濃度加入量與所取供試品含量之比控制在l∶1

左右，其他兩個(gè)濃度分別約為供試品含量的80%和120%。應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入

量、測(cè)定結(jié)果和回收率(％)計(jì)算值，以及回收率(％)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)或可信限。

四，精密度

精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間接近的程度。

1.精密度的表示方法

氣相色譜法和高效液相色譜法是對(duì)同一供試液進(jìn)行至少五次以上的測(cè)定；精密度一般用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative

standarddeviation,RSD)表示：RSD=標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均值′100％

精密度報(bào)告的數(shù)據(jù)應(yīng)包括平均值、可信限及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

一般在一天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為日內(nèi)精密度(inter-dayvariability)；在三天之內(nèi)進(jìn)行的精密度考察稱為

日間精密度(intra-dayvariability)。

有時(shí)為了考察隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響，還需設(shè)計(jì)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)，變動(dòng)因素包括不同日期、不同分

析人員和不同設(shè)備。

2.重復(fù)性（repeatability）

是指在同一條件下對(duì)同一批樣品，從樣品供試品液制備開始，制備至少六份以上供試品溶液(即n>6),或設(shè)計(jì)

3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度各分別制備3份供試溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其含量的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。RSD

一般應(yīng)根據(jù)樣品含量高低、含量測(cè)定方法和繁簡(jiǎn)進(jìn)行制訂，如含量很低一般不大于5％；如含量較高，則應(yīng)從嚴(yán)要

求。

3.重現(xiàn)性（reproducibility）

是指在不同的實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。

如建立藥典分析方法時(shí)，通過協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)及重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重

現(xiàn)性試驗(yàn)樣品本身的質(zhì)量均勻性和儲(chǔ)存運(yùn)輸中的環(huán)境影響因素，以免影響重現(xiàn)性結(jié)果。

五，檢測(cè)限

檢測(cè)限是指試樣中被測(cè)物質(zhì)能被檢測(cè)出的最低濃度或量。檢測(cè)限是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，即反映方法與儀器

的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低。它無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)

定的濃度或量即可。根據(jù)所采用的分析方法來(lái)確定檢測(cè)限。

當(dāng)用GC和HPLC法時(shí)，可用已知低濃度樣品測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠

地檢測(cè)出的最低濃度或量。一般以S/N＝2或S/N＝3時(shí)的相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。

檢測(cè)限的報(bào)告數(shù)據(jù)應(yīng)附圖譜，說明測(cè)試過程和檢測(cè)限結(jié)果。

六，定量限

定量限是指樣品中被測(cè)物質(zhì)能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具有一定準(zhǔn)確度和精密度。常用信噪比法測(cè)

定定量限。一般以S/N＝10時(shí)相應(yīng)的濃度或注入儀器的量進(jìn)行確定。

七，耐用性

耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為使方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始

研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明。典型的變動(dòng)因素有：被測(cè)溶液

的穩(wěn)定性，樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有：流動(dòng)相的組成比例或pH值，不同廠牌或不

同批號(hào)的同類型色譜柱，柱溫，流速及檢測(cè)波長(zhǎng)等。氣相色譜法變動(dòng)因素有：不同廠牌或批號(hào)的色譜柱、固定相，

不同類型的擔(dān)體，柱溫，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。薄層色譜的變動(dòng)因素有：不同廠牌的薄層板，點(diǎn)樣方式及薄層展

開時(shí)溫度及相對(duì)濕度的變化等。

經(jīng)試驗(yàn)，應(yīng)說明小的變動(dòng)能否通過設(shè)計(jì)的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，以確保方法有效。