Azan

(大鼠心肌缺血再灌注兩種不同TTC染色方法的比較

李糧輝1，陳文華1，鄭宏2

（1.福建醫科大學附屬協和醫院麻醉科，福州，350001；2.南京

軍區福州總醫院麻醉科，福州，350025）

【摘要】目的：比較應用不同2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法對大

鼠心肌缺血再灌注損傷后梗死面積的檢測效果。方法：將20只SD大鼠(雄性、8

周齡，體重250～300g)按隨機數字表法分為兩組，每組10只，A組：傳統TTC

染色法組，B組：改進后的TTC染色法組，分別進行大鼠心肌染色,隨后計算心

肌梗死面積及測定血清cTnI濃度水平。結果：A組和B組均能較好地標記梗死

心肌;A組和B組心肌梗死面積百分比無統計學差異（48.69±5.37%VS

47.41±3.28%，P>0.05）；A組和B組血清cTnI濃度水平無統計學差異

（4.51±0.88ng/mlVS4.70±0.71ng/ml，P>0.05）；但B組心肌切片染色色澤

對比度及心肌非梗死區與梗死區區分度均高于A組。結論：改進后的心肌TTC

染色法采用在體染色，不僅操作簡便，節省了實驗時間和經費，而且提高了染色

效果，能更準確地反映心肌缺血再灌注損傷的程度。因此改進后的心肌TTC染色

法是一種經濟、簡便、快捷、高效的染色方法。

【關鍵詞】缺血再灌注;心肌梗死面積;2，3，5-氯化三苯基四氮唑;染色

AComparisonofTwoDifferentTTCStainingMethodsforIschemia-

reperfusionMyocardiuminRats

LILiang-hui1，CHENWen-hua1，ZHENGHong2

(mentofAnesthesiology,Fujianmedicineuniversityaffiliated

xiehehospital,Fuzhou350001,China;DepartmentofAnesthesiology,Fuzhou

generalhospitalofNanjingmilitarycommand,Fuzhou350025,China)

【Abstract】ObjectiveTocomparethedifferentTTCstainingmethods

ofmeasuringmyocardialinfarctsizeafterischemia-reperfusioninrats.

Methods20Ratswererandomlydividedintotwogroupsincludinggroup

AwithtraditionalTTCdyeingmethodandgroupBwiththemodifiedTTC

?

作者簡介：李糧輝(1990-)，女，碩士，研究方向：心肌保護，E-mail:huixiaoyi68@163

通訊陳文華，男，教授、研究生導師，E-mail:whc6202@163

dyeingmethodforischemia-reperfusionmyocardium,theninfractsizewas

s

BothgroupAandgroupBdetectedtheinfarctedmyocardiumwell;therewere

nosignificantdifferenceinthemyocardialinfarctsizebetweengroup

AandgroupB（48.69±5.37%VS47.41±3.28%，P>0.05）;therewereno

significantdifferenceinthelevelsofrumcTnIbetweengroupAand

groupB（4.51±0.88ng/mlVS4.70±0.71ng/ml，P>0.05）;butcomparewith

A,thecolourcontrastofdyedmyocardialsliceandthedifferentiation

ofinfarctionareaandnon-infarctionareaweremuchcleareringroupB.

ConclusionsThemodifiedTTCdyeingmethodusingInvivostainingisa

kindofeconomic,convenient,fastandefficientmethodwithbeingeasy

tocontrol,savingexperimentaltimeandexpen,improvingthedyeing

effects,evaluatingthesizeofmyocardialischemia/reperfusioninjury

moreaccurately.

【Keywords】ischemia/reperfusion；myocardialinfarctsize；

2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride；staining

心肌缺血再灌注損傷是近十幾年來醫學界研究的熱點之一,其重要的病理特

征之一是出現心肌梗死區。而心肌梗死面積是評價心肌缺血再灌注損傷的一個重

要指標[1-3]。2，3，5-氯化三苯基四氮（2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride，

TTC）染色法常用于估計心肌梗死面積[4]。傳統經典的TTC心肌染色方法是在心肌

取材后進行離體心肌的TTC染色，但因受體外各種條件的影響較大，染色結果常

不盡如人意[5]。我們在實驗過程中，對傳統TTC染色方法進行了改進，本研究通

過改進后的TTC染色方法和傳統TTC染色方法的比較來探討TTC染色方法的改進是

否對于大鼠缺血再灌注心肌梗死區的識別度有所提高，以期得到更好的TTC染色

方法。

1材料和方法

1.1動物及分組

清潔級SD大鼠20只，雄性，8周齡，體重250g～300g，由上海斯萊克實驗動

物有限責任公司提供(SCXK滬2012-0005)，實驗操作地址：福建醫科大學附屬協

和醫院心血管內科實驗室。按隨機數字表法將大鼠分為2組，每組10只，A組：傳

統TTC染色法組，B組：改進后的TTC染色法組。

1.2實驗材料和器材

10%水合氯醛注射液（福建醫科大學附屬第一醫院試劑，批號：120419）；

37%～40%甲醛溶液（上海天蓮精細化工，批號：20090610）；磷酸鹽（PBS）緩

沖液（福州中杉金橋生物技術，批號：20120918）；EVANS’Blue粉劑（美國Sigma

公司，批號：00281342）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）粉劑（美國Amersco

公司，批號：00332543）；手術器械一套（上海醫療器械廠）；小動物呼吸機

（TKR-200C型，江西特力麻醉呼吸設備公司）；圖形分析軟件ImageProPlus

V6.0(美國MediaCybernatics公司）；數碼攝像機（LX5型，松下電器（中國））

1.3大鼠心肌缺血再灌注損傷模型的建立

用10%水合氯醛溶液3.5ml/kg腹腔注射麻醉，取仰臥體位固定四肢和牙齒。

參考文獻[6-8]的方法，將5個電極針分別插入大鼠的四肢皮下和胸骨體下緣平面

與腋前線交匯處皮下，溫控探頭監測大鼠肛溫，術中重點觀察V5、I、II、III

導聯心電圖。并行股靜脈和頸動脈置管。參考文獻[9][10]的方法并改進，用20G

靜脈留置針充當氣管導管在大鼠氣管環甲膜處行環甲膜穿刺置套管外接小動物

呼吸機，行機械通氣（通氣頻率為60次/分，吸呼比為1：1.5）。取左側第四肋

間開胸，剝離心包，在左心耳下方約2mm處用眼科小圓針5/0線穿過左冠狀動脈

前降支（LAD）下方,可逆性結扎左冠狀動脈前降支（LAD），肢體導聯或胸導聯心

電圖出現ST段抬高0.2mV以上或者出現增高增寬的QRS波，說明結扎LAD成功。

心肌缺血45min后松開結扎線恢復灌注，逐層縫合、拔除股靜脈和頸動脈處置管，

待大鼠開始蘇醒后拔除氣管留置套管，大鼠放歸清潔新籠舍。

1.4血清CtnI測定

24hr后為再灌注結束時間，大鼠10%水合氯醛溶液3.5ml/kg腹腔注射麻醉，

剪開腹腔，用2ml注射器從下腔靜脈抽取約2ml血液，裝入離心管，低溫高速離

心機離心15min，轉速3000r/min。將離心分離后的血清分裝入新的離心管內，

密封，標記，采用全自動生化儀（BeckmanDxC800）檢測血清CtnI濃度。

1.5染色方法

A組參考文獻[11]按照傳統染色方法染色：大鼠心肌缺血再灌注結束時開胸，

由下腔靜脈取血2ml后重新原位結扎大鼠LAD，從大鼠下腔靜脈注射1%伊文思藍

溶液2ml，取出心臟，經-70℃冰箱速凍15min后取出，垂直心臟長軸切取5片

厚度約1mm心肌片，立即用二片玻片夾住，輕輕展平以防止皺縮，將5片心肌切

片一起放入1%TTC-PBS溶液中37℃恒溫避光水浴15min,隨后放入10%福爾馬林

溶液中固定12h。

B組采用改進后的染色方法：大鼠心肌缺血再灌注結束時開胸，由下腔靜脈

取血2ml后從大鼠下腔靜脈處緩慢注射1%TTC溶液共計1ml，然后原位結扎大鼠

LAD，再從大鼠下腔靜脈注射1%伊文思藍溶液2ml，當大鼠口唇變藍時，取出心

臟，用生理鹽水沖洗多余染料，用吸水濾紙吸干多余水分，經-70℃冰箱速凍

15min后取出。快速以垂直心臟長軸的角度，從心尖到結扎結處平行切取心肌，

心尖端的一點心肌棄之不用，剩下部分均勻切成5片，每片厚度約1mm。不進行

TTC溶液水浴和福爾馬林溶液固定。

1.6心肌梗死面積測定

染色完成后，數碼相機拍攝心肌切片圖像,經過Image-proPlusV6.0圖像

處理軟件分析計算出梗死區面積（Infactsize,IS）和缺血區（Areaatrisk,AAR）

的比值，即可計算出心肌梗死面積百分比（IS/AAR%）。

1.7統計學分析

數據采用SPSS13.0統計軟件進行分析，計量資料采用均數±標準差（

x

±s）

來表示，計量資料均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，組間比較采用t檢驗，

P<0.05為差異有統計學意義。

2實驗結果

2.1心肌梗死面積百分比（IS/AAR%）

A組心肌切片染色色澤對比度較低，心肌非梗死缺血區染色多呈灰紅色，梗

死區多呈現灰黃色，心肌非梗死缺血區和梗死區區分度較差，不便于計算機圖形

軟件識別處理計算（圖1）。B組心肌切片染色色澤對比度較高，心肌非梗死缺血

區染色多呈明顯的磚紅色，梗死區多呈現黃白色，心肌非梗死缺血區和梗死區區

分度較好，便于計算機圖形軟件識別處理計算（圖2）。A組心肌梗死面積

（48.69±5.37）%，B組心肌梗死面積（47.41±3.28）%；二組心肌梗死面積無

統計學差異（P>0.05）。見圖3所示。

2.2血清cTnI濃度

A組血清cTnI濃度為4.51±0.88ng/ml，B組血清cTnI濃度為

4.70±0.71ng/ml；二組血清cTnI濃度差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

圖3心肌梗死面積百分比

Fig.3thepercentageofmyocardialinfarctsize

圖4大鼠血清cTnI濃度

Fig.4thelevelsofrats’rumcTnI

3討論

氯化三苯基四氮唑(TTC)染色是一種用來檢測實驗動物心臟梗死面積最常

見的染色方法[12]。因其染色后顏色較易觀察且靈敏性高而被廣泛用于狗、大鼠、

貓、豬的心肌或腦組織缺血模型梗死面積的評估[13-18]。其原理是TTC(2，3，5-

氯化三苯基四氮唑）是生物呼吸鏈中吡啶核苷結核酶系統的質子受體，它與非梗

死組織中的脫氫酶反應產生紅色的甲贊（fromazan）[19]，而梗死組織內脫氫酶活

性下降，不能反應，故不會產生變化呈蒼白色[20-21]。

以往文獻[5][22]中的TTC心肌染色法通常為傳統的染色法，其大致步驟為先進

行Evansblue的心肌非缺血區染色并心肌取材，后在冰箱里速凍，然后再進行心

肌切片，接著在37℃恒溫的水浴箱內進行TTC染色，最后在放入福爾馬林溶液中

固定。改進后的TTC染色方法則是先進行大鼠在體的心肌TTC染色，然后再進行

Evansblue的染色，直接取心臟冷凍后切片，無需水浴步驟和福爾馬林固定。前

者步驟為Evansblue染色-取心臟-心肌冷凍后切片-水浴和TTC染色-福爾馬林固

定，而后者步驟為在體TTC染色和Evansblue染色-取心臟-心肌冷凍后切片，顯

然后者簡單方便。

傳統的染色法是利用37℃水浴模擬動物存活時的體溫進行TTC染色。但是，

水浴溫度無法完全等同于動物存活時的體溫，而且，在進行TTC染色前需要經過

Evansblue染色和心肌速凍，可能使心肌中的脫氫酶部分失活，導致體外環境中

脫氫酶活性通常難以達到在體的水平；另外，水浴只能通過TTC滲透心肌切片表

面來反應，反應相對較慢，TTC染色過程容易受到已染的Evansblue染色劑的影

響，還需要福爾馬林固定來增加染色對比度；此外，在冰凍后水浴過程中，心肌

組織往往會過度皺縮導致不夠平整。這些因素都影響了TTC染色的效果。改進后

的TTC染色采用的是在體TTC染色，反應溫度恒定，而且，先在體TTC染色后Evans

blue染色和心肌速凍，不影響脫氫酶的水平和活性，TTC通過血液循環迅速地與

活體心肌中的脫氫酶起反應，不受Evansblue染色劑的影響，提高了染色效果，

也節約了大量的實驗時間。本研究中可見，A組心肌切片染色色澤對比度較低，

心肌非梗死缺血區染色多呈灰紅色，梗死區多呈現灰黃色，心肌非梗死缺血區和

梗死區區分度較差；B組心肌切片染色色澤對比度較高，心肌非梗死缺血區染色

多呈明顯的磚紅色，梗死區多呈現黃白色，心肌非梗死缺血區和梗死區區分度較

好。動物的心肌缺血再灌注實驗往往會涉及到具有心肌保護作用的藥物，而使用

心肌保護藥物處理后的動物，心肌梗死面積往往縮小，而且不同藥物濃度梯度的

亞組間梗死面積往往也有所不同但差異比較小。如果此時仍然采用傳統TTC染色，

往往因為染色效果不佳而影響各個藥物亞組間的對比，增加實驗誤差，所以采用

改進后的TTC染色法，可以提高藥物各亞組染色效果，進一步減少實驗誤差。

血清cTnI是衡量大鼠心肌損傷的敏感性指標。本研究比較了A組和B組的血清

cTnI，顯示兩組之間血清cTnI差異無統計學意義。可見改進后的TTC染色方法對

大鼠的心肌損傷不影響，也間接說明了不同的TTC染色方法因其染色效果的好壞

可以影響到實驗結果的判定，甚至可能導致實驗誤差增大。

傳統TTC染色由于需要進行心肌切片的浸沒后的TTC水浴，所以通常需要

10-20ml的TTC溶液，而改進后的TTC染色法只要在體注射非常少量的TTC溶液即

可，節約了TTC用量進而節約實驗經費。

綜上所述，改進后的心肌TTC染色法操作簡便，節省了實驗時間和經費，提

高了染色效果，能更準確地反映心肌缺血再灌注損傷的程度，是一種經濟、簡便、

快捷、高效的染色方法。

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圖1A組n=10，心肌非梗死缺血區圖2B組n=10，心肌非梗死缺血區

染色多呈灰紅色，梗死區多呈現灰黃染色多呈明顯的磚紅色，梗死區多呈

色現黃白色

Fig.1GroupAn=10，ThecolourofFig.2GroupBn=10，Thecolourof

non-infarctionareaisred-gray，non-infarctionareaisbrick-red，

ThecolourofinfarctionareaisThecolourofinfarctionareais

yellow-grayyellowish-white

圖1、圖2心肌EVANS’BLUE-TTC染色對比

Figure1、Figure2TocomparemyocardialstainingwithEVANS’BLUE

andTTCbetweengroupAandgroupB