抗凍蛋白

1期·1·

收稿日期：2021-01-04

基金項目：廣西科技重大專項（桂科AA17204028）；西藏農(nóng)牧科學(xué)院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室

開放項目（XZNKY-2020-C-007K05）

第一作者：賈銀海（1977-），/0000-0002-5411-3620，博士，高級畜牧師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，

E-mail：****************

基于TMT蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析牦牛

抗凍差異蛋白

賈銀海1，張成福2，張強(qiáng)2，姬秋梅2，黃光云1，姜輝2，文信旺1，

黃明光1，彭夏云1，吳柱月1

（1廣西畜牧研究所/廣西家畜遺傳改良重點實驗室，南寧530001；2西藏農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/

省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，拉薩850000）

摘要：【目的】從蛋白水平闡明牦牛抗寒性能機(jī)理，并進(jìn)一步從營養(yǎng)學(xué)角度提高其代謝性能，為牦牛有效抵御外界

惡劣氣候條件提供科學(xué)依據(jù)。【方法】應(yīng)用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)對寒冷季節(jié)（1月）和溫暖季節(jié)（8月）的牦牛抗凍蛋白進(jìn)

行挖掘，并對鑒定到的牦牛抗凍蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、GO功能富集、KEGG信號通路注釋、蛋白相互作用等

生物信息學(xué)分析。【結(jié)果】從牦牛耳組織中共鑒定獲得21856個肽段（Peptide），其中特有肽段（Uniquepeptide）序列為

18452個，定量獲得4519個蛋白，最終篩選出144個差異蛋白，其中上調(diào)蛋白89個、下調(diào)蛋白55個。144個牦牛抗凍差異

蛋白亞細(xì)胞定位到7個條目上，分別是細(xì)胞核蛋白56個、細(xì)胞質(zhì)蛋白51個、質(zhì)膜蛋白24個、細(xì)胞外蛋白23個、線粒體蛋

白18個、細(xì)胞骨架蛋白1個和溶酶體蛋白1個；共鑒定到194個結(jié)構(gòu)域。GO功能富集分析結(jié)果顯示，生物過程主要富集

到細(xì)胞過程蛋白79個、代謝過程蛋白70個和生物調(diào)控蛋白42個等，分子功能主要富集到結(jié)合功能蛋白75個和催化活

性蛋白64個等，細(xì)胞組分主要富集到細(xì)胞部分蛋白89個和細(xì)胞蛋白89個等。144個牦牛抗凍差異蛋白在KEGG數(shù)據(jù)

庫中注釋到205條KEGG信號通路，主要涉及核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動物體內(nèi)生熱作用、氧化磷酸化、白細(xì)胞

介素-17及鈣離子信號等通路。牦牛抗凍差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)L8IHE5的關(guān)聯(lián)度最高，且冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合

蛋白（CIRP）和HSP70結(jié)合蛋白在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中具有更多的相互作用關(guān)系。【結(jié)論】基于TMT蛋白組學(xué)對牦牛

抗凍差異蛋白進(jìn)行挖掘，結(jié)果鑒定獲得144個抗凍差異蛋白（上調(diào)蛋白89個，下調(diào)蛋白55個），其中CIRP和HSP70在冷

應(yīng)激條件下呈上調(diào)趨勢，能促使牦牛肌體適應(yīng)低溫環(huán)境，可作為牦牛抗凍性育種的候選分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：牦牛；TMT蛋白組學(xué)；生物信息學(xué)；抗凍性；差異蛋白

中圖分類號：S823.85文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2022）01-0001-11

優(yōu)秀青年學(xué)者論壇

賈銀海（1977-），博士，高級畜牧師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研

究工作。先后主持或參與完成國家重點研發(fā)計劃項目、中國科學(xué)院科技

援藏項目、中國科學(xué)院科技援疆項目、中國科學(xué)院科技支黔工程、云南省

科技計劃項目、廣西科技重大專項等40余項，在家畜（肉牛、肉羊、牦牛及

奶牛）等品種上開展了應(yīng)激調(diào)控機(jī)制、營養(yǎng)代謝調(diào)控機(jī)制、胚胎工程技術(shù)

和生態(tài)養(yǎng)殖等基礎(chǔ)研究工作。榮獲云南省科技進(jìn)步獎二等獎2項，廣西

科技進(jìn)步獎三等獎1項，昆明市科技進(jìn)步獎二等獎1項，昆明市科技進(jìn)步

獎三等獎1項及廣西南寧市科技成果登記10項；獲授權(quán)專利18項，出版專

著1部；在《Gene》《FrontiersinGenetics》《中國畜牧獸醫(yī)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報》

等國內(nèi)外權(quán)威學(xué)術(shù)期刊發(fā)表科技論文60余篇。

南方農(nóng)業(yè)學(xué)報JournalofSouthernAgriculture2022，53（1）：1-11ISSN2095-1191；CODENNNXAAB

DOI：10.3969/.2095-1191.2022.01.001

53卷南方農(nóng)業(yè)學(xué)報·2·

0引言

【研究意義】牦牛具有很強(qiáng)的抗逆能力，屬于世

界第三大極地動物，是當(dāng)今世界未被污染的三大物

種（北極熊、企鵝和牦牛）之一。青藏高原的牦牛數(shù)

量占全球牦牛總量的90%以上。據(jù)統(tǒng)計，2018年青

藏高原1.2億ha的高寒草場上約有1600萬頭牦牛，是

世界上重要的牦牛資源庫和主要生產(chǎn)基地（郝力仕，

2019）。在藏區(qū)牧民經(jīng)濟(jì)中，牦牛的乳、肉、皮、毛、絨

及其加工產(chǎn)品均是其他家畜無法替代；但高原氣候

條件惡劣，冬季缺乏飼草料，導(dǎo)致牦牛營養(yǎng)不良及個

體生產(chǎn)性能下降，嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)

展。低溫環(huán)境所引起的冷應(yīng)激，會導(dǎo)致牦牛抵抗能

力降低及采食量下降，甚至致使懷孕牦牛流產(chǎn)等（賈

銀海等，2021）。因此，揭示牦牛抗冷適應(yīng)能力的作

用機(jī)理，對保護(hù)牦牛品種資源及促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)的可

持續(xù)發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】動物在受

到冷應(yīng)激時，其機(jī)體通過增加產(chǎn)熱以維持體溫恒定。

在冷應(yīng)激條件下，肌體會產(chǎn)生一系列變化，通過震顫

或非震顫產(chǎn)熱（郝力仕，2019）。冷應(yīng)激不僅影響動

物的生產(chǎn)性能，還會對動物的免疫能力及抗氧化能

力等造成不同程度的影響（郭爽等，2021；賈銀海等，

2021）。決定動物抗寒性的因素諸多，包括皮膚表面

積、產(chǎn)熱性能、蒸發(fā)損耗、代謝損耗、脂肪厚度、皮膚

厚度、體毛長度和細(xì)度及環(huán)境濕度等，許多動物在低

溫條件下可合成重結(jié)晶抑制效應(yīng)的抗凍蛋白，降低

體內(nèi)的體液冰點，從而最大限度地保持體液的液體

狀態(tài)（deMaayeretal.，2014）。至今，有關(guān)抗凍蛋白

（Antifreezeprotein，AFP）的研究主要集中在魚類

TMTproteomicsandbioinformaticstoanalyzedifferential

proteinsincoldresistanceofyaks

JIAYin-hai1，ZHANGCheng-fu2，ZHANGQiang2，JIQiu-mei2，HUANGGuang-yun1，

JIANGHui2，WENXin-wang1，HUANGMing-guang1，PENGXia-yun1，WUZhu-yue1

（1AnimalHusbandryRearchInstituteofGuangxi/GuangxiKeyLaboratoryofLivestockGeneticImprovement，

Nanning530001，China；2InstituteofAnimalScienceandVeterinary，TibetAcademyofAgriculturalandAnimal

HusbandrySciences/StateKeyLaboratoryofHullessBarleyandYakGermplasmResourcesand

GeneticImprovement，Lhasa850000，China）

Abstract：【Objective】Toelucidatethemechanismofcoldresistanceofyakfromproteinlevel，andtofurtherim-

proveitsmetabolicperformancefromtheperspectiveofnutrition，soastoprovidescientificbasisforyaktoeffectivelyre-

sistharshclimateconditions.【Method】TheyakantifreezeproteinswereextractedbyTMTproteomicsincoldason

（January）andwarmason（August），andthesubcellularlocalizationanalysis，domainanalysis，GOfunctionalanalysis，

KEGGsignalingpathwayannotationanalysis，proteininteractionwereanalyzed.【Result】Atotalof21856peptideswere

identified，ere144subcellularproteins，

including89up-regulatedproteinsand55down-regulatedproteins.144yakantifreezedifferentialproteinsweresubcellu-

larmappedto7items，including56nuclearproteins，51cytoplasmicproteins，24plasmamembraneproteins，23extra-

cellularproteins，18mitochondrialproteins，of194domainswere

chmentoffunctionanalysisindicatedthat，biologicalprocessmainlyenrichedtocellprotein79，70

metabolicprocessproteinand42regulationprotein，molecularfunctionmainlyenrichedtocombinefunctionalprotein75

and64catalyticactivityoftheprotein，cel

144yakantifreezedifferentialproteinswereannotatedinto205KEGGsignalingpathwaysinKEGGdataba，which

mainlyinvolvedinribosomes，nitrogenmetabolism，cytoplasmicDNAnsing，invivothermogenesis，oxidativephos-

phorylation，oundthatL8IHE5hadthehighestcorrelation，andcold-in-

ducedRNA-bindingproteins（CIRP）andHSP70bindingproteinhadmoreinteractioninthenetwork.【Conclusion】Ac-

cordingtoTMTproteomics，144differentialantifreezeproteins（89up-regulatedproteinsand55down-regulatedpro-

teins）areidentified，amongwhichCIRPandHSP70areup-regulatedundercoldstress，whichcanpromoteyakbodyto

adapttolowtemperatureenvironment，andcanbeudascandidatemolecularmarkersforyakantifreezebreeding.

Keywords：yak；TMTproteomics；bioinformatics；coldresistance；differentialproteins

Foundationitems：GuangxiScienceandTechnologyMajorSpecialProject（GuikeAA17204028）；TibetAcademy

ofAgriculturalandAnimalHusbandrySciences/StateKeyLaboratoryofHullessBarleyandYakGermplasmResources

andGeneticImprovementOpen-project（XZNKY-2020-C-007K05）

1期·3·

（Inglital.，2006；Gamhametal.，2008）、昆蟲

（Meisteretal.，2015）、植物（Jietal.，2017；Sperotto

etal.，2018）及菌類（Mu?ozetal.，2017）等物種上，

其中又以魚類的研究最深入（鐘其旺和樊廷俊，

2002；Martínez-Páramoetal.，2009；Duman，2015）。

Kim等（2019）對南極魚亞目物種基因組中的高度保

守核苷酸片段（Conrvednucleotideelements，CNEs）

進(jìn)化模式進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)南極魚類對血紅細(xì)胞

發(fā)生過程的調(diào)控是適應(yīng)低溫的一個重要機(jī)制；Daane

等（2020）研究表明，在長期的低溫環(huán)境下CNEs存在

快速突變功能丟失的趨勢；Ren等（2021）從基因?qū)用?/p>

開展研究，發(fā)現(xiàn)通路MAPK在魚類低溫應(yīng)激中占據(jù)

重要位置，且可能與其他重要的通路如TGF-Bata等

存在復(fù)雜聯(lián)系。在高寒地區(qū)，植物在面對低溫環(huán)境

也會產(chǎn)生抗寒機(jī)制的產(chǎn)物，但其含量遠(yuǎn)低于魚類的

抗凍蛋白（Jietal.，2017）。在大部分昆蟲體內(nèi)都存

在抗凍蛋白，其含量較魚類抗凍蛋白高10~100倍，且

其蛋白結(jié)構(gòu)存在明顯差異（Meisteretal.，2015）。此

外，有研究已將抗凍蛋白添加至化妝品中，通過皮膚

吸收能起到保護(hù)皮膚、防止皮膚凍傷的作用，即可用

于高級防凍化妝品（EvansandFletcher，2004；鞏子

路，2015）。可見，抗凍蛋白對于不同物種發(fā)揮抗冷

性能均有重要意義。【本研究切入點】不同物種為適

應(yīng)外界環(huán)境條件的變化，通常會產(chǎn)生應(yīng)對環(huán)境條件

變化的相關(guān)產(chǎn)物，目前國內(nèi)外針對抗凍蛋白已有深

入研究（鐘其旺和樊廷俊，2002；Martínez-Páramoet

al.，2009；Duman，2015），但有關(guān)我國牦牛抗逆性及

其抗凍蛋白方面的研究鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問

題】基于TMT（Tandemmasstag）蛋白組學(xué)及生物信

息學(xué)分析對牦牛抗凍蛋白進(jìn)行篩選研究，旨在闡明

牦牛抗寒性能機(jī)理，并進(jìn)一步從營養(yǎng)學(xué)角度提高其

代謝性能，為牦牛有效抵御外界惡劣氣候條件提供

科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試牦牛由西藏農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所

改則縣古姆鄉(xiāng)和斯布牦牛養(yǎng)殖基地提供，分別于氣

候寒冷的冬春季（1月）和氣候溫和的夏季（8月）采集

6~8歲經(jīng)產(chǎn)牦牛耳組織樣品，各8頭，-80℃低溫保存

備用。TMT分子標(biāo)記試劑盒購自美國ThermoFisher

公司，BCA試劑盒購自南京諾威贊生物科技股份有

限公司，乙腈和超純水購自FisherChemical公司，

SDS、三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫蘇糖醇（DTT）、尿

素及四乙基溴化銨等試劑購自Sigma公司。

1.2蛋白提取和肽段酶解

分別設(shè)寒冷季節(jié)組和溫暖季節(jié)組，其中，寒冷

季節(jié)組3個重復(fù)（CON-1、CON-2和CON-3），溫暖季

節(jié)組3個重復(fù)（T-1、T-2和T-3）。采用SDT裂解法（4%

SDS，100mmol/LTris/HCl，0.1mol/LDTT，pH7.6）

提取蛋白，取適量蛋白使用FASP（Filteraidedpro-

teomepreparation）進(jìn)行胰蛋白酶酶解（Wi?niewski

etal.，2009），并以C18Cartridge對肽段進(jìn)行脫鹽；凍

干后的肽段加入40μL0.1%甲酸溶液復(fù)溶，應(yīng)用

TMT標(biāo)記不同樣品中的同一蛋白，再以BCA法進(jìn)行

定量分析（賈銀海，2018）。

1.3TMT分子標(biāo)記

取100μg肽段按TMT分子標(biāo)記試劑盒說明分

別對各樣品進(jìn)行標(biāo)記（葛澤勇，2018）。RP（反相）分

級：采用HighpHReverd-PhaPeptideFractiona-

tionKit對TMT標(biāo)記的每組肽段等量混合后進(jìn)行分

級（葛澤勇，2018）。以乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）

進(jìn)行色譜柱平衡，將TMT標(biāo)記肽段混合樣品上樣，低

速離心脫鹽，然后依次用不同梯度濃度的高pH乙

腈溶液對結(jié)合肽段進(jìn)行梯度洗脫。真空干燥后，以

12μL0.1%脂肪酸（FA）進(jìn)行復(fù)溶，于280nm處測定

肽段濃度。陽離子交換柱（SCX）分級：采用AKTA

Purifier100對TMT標(biāo)記的每組肽段混合后進(jìn)行分級

（葛澤勇，2018）。緩沖液A液［10mmol/LKH2PO4，

25%乙腈，pH3.0］，B液（10mmol/LKH2PO4，500

mmol/LKCl，25%乙腈，pH3.0）。A液平衡色譜柱，

以1mL/min的流速經(jīng)色譜柱進(jìn)行分離。B液梯度如

下：0%，25min；0%~10%，25~32min；10%~20%，32~

42min；20%~45%，42~47min；45%~100%，47~52

min；100%，52~60min；60min后B液重設(shè)為0%

（蔣少秋，2020）。洗脫過程監(jiān)測214nm處的吸光值

（OD214），每隔1min收集1次洗脫組分，凍干后采用

C18Cartridge進(jìn)行脫鹽（蔣少秋，2020）。

1.4LC-MS/MS數(shù)據(jù)采集

采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)EasynLC對每

份樣品進(jìn)行分離（張弛，2020）。緩沖液A液為0.1%

甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為

84%）。95%的A液平衡色譜柱，樣品通過進(jìn)樣器上

樣至C18反相分析柱（ThermoScientificAcclaimPep-

Map100，100μm×2cm，nanoViperC18），采用B液線

性梯度分離，以300nL/min的流速流經(jīng)分析柱（Ther-

moScientificEASYcolumn，10cm，ID75μm，3μm，

C18-A2），再用Q-Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析，并采

集數(shù)據(jù)（楊重暉，2020）。

賈銀海等：基于TMT蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析牦牛抗凍差異蛋白

53卷南方農(nóng)業(yè)學(xué)報·4·

1.5蛋白鑒定及定量分析

采用Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.4對

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定及定量分析（賈銀海，

2018）。

1.6生物信息學(xué)分析

1.6.1亞細(xì)胞定位分析采用CELLO（http://cello.

/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，即以多重支

持向量機(jī)（multi-classSVM）的機(jī)器學(xué)習(xí)方法對公共

數(shù)據(jù)庫中已知亞細(xì)胞定位信息的蛋白序列數(shù)據(jù)進(jìn)行

建模，預(yù)測待檢索蛋白亞細(xì)胞定位情況。

1.6.2蛋白結(jié)構(gòu)域分析使用Pfam數(shù)據(jù)庫的Inter-

ProScan數(shù)據(jù)包，采用運行掃描算法對蛋白序列進(jìn)行

功能表征預(yù)測，以獲得目標(biāo)蛋白序列在Pfam數(shù)據(jù)庫

中的結(jié)構(gòu)域注釋信息。

1.6.3GO功能富集分析利用Blast2GO對目標(biāo)蛋

白集合進(jìn)行GO功能富集分析，具體分析過程可歸納

為序列比對（BLAST）、GO條目提取（Mapping）、GO

注釋（Annotation）及InterProScan補(bǔ)充注釋（Annota-

tionaugmentation）等（賈銀海，2018）。

1.6.4KEGG信號通路注釋分析利用KAAS（KEGG

automaticannotationrver）對目標(biāo)蛋白集合進(jìn)行

KEGG信號通路注釋分析（賈銀海，2018）。

1.6.5蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析依據(jù)IntAct（http://

/intact/）或STRING（http://

/）數(shù)據(jù)庫分析蛋白間的連接數(shù)，預(yù)測

蛋白與蛋白間的相互作用關(guān)系，同時以CytoScape

3.2.1繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖并進(jìn)行分析（賈

銀海，2018）。

1.6.6蛋白層次聚類分析首先對目標(biāo)蛋白集合

的定量信息進(jìn)行歸一化處理，即歸一化至（-1，1）區(qū)

間；使用ComplexHeatmapVersion3.4從抗凍差異蛋

白樣本及其表達(dá)量2個維度進(jìn)行分類，并生成層次聚

類熱圖（楊重暉，2020）。

2結(jié)果與分析

2.1牦牛抗凍蛋白鑒定結(jié)果

由圖1和圖2可知，經(jīng)Mascot2.2鑒定和Pro-

teomeDiscoverer1.4定量分析共獲得433236張總譜

圖（Totalspectra）。其中蛋白譜圖（Spectra）45950

張；肽段（Peptide）數(shù)量為21856個，其中特有肽段

（Uniquepeptide）數(shù)量為18452個；蛋白（Protein）數(shù)量

為4527個，定量到的蛋白數(shù)量為4519個。對牦牛抗

凍差異蛋白進(jìn)行篩選，結(jié)果篩選獲得144個差異蛋

白，其中上調(diào)蛋白89個、下調(diào)蛋白55個。

2.2亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果

CELLO亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明，144個牦牛

抗凍差異蛋白定位到7個條目上（圖3），分別是細(xì)胞

核（Nuclear）蛋白56個、細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasmic）蛋白51

個、質(zhì)膜（Plasmamembrane）蛋白24個、細(xì)胞外（Ex-

tracellular）蛋白23個、線粒體（Mitochondrial）蛋白18

個及其他蛋白2個［細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）蛋白1個

和溶酶體（Lysosome）蛋白1個］。

2.3蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

通過評價鑒定獲得蛋白在某個結(jié)構(gòu)域條目下

圖1牦牛蛋白鑒定信息統(tǒng)計結(jié)果

Fig.1Theinformationstatisticsofproteinidentificationinyak

圖2牦牛抗凍差異蛋白定量分析結(jié)果

Fig.2Quantitativeresultofdifferentialproteinincoldresis-

tanceofyak

圖3牦牛抗凍差異蛋白亞細(xì)胞定位分析結(jié)果

Fig.3Subcellularlocalizationanalysisofdifferentialprotein

incoldresistanceofyak

Plasmamembrane，24Extracellular，23

Mitochondrial，18

Cytoplasmic，51

Others，2

Nuclear，56

1期·5·

的富集水平及對應(yīng)的差異蛋白，對牦牛抗凍差異蛋

白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，共鑒定到194個結(jié)構(gòu)域，排名前

20位的結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果如圖4所示。其中，Uteroglo-

binfamily（子宮珠蛋白家族）、Copper/zincsupero-

xidedismuta（SODC）（銅/鋅超氧化物歧化酶）、Zn-

fingerinRanbindingproteinandothers（含鋅指Ran

結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白）及Acetyltransfera（GANT）family

（C-酰胺化酶家族）是機(jī)體參與抗凍應(yīng)答的相關(guān)蛋白。

2.4GO功能富集分析結(jié)果

對牦牛抗凍差異蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)

果（圖5）顯示，生物過程（Biologicalprocess）主要富

集到細(xì)胞過程（Cellularprocess）蛋白79個、代謝過程

（Metabolicprocess）蛋白70個和生物調(diào)控（Biologi-

calregulation）蛋白42個等，分子功能（Molecular

function）主要富集到結(jié)合功能（Binding）蛋白75個和

催化活性（Catalyticactivity）蛋白64個等，細(xì)胞組分

（Cellularcomponent）主要富集到細(xì)胞部分（Cell

part）蛋白89個和細(xì)胞（cell）蛋白89個等。在生物過

程中，Cellularcarbohydratemetabolicprocess（細(xì)胞

碳水化合物代謝過程）上調(diào)，而Energyrervemeta-

bolicprocess（能量儲備代謝過程）、Oxidation-reduc-

tionprocess（氧化還原反應(yīng)過程）、Cellularglucan

metabolicprocess（細(xì)胞糖代謝過程）、Regulationof

glucometabolicprocess（細(xì)胞糖代謝調(diào)控過程）及

Cellularcarbohydratecatabolicprocess（細(xì)胞碳水化

合物分解代謝過程）等條目下調(diào)；在分子功能中，Ox-

idoreductaactivity（氧化還原酶活性）上調(diào)，而Anti-

oxidantactivity（抗氧化活性）、Transaminaactivity

（轉(zhuǎn)氨酶活性）及Catalyticactivity（催化活性）等條目

下調(diào)；在細(xì)胞組分中，Integralcomponentofmem-

brane（膜的整體組分）及Intrinsiccomponentofmem-

brane（膜的內(nèi)在成分）等條目上調(diào)，而Mitochondrial

outermembrane（線粒體外膜）、Postsynap（突觸后

膜）、Nuclearoutermembrane-endoplasmicreticulum

membranenetwork（核外膜—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)）等條目

下調(diào)。

圖4牦牛抗凍差異蛋白結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

Fig.4Proteindomainanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

結(jié)

構(gòu)

域

名

稱

（

T

o

p

2

0

）

D

o

m

a

i

n

n

a

m

e

富集程度Enrichmentlevel

賈銀海等：基于TMT蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析牦牛抗凍差異蛋白

53卷南方農(nóng)業(yè)學(xué)報·6·

圖5牦牛抗凍差異蛋白GO功能富集分析結(jié)果

Fig.5GOfunctionenrichmentanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

蛋白數(shù)量Numberofprotein

G

O

條

目

名

稱

G

O

T

e

r

m

s

n

a

m

e

2.5KEGG信號通路注釋分析結(jié)果

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對牦牛抗凍差異蛋白進(jìn)行分

類注釋，結(jié)果顯示共注釋到205條KEGG信號通路。

表1為注釋獲得的前10條KEGG信號通路，主要涉及

核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動物體內(nèi)生熱作用、

氧化磷酸化、白細(xì)胞介素-17及鈣離子信號等通路。

2.6牦牛抗凍差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

由CytoScape3.2.1繪制的牦牛抗凍差異蛋白相

互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖（圖6）可看出，關(guān)聯(lián)度排名前10位

的抗凍差異蛋白為L8IHE5、L8I961、A0A6B0RV13、

A0A6B0RUX6、A0A6B0QW44、A0A6B0QZV0、

L8I1Z6、A0A6B0RR94、A0A6B0RJ65和L8IPU4，關(guān)

聯(lián)度最高的是L8IHE5。其中，A0A6B0RV13為冷誘

導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（ColdinducibleRNAbindingpro-

tein，CIRP），L8I1Z6為HSP70結(jié)合蛋白。CIRP和

HSP70蛋白在冷應(yīng)激條件下均呈上調(diào)趨勢，可作為

牦牛抗凍性育種的候選蛋白基因。

2.7牦牛抗凍差異蛋白的表達(dá)量聚類分析結(jié)果

由圖7可知，對6個樣品組的抗凍差異蛋白定量

數(shù)據(jù)（樣本維度和表達(dá)量維度）進(jìn)行分層聚類分析，

1期·7·

通路號PathwayID

Bom03010

Bom00910

Bom04623

Bom04714

Bom00190

Bom04657

Bom04020

Bom04979

Bom04142

Bom04612

通路名稱Pathwayname

核糖體

氮代謝

胞質(zhì)DNA感受

動物體內(nèi)生熱作用

氧化磷酸化

白細(xì)胞介素-17

鈣離子信號

膽固醇代謝

溶酶體

抗原處理和表示信號

通路數(shù)量Pathwaynumber

2

1

1

1

1

1

1

1

1

1

基因名稱Genename

L8IHE5/A0A6B0QRF1

L8IQC8

L8I6W3

L8HSQ2

L8HRN2

L8HMR5

A0A6B0RMJ1

A0A6B0RCD8

L8IFQ8

L8HQ73

P

0.00663

0.00626

0.00110

0.00729

0.00694

0.00133

0.00155

0.00177

0.00309

0.00398

表1牦牛抗凍差異蛋白KEGG信號通路注釋分析結(jié)果（排名前10）

Table1TheresultsofKEGGsignalpathwayannotationofdifferentialproteinincoldresistanceofyak（Top10）

圖6牦牛抗凍差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

Fig.6Networkinteractionanalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

每列代表1組樣品（橫坐標(biāo)為樣品信息），每行代表

1個蛋白（縱坐標(biāo)為顯著差異表達(dá)蛋白），其中，紅色

代表顯著上調(diào)蛋白，藍(lán)色代表顯著下調(diào)蛋白，灰色部

分代表無蛋白信息。分層聚類分析結(jié)果顯示：寒冷

季節(jié)組（CON-1、CON-2和CON-3）牦牛抗凍差異蛋

白表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)趨勢較一致，CON-2和CON-3

先聚為一類，再與CON-1聚為一類；溫暖季節(jié)組（T-1、

T-2和T-3）牦牛抗凍差異蛋白表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)

趨勢與寒冷季節(jié)的基本一致，T-2和T-3先聚為一類，

再與T-1聚為一類，最終形成與寒冷季節(jié)組（CON-1、

CON-2和CON-3）明顯不同的簇。

3討論

TMT是ThermoScientific公司推出的一種應(yīng)用

廣泛、基于體外同位素標(biāo)記的相對與絕對定量蛋白

組學(xué)技術(shù)，利用同位素試劑標(biāo)記蛋白酶解后產(chǎn)生的

賈銀海等：基于TMT蛋白組學(xué)及生物信息學(xué)分析牦牛抗凍差異蛋白

53卷南方農(nóng)業(yè)學(xué)報·8·

圖7牦牛抗冷差異蛋白的分層聚類分析結(jié)果

Fig.7Hierarchicalclusteranalysisofdifferentialproteinincoldresistanceofyak

CON-1CON-2CON-3T-1T-2T-3

-0.4-0.20.00.20.4

1期·9·

多肽，可同時比對分析多達(dá)16種樣品間的蛋白表達(dá)

量（Rostal.，2004）。TMT標(biāo)記的不同樣本中同一

蛋白均表現(xiàn)出相同的質(zhì)荷比，等量混勻后，經(jīng)高質(zhì)

量、高精度和高分辨率的質(zhì)譜分析，可保持良好的質(zhì)

量偏差，其鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠；經(jīng)數(shù)據(jù)庫分析即可獲

得不同樣本中各蛋白的相對定量比值，進(jìn)而篩選出

差異表達(dá)蛋白。本研究采用TMT結(jié)合液相色譜和串

聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的方法成功對牦牛耳組織蛋白進(jìn)行分離

和鑒定，結(jié)果鑒定獲得特有肽段（Uniquepeptide）序

列18452個，鑒定獲得4527個蛋白（Protein），其中定

量到的蛋白數(shù)量為4519個。可見，TMT可標(biāo)記所有

肽段，適用于任何類型的樣本鑒定，具有高通量的特

點，且可信度高。

本研究應(yīng)用TMT蛋白組學(xué)技術(shù)對寒冷季節(jié)和

溫暖季節(jié)的牦牛抗凍蛋白進(jìn)行挖掘，并對鑒定到的

牦牛抗凍蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、GO功能富

集及KEGG信號通路注釋等生物信息學(xué)分析。在亞

細(xì)胞定位分析中，144個牦牛抗凍差異蛋白共鑒定到

7個條目上，分別是細(xì)胞核蛋白56個、細(xì)胞質(zhì)蛋白51

個、質(zhì)膜蛋白24個、細(xì)胞外蛋白23個、線粒體蛋白18

個、細(xì)胞骨架蛋白1個及溶酶體蛋白1個。在結(jié)構(gòu)域

分析中，共鑒定到194個結(jié)構(gòu)域，其中，子宮珠蛋白家

族上調(diào)，可能與動物肌體防御外界不同環(huán)境條件變

化，促進(jìn)肺組織發(fā)育及提高自身免疫力有關(guān)（厲雙慧

等，2020）；銅/鋅超氧化物歧化酶和C-酰胺化酶家族

下調(diào)，則與高寒缺氧條件下機(jī)體內(nèi)攝入的抗氧化營

養(yǎng)素（銅和鋅）不足，不能維持自由基低濃度的動態(tài)

平衡，新陳代謝功能及抵抗力降低有關(guān)，與賈銀海等

（2021）研究牦牛毛微量元素與其抗寒性能的關(guān)聯(lián)分

析結(jié)果一致。GO功能富集分析結(jié)果顯示，在生物過

程中，細(xì)胞碳水化合物代謝過程上調(diào)，而能量儲備代

謝過程、氧化還原反應(yīng)過程、細(xì)胞糖代謝過程、細(xì)胞

糖代謝調(diào)控過程及細(xì)胞碳水化合物分解代謝過程等

下調(diào)；在分子功能中，氧化還原酶活性上調(diào)，而抗氧

化活性、轉(zhuǎn)氨酶活性及催化活性等下調(diào)；在細(xì)胞組分

中，膜的整體組分和膜的內(nèi)在成分等上調(diào)，線粒體外

膜、突觸后膜及核外膜—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)等則下調(diào)。

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對牦牛抗凍差異蛋白進(jìn)行分類注

釋，結(jié)果共注釋到205條KEGG信號通路，主要涉及

核糖體、氮代謝、胞質(zhì)DNA感受、動物體內(nèi)生熱作

用、氧化磷酸化、白細(xì)胞介素-17及鈣離子信號等

通路。

本研究還鑒定出冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRP），

該蛋白是在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)首個發(fā)現(xiàn)的冷休克蛋

白，由172個氨基酸殘基組成，含有2個明顯的結(jié)構(gòu)域

（Leeetal.，2015）。已有研究表明，缺氧、紫外線輻

射、缺糖、熱應(yīng)激和過氧化氫均可調(diào)節(jié)大鼠血清中

CIRP的表達(dá)，提示CIRP是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白（Lleon-

art，2010）。在應(yīng)激條件下，腸系膜細(xì)胞可從細(xì)胞核

遷移至細(xì)胞質(zhì)，通過其靶基因3'端的結(jié)合位點調(diào)節(jié)

mRNA穩(wěn)定性（Sakuraietal.，2006）。CIRP參與多種

細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活、晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、

端粒維持及腫瘤的形成和發(fā)展（Lleonart，2010）。

CIRP在25℃下被誘導(dǎo)產(chǎn)生（Sakuraietal.，2006），特

別是在低溫、缺氧和強(qiáng)紫外線的脅迫下，其表達(dá)量顯

著增加，表明冷誘導(dǎo)產(chǎn)生的CIRP能促使牦牛肌體適

應(yīng)低溫環(huán)境（Al-FageehandSmales，2009）。

熱休克蛋白（HSPs）是由細(xì)胞核內(nèi)高度保守的

熱應(yīng)激基因所編碼（Lanneauetal.，2008）。HSPs作

為蛋白分子伴侶存在，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白肽鏈空間結(jié)

構(gòu)的形成，促進(jìn)蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移動，對調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)

具有重要作用（黃建芳等，2015；伍鋼等，2020）。此

外，HSPs能被冷應(yīng)激過后的復(fù)溫過程所誘導(dǎo)（Lan-

neauetal.，2008）。在冷應(yīng)激條件下HSPs能迅速表

達(dá)，因此可作為冷應(yīng)激反應(yīng)的分子生物標(biāo)記。本研

究從牦牛耳組織蛋白中鑒定獲得HSP70、HSP90、

HSP110和HSP27，尤其是HSP70當(dāng)肌體受到冷應(yīng)激

時會顯著升高，與其能與細(xì)胞內(nèi)其他分子以不穩(wěn)定

的結(jié)構(gòu)結(jié)合有關(guān)。

4結(jié)論

基于TMT蛋白組學(xué)對牦牛抗凍差異蛋白進(jìn)行

挖掘，結(jié)果鑒定獲得144個抗凍差異蛋白（上調(diào)蛋白

89個，下調(diào)蛋白55個），其中CIRP和HSP70在冷應(yīng)激

條件下呈上調(diào)趨勢，能促使牦牛肌體適應(yīng)低溫環(huán)境，

可作為牦牛抗凍性育種的候選分子標(biāo)記。

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（責(zé)任編輯蘭宗寶）

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