鄧雯雯

人參皂苷對波動性高糖所致內皮細胞損傷的作用及機制研究

陳頡;馮曉紅;黃琦

【摘要】目的觀察人參皂苷對波動性高糖所致內皮細胞損傷的保護作用并探討其

作用機制.方法體外培養人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),分為對照組、波動性高糖模

型組及人參皂苷低中高濃度組(12.5g/mL、25g/mL、50g/mL).Westernblot

檢測NF-E2相關因子2(Nrf2)的核轉位及下游抗氧化蛋白血紅素加氧酶-1(HO-1)、

-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-GCS)和醌氧化還原酶(NQO1)的表達;RT-PCR檢測下

游抗氧化蛋白HO-1、-GCS和NQO1的mRNA表達;Westernblot檢測瞬時轉

染Nrf2siRNA質粒后Nrf2總蛋白和核蛋白及下游HO-1、-GCS和NQO1蛋

白的表達.結果人參皂苷治療后,HUVECs中的Nrf2核蛋白及下游抗氧化蛋白HO-

1、-GCS和NQO1表達均明顯增強(P＜0.05).瞬時轉染Nrf2siRNA質粒后,人參

皂苷的治療作用消失.結論人參皂苷通過促進Nrf2核轉位,調控Nrf2/ARE信號通

路發揮其抗波動性高糖所致內皮細胞損傷的氧化應激損傷作用.

【期刊名稱】《浙江中西醫結合雜志》

【年(卷),期】2017(027)007

【總頁數】6頁(P550-553,后插1-后插2)

【關鍵詞】波動性高糖;人臍靜脈內皮細胞;Nrf2/ARE;氧化應激;人參皂苷

【作者】陳頡;馮曉紅;黃琦

【作者單位】浙江省中醫院內分泌科杭州310006;浙江省中醫院內分泌科杭州

310006;浙江省中醫院內分泌科杭州310006

【正文語種】中文

波動性高糖較易出現于糖尿病患者的病程中，其較持續性高糖對血管內皮功能的損

害可能更嚴重[1-3]。波動性高糖導致內皮細胞凋亡的機制尚未清楚闡明，其中氧

化應激被認為發揮了主要作用。Nrf2/ARE通路是主要的內源性抗氧化應激通路

[4]，通過啟動轉錄因子，進而激活下游抗氧化蛋白而發揮抗氧化應激和細胞保護

作用[5]。最近研究[6-7]發現，在糖尿病的大血管及微血管并發癥中，激活

Nrf2/ARE通路，可以發揮其抗氧化應激作用。我們認為Nrf2/ARE通路同樣參與

了抗波動性高糖致內皮細胞凋亡的氧化應激過程。我們前期研究證實了人參皂苷對

波動性高糖所致的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷的保護作用[8]。那么人參皂苷的這

種細胞保護作用是否與Nrf2/ARE通路有關？本實驗擬通過人參皂苷干預體外培養

的人臍靜脈內皮細胞（HUVECs），觀察NF-E2相關因子2（Nrf2）的核轉位及

下游抗氧化蛋白血紅素加氧酶-1（HO-1）、-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-GCS）

和醌氧化還原酶（NQO1）的表達，探討人參皂落款 苷對波動性高糖致內皮細胞損傷

的保護作用機制。

1.1藥物與試劑人參皂苷由浙江省中醫院提供（批號：20130819）；DMEM低糖、

高糖培養液、胎牛血清（Gibco公司）；HO-1、-GCS和NQO1引物（Takara

公司）；風箏的種類 兔抗Nrf2多克隆抗體、兔抗HO-1多克隆抗體、兔抗-GCS多克隆抗

體、兔抗NQO1多克隆抗體（CST公司）；胞漿胞核蛋白抽提試劑盒（碧云天公

司）。

1.2細胞培養人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）購于上海生兒童寓言故事 科院細胞庫。將細胞培養

液含10%胎牛血清，100/mL青霉素和100/mL鏈霉素液的DMEM培養基，

置于37℃、5%CO2孵箱中培養，至細胞鋪滿培養瓶底90%左右，用1mL含

EDTA的胰酶消化傳代。

1.3實驗分組及干預實驗分為五組：對照組（恒定加入5.5mmol/L葡萄糖）、波

動性高糖組（每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、波動性高糖＋三

種不同濃度的人參皂苷（12.5g/mL，25g/mL，50g/mL）干預組。各組每

24h換液1次，共培養6天后終止培養。

1.4Westernblot檢測Nrf2的核轉位及HO-1、-GCS和NQO1的蛋白表達用

PBS輕輕漂洗培養瓶中細胞，然后加入RIPA裂解液，冰浴30min，4℃、12

000r、20min離心，取上清為細胞總蛋白；嚴格按照核蛋白提取試劑盒說明書提

取細胞核蛋白。Bradford法測定蛋白濃度，總蛋白上量樣為100g，核蛋白上樣

量60g，10%SDS-PAGE電泳轉膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗

（1:200）4℃孵育過夜，加入相應的二抗（1:1000），漂洗，加ECL試劑發光顯

影。

1.5RT-PCR檢測細蒙恬簡介 胞內HO-1、-GCS和NQO1的mRNA表達用Trizol試劑

提取總RNA，按說明書操作。每份樣品中取1gRNA進行反轉錄合成cDNA，

然后取1LcDNA進行PCR擴增。HO-1上游引物：

GGAACTTTCAGAAGGGCCAGGT，下游引物：

TGCAGCTCTTCTGGGAAGTAGACA，產物片段148bp；-GCS上游引物：

TGTAGTGCGAGGAAGAGGTATGA，下游引物：

GGAGGGAAAGGAGAGGAAGG，產物片段162bp；NQO1上游引物：

AGGACCCTTCCGGAGTAAGAA，下游引物：GTCAGGGAGCCTGGAAAGA，

產物片段488bp。GAPDH上游引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游引物：

TGGTGAAGACGCCAGTGGA，產物片段138bp。反應在60L體系中進行。擴

增條件：37℃變性15min，85℃退火5s，4℃延伸10min。，進行40個循環的

擴增，于每個循環的延伸階段收集熒光信號。擴增結束后進入分析界面，以

GAPDH作為內參照，根據每個樣本擴增曲線的Ct值計算各目的基因表達水平的

相對定量值，對照組設置為1，最終結果計為與對照組進行比較后的相對定量值

RQ用于統計分析。

1.6瞬時轉染pcDNA3.1-Nrf2質粒實驗siRNA瞬時轉染步驟按

Lipofectamine2000說明書進行，優化轉染條件后，將細胞分成四組：模型

+siRNA對照組（轉染ControlsiRNA+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡

萄糖）、模型+siRNA+人參皂苷組（轉染ControlsiRNA+人參皂苷25g/mL+

每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2siRNA組（轉染

Nrf2siRNA+每24h輪換25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖）、模型+Nrf2

siRNA+人參皂苷組（轉染Nrf2siRNA+人參皂苷25g/mL+每24h輪換

25mmol/L或5.5mmol/L葡萄糖），分別刺激48h，收取細胞。Westernblot

檢測HO-1、-GCS和NQO1蛋白、Nrf2總蛋白和核蛋白表達。

1.7統計學方法應用SPSS19.0統計軟件分析，所有數據以（）表示，組間比較采

用單因素方差分析。以P＜0.05為有統計學意義。

2.1人參皂苷對Nrf2核轉位及HO-1、-GCS和NQO1蛋白表達的影響

Westernblot結果顯示，各組Nrf2總蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），

波動性高糖下Nrf2核蛋白表達明顯增高，人參皂苷治療后進一步增強了Nrf2的

核蛋白表達。模型組HO-1、-GCS和NQO1蛋白表達高于對照組，人參皂苷治

療后其蛋白表達進一步增加（圖1，插頁）。

2.2人參皂苷對HO-1、-GCS和NQO1mRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，

模型組HO-1、-GCS和NQO1mRNA表達明顯高于對照組（P＜0.05），人參

皂苷治療后mRNA表達進一步增加，高濃度組明顯優于模型組（P＜0.05）（圖

2～3，插頁）。

2.3人參皂苷及瞬時轉染Nrf2siRNA對各蛋白表達的影響Westernblot結果顯

示，在空siRNA組經過人參皂苷干預后Nrf2、HO-1、NQO1、-GCS的表達提

升，而在Nrf2siRNA組及經過人參皂苷干預組，Nrf2、HO-1、NQO1、-GCS

的表達均明顯較前降低（見圖4，插頁）。

糖尿病患者由于自身調節機制的紊亂，易出現血糖的波動，研究也已證實波動性高

糖較持續性高糖對血管內皮功能的損害可能更嚴重[1-3]。波動性高糖導致內皮細

胞損傷的機制尚未清楚闡明，其中氧化應激被認為發揮了主要作用。我們前期研究

亦表明[8]，波動性高糖產生的氧化應激使得內皮細胞凋亡，人參皂苷通過增加細

胞超氧化物歧化酶（superoxidedismuta，SOD）活性，降低脂質過氧化產物

丙二醛（MDA）含量，明顯抑制波動性高糖所致的人臍靜脈內皮細胞凋亡，從而

對波動性高糖所致的內皮細胞損傷表現出一定的保護作用。

生理狀態下，機體的氧化與抗氧化系統相互拮抗平衡。當機體受到有害刺激時，可

以通過多種途徑介導活性氧（ROS）產生增加，使得抗氧化能力降低，氧化應激

損傷隨之發生[9]。Nrf2/ARE通路是主要的內源性抗氧化應激通路[4]。在生理狀

態下，Nrf2與伴侶分子Keap1（kelch-likeECH-associatedprotein1）在胞漿

中相互結合后，通過蛋白酶體泛素化途徑降解使得其活性受到抑制；當受到來源于

ROS信號攻擊后，Nrf2與Keap1解離并進入胞核，與其它bZIP蛋白結合成異二

聚體，轉位進入細胞核內，結合抗氧化反應元件ARE，使ARE相關抗氧化酶如血

紅素加氧酶-1（hemeoxygena-1，HO-1）、-谷氨酰半胱氨酸合成酶（-

GCS）、和醌氧化還原酶（NQO1）表達增加[5]，進而發揮抗氧化應激和細胞保

護作用。最近在糖尿病的大血管及微血管并發癥中的研究發現，激活Nrf2/ARE通

路，可以發揮其抗氧化應激作用[6-7]。

人參為五加科人參屬植物，其作為補虛第一要藥，治療“消渴”早有記載。傳統中

醫認為，人參具有大補元氣、生津止渴、扶正固本等功效，現代醫學研究證實人參

皂苷在防治糖尿病及其并發癥方面具有確切的臨床療效[10-13]，人參皂苷還具有

較強的抗氧化和自由基清除能力[14-15]。本實驗進一步發現，給予人參皂苷干預

治療后，促進了Nrf2的核轉位，進而增加了HO-1、-GCS和NQO1表達，而

瞬時轉染Nrf2siRNA后，人參皂苷的治療作用消失，提示人參皂苷對波動性高糖

致內皮細胞損傷的抗氧化應激損傷與其促進Nrf2核轉位有關。

綜上，本研究結果表明，波動性高糖產生的氧化應激損傷使得內皮細胞損傷，人參

皂苷保護波動性高糖致內皮細胞損傷的機制可能是通過激活Nrf2/ARE信號通路，

促進Nrf2的核轉位，啟動下游抗氧化蛋白HO-1、-GCS和NQO1的表達。

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