第十九章 精液冷凍及精子庫的管理
中南大學生殖與干細胞工程研究所
中信湘雅生殖與遺傳專科醫院
朱文兵
第一節 精液冷凍
隨著生殖工程技術的興起及發展，供精人工授精（AID）已經成為治療某些不可恢復或無法治療的男性不育癥的重要療法，其中，精液冷凍是其中的重要環節，以下就精液冷凍的原理，影響因素、相關步驟及臨床應用進行敘述。
一 精液冷凍基本原理
在一定的低溫條件下，以一定的時間作用于生物組織細胞，引起細胞的降溫、凝固、非損傷性結冰，使生物體內分子運動的速度減慢、停止，從而使細胞代謝降低，處于休眠狀態，達到貯存細胞的目的。細胞生活在細胞外液之中，細胞膜將細胞內容物（包括細胞內液）與細
胞外部環境分隔開來，水分可以自由通過細胞膜，水分子從細胞內流向細胞外，或是從細胞外流向細胞內，主要取決于細胞內、外液中溶質濃度差，即溶液滲透壓的高低。在細胞冷凍過程中，隨著溫度不斷下降，細胞外液中，作為各種電解質溶劑的水分首先形成細小的顆粒狀冰晶，導致細胞外水份減少，電解質濃度增加，細胞外液滲透壓升高，使細胞內外液滲透壓失去平衡，水分將從滲透壓低的內液通過細胞膜流向滲透壓高的外液，于是細胞自身脫水皺縮。用冷凍過程中產生的滲透壓的梯度使細胞皺縮，而不損傷細胞——這就是細胞冷凍貯存的基本原理。
由于冷凍降溫速率的不同，冰晶的形成會造成細胞的損傷，如快速冷凍時，細胞冷凍太快，細胞內液來不及脫水，形成冰晶，破壞細胞內的超微結構稱之為快速冷凍損傷；相反，在慢速冷凍時，細胞外液形成大量的冰晶，細胞外液滲透壓突然升高，在尚未降到低溫貯存溫度前，細胞可能會由于過份暴露在高濃度溶質中或細胞嚴重脫水皺縮而死亡，稱之為慢速冷凍損傷。
而冷凍保護劑由于其高水溶性，可保證在冰晶形成過程中，仍停留在溶液中不被析出，從而稀釋細胞外液中溶質的濃度，延緩細胞外液的過分減少及濃度增加的時間，使得細胞順利通過臨界溫度階段。
二 影響精液冷凍貯存的主要因素
影響人類精液冷凍貯存的因素主要有：冷凍程序、冷凍保護劑、復蘇速率、貯存方式，及冷凍前精液質量等。
1. 冷凍程序
精子在冷凍過程中，經過以下幾個階段，根據不同階段的損傷程度采用不同的冷凍速度通過該階段：① 溫度休克階段，室溫～5℃ ，此階段細胞會遭受溫度驟變造成的損害，可以1℃/min的速度通過該階段；② 冰晶潛熱階段，5～－5℃，該階段中精漿形成冰晶，釋放熱量，溫度升高，應快速通過該階段；③ 冰晶形成階段，－5～－15℃；④ 再結晶階段，－15～－80℃，從－5～－30℃，尤其是－5～－15℃為致死溫度范圍，細胞內冰晶形成，溫度驟變，往往會造成精子死亡，應以5～7℃/min的速度通過該階段。⑤ 貯存階段，－80～－196℃。
2. 冷凍保護劑
（1）具備的基本條件：①對被冷凍的細胞無毒性；②具有高水溶性，保證在冰晶形成過程
中不被析出。
（2）種類：①滲入性冷凍保護劑：甘油、DMSO、丙二醇等；②細胞外冷凍保護劑：蔗糖、卵黃等
（3）常用冷凍保護劑配方：
化學物質 | 用量 |
甘油（AR級） | 14ml |
5%葡萄糖溶液 | 26ml |
2.9%枸櫞酸鈉溶液 | 39ml |
蛋黃 | 20ml |
1g/L紅霉素溶液 | 1ml |
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將左側的這些溶液依次置于燒瓶中，攪拌均勻，以1mol/LNaHCO3調整PH值為7.2,配制的保護劑總量為100ml.配好后放－20℃保存，使用期 為3個月；4℃冰箱保存，使用期為 1周。
3. 復蘇速率
冷凍過程中，精子發生的一系列變化也會表現在解凍時的反向順序中，而快速復溫（100℃/min左右）可避免精液在溶解前的再次形冰晶成，具體步驟為：將貯存于液氮中的精液冷凍管取出，快速放入37℃的水浴箱中復溫即可。
4.貯存方式
現在人們多使用液氮來貯存精液，液氮是一種無色、無味的氣體，其沸點為－195.8℃。具有低溫、不助燃、不自燃、不易爆炸、來源豐富的優點。其缺點為易蒸發、耗損量大，長期貯存精子時，必需定期添加液氮以補充蒸發的損失。而且，液氮氣化后，體積會膨大655倍，因此盛放液氮的容器不能密封，以防放生爆炸。
5. 冷凍前精液質量
一般而言，精液冷凍前的的活率及正常形態率越高，冷凍復蘇后的精子活動率也越高，同時，由于個體差異的存在，不同人有不同的冷凍效果。
三 精液冷凍步驟
1. 基本儀器設備及材料
程序冷凍儀、超凈工作臺、相差顯微鏡、水浴箱、恒溫培養箱、冰箱、酒精燈、培養皿、冷凍管、1ml注射器、冷凍保護劑
2. 人類精液快速冷凍步驟
（1）精液取出后，在37℃的水浴箱中液化；
（2）精液液化后按照WHO的標準進行常規分析，包括精液量、顏色、氣味、PH值、液化狀況、精子密度、活動率、圓細胞數等，并做好相關記錄；
（3）鏡檢時將冷凍保護劑復溫至室溫；
（4）將精液與冷凍保護劑按1:1的比例混勻，并分裝于冷凍管中；
（5）冷凍管做好標記；
（6）將冷凍管置入4℃冰箱15min；
（7）將冷凍管置入－80℃液氮蒸氣中15min；
（8）將冷凍管投入液氮中凍存。
3. 人類精液程序冷凍步驟
前（1）-（5）步驟同快速冷凍一致。
（6）將冷凍管置于程序冷凍儀中，開始程序冷凍。冷凍程序如下
1）開始溫度：20℃并平衡5--10分鐘；2）20℃→0℃，冷凍速率-1℃/min；3）0℃→-30℃，冷凍速率-6℃/min；4）-30℃→-80℃，冷凍速率-30℃/min
（7）從程序冷凍儀中取出冷凍管，投入液氮中凍存
四 精液冷凍技術在人類輔助生殖技術中的應用
1. 應用于供精者精液的凍存，精液凍存是AID技術開展的重要基礎。
2. 用于IVF-ET，對于排精困難的男性，可提前將精液凍存，便于醫患雙方掌握治療進展，
以防出現女方一切準備就緒而男方排不出精液的狀況。
3. 用于ICSI，并不是每次睪丸或附睪穿刺都能得到精子，因此睪丸附睪精子的冷凍將會避免反復穿刺造成組織損傷，使得ICSI的順利進行。
4. 用于生殖保險，對于采取絕育手術的患者，如必須進行睪丸切除、附睪手術、影響性功能的手術前，腫瘤病人采取放療、化療術前或從事有可能會影響生育力的工作前均可將其精液冷凍貯存，保留生育能力，用于以后的AIH治療。
第二節 精子庫的管理
人類精子庫又稱為精子銀行，是將精子進行低溫儲存以備將來生育后代所需，同時也可以向男性因素所致的不孕不育夫婦提供志愿者的精液，在我國精子庫是一種限制性使用技術，開展的醫療機構首先必須符合區域衛生行政規劃，在人員、設備、場地和技術水平等方面也要達到基本要求，更需要建立制度化、機制化的管理體系來規范人類精子庫的整個醫療行為，以保證為人民群眾提供安全、有效的生殖健康醫療服務，為此我國衛生部頒布了一系列的有關精子庫的管理及技術規范的相關文件來對人類精子庫的運行實施動態管理，使得人類精子庫建設和發展步入了規范化管理時代。
一、精子庫設置的基本條件
1. 根據衛生部《人類精子庫管理辦法》的要求，人類精子庫設置必須經衛生部批準，并設置在持有《醫療機構執業許可證》的綜合性醫院、專科醫院或持有《計劃生育技術服務執業許可證》的省級以上（含省級）計劃生育服務機構內。中外合資、合作醫療機構,必須同時持有衛生部批準證書和原外經貿部(現商務部)頒發的《外商投資企業批準證書》。
2. 人類精子庫至少應有能儲存1萬份精液標本的能力，總使用面積（供精者接待室、取精室、精子庫實驗室、標本存儲室、輔助實驗室和檔案管理室等區域）不得少于115平方米，其中精子庫實驗室不少于40平方米和輔助實驗室的面積不少于20平方米。設備的要求和場地一樣，同樣要達到相應的設置（見2003年衛科教發176號文件《人類精子庫基本標準：人類精子庫儀器設備配制基本標準》的要求）。同時開展人類精子庫服務的醫療機構必須有能力為人類精子庫技術的開展提供全面支撐，如人類精子冷凍技術及供精者篩查所必需的各項檢驗及遺傳咨詢服務等。
3. 人員資質要求 包括人員數量、人員資格和人員技術水平三個方面的要求：1）人員數量：最少要求有5位專職的工作人員，其中，執業醫師1人，醫學遺傳學家1人，實驗室工
作人員2人，管理人員1人；2）人員資格和技術水平：臨床醫師必須是有高級專業技術職稱、從事生殖醫學專業的執業醫師；醫學遺傳學家應具有臨床遺傳學經驗和中級以上技術職稱；實驗室技術人員要求能掌握男科實驗室操作技能及世界衛生組織精液分析標準程序、生物細胞冷凍保存有關的知識及冷凍保存技術，掌握傳染病及各類感染，特別是性病的檢測及其它臨床檢驗知識和技能；管理人員則要求具有計算機知識和操作技能并有一定管理能力。
4.工作部門設置
主要分為精液采集部門、精液冷凍部門、精液供給部門、檔案管理部門、質量控制部門。
二、精子庫的管理
1. 制度化管理
1）要建立合理、可行的有關管理、技術操作規范的指南和準則；
2）要建立合理的分工責任制度，保證每個崗位都有專人負責；
3）自查制度，定時檢查所有制度、指南及準則的執行情況，核查這些制度規范是否合理，因此自查制度是制度化管理的核心。
2. 流程規范化管理
1）精液采集管理
精液采集部門負責供精者的發動、招募、篩查和精液采集。確保供精者為22～45周歲的中國公民，必須按《供精者健康檢查標準》進行嚴格篩查，保證所提供精子的質量。
2）輔助實驗室管理
輔助實驗室主要負責供精者篩選的各項實驗檢查。各工作人員必須認真執行世界衛生組織《男性學實驗室安全指南》，保證試驗人員安全，試驗結果可靠。
3）精液冷凍部門管理
精液冷凍保存部門負責進行供精者、自精保存者精液的冷凍、保存及廢棄銷毀等，操作運行須遵守衛生部的相關規定。
4）精液供給部門管理
精液的對外供給必須遵守如下原則：1）只能向由衛生行政主管部門批準開展輔助生殖技術的醫療機構提供冷凍精液；2）供給精液前，申請供精機構應填寫《人類精子庫供精申請表》。精子庫根據《申請表》的具體要求，選擇合適的冷凍精液； 3）人類精子庫不得提供新鮮精液或2人及2人以上的混合精液。不得提供未經檢驗或檢驗不合格的冷凍精液；4）必須對供精者及用精情況進行隨訪；5）精子庫必須根據精液使用反饋信息，以遞減方式決定精液發放數量；已使5名婦女妊娠的供者精液，應進入廢棄和銷毀程序； 8）人類精子庫不得提供新鮮精液進行供精人工授精，精液冷凍保存需經半年檢疫期并經復檢合格后，才能提供臨床使用。
5）檔案管理部門管理
人類精子庫應當建立供精者檔案，對供精者的詳細資料和精子使用情況進行計算機管理并永久保存，所有資料應備份，文字資料應放置整齊有序，注意防火、防盜，嚴格遵守保密原則。
