第49卷第8期2021年4月
廣州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 49 No. 8
Apr. 2021
永州丹參中丹參酮n a 含量測定及提取工藝優化*
*基金項目：科技特派員創新創業項目（No. 2019NK4153） o
通訊作者：陳小明，男，碩士，副教授，研究方向：藥物新技術、新工藝、新制劑。
馬欣然打蘇偉康打靳琦打何勇輝打陳小明?
（1湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州425100 ； 2湖南科技學院湖南省銀杏工程技術研究中心，
湖南永州425100 ； 3湖南恒偉藥業股份彳限公司，湖南永州425100）
摘 要：用乙醇回流提取法以丹參中丹參酮UA 含量為指標優化提取工藝。在單因素實驗的基礎上，對溫度、料液比、浸 泡時間、回流時間4個因素按照1^（3"）正交表進行正交試驗。再將所得供試品用高效液相色譜進行測定。研究發現，丹參中丹參
酮HA 的最佳提取條件為溫度70 °C 、料液比1:8、浸泡時間0. 5 h 、回流時間2 h，且根據峰面積得出丹參酮HA 含量2.010 mg/g 。結 果表明，高效液相色譜是測定丹參中丹參酮HA 含量科學、簡潔、準確、有效的檢測方法。
關鍵詞：丹參；丹參酮HA ；乙醇回流提取法；正交實驗法；HPLC 中圖分類號：R284.2
文獻標志碼：B
文章編號：1001 -9677（2021）08-089-04
Determination and Optimization of Tanshinone U A Content of
Salvia Miltiorrhiza in Yongzhou *
MA Xin-ran 1, SU Wei-kang 1, JIN Qi 1, HE Yong-hui 1, CHEN Xiao-ming?
（1 School of Chemistry and Bioengineering , Hunan University of Science and Engineering , Hunan Yongzhou 425100;2 Hunan Provincial Engineering Rearch Center for Ginkgo Folium , Hunan University of Science and Engineering ,Hunan Yongzhou 425100 ； 3 Hunan HENGWEI Pharmaceutical Co. , Ltd. , Hunan Yongzhou 425100, China ）Abstract : The optimum extraction process of tanshinone H A in Salvia miltiorrhiza by ethanol reflux extraction was studied. On the basis of single factor experiment , the orthogonal test was carried out according to the orthogonal table of four factors : temperature , ratio of material to liquid , soaking time and reflux time , according to the orthogonal table of four factors and three levels. The desired sample was determined by high performance liquid chromatography ( HPLC ). The results showed that the optimum extraction conditions of tanshinone R A in Salvia miltiorrhiza were as follows : temperature was 70 °C , material-liquid ratio was 1 ： 8, soaking time was 1 h , reflux time was 2 h. According to the peak area , the content of tanshinone U A was obtained 2.010 mg/g. This experiment showed that high performance liquid chromatography was a scientific , simple , accurate and effective method for the determination of tanshinone in Salvia miltiorrhiza.
Key words : Salvia miltiorrhiza Bge ； tanshinone H A ； ethanol reflux extraction ； orthogonal experiment method ； high performance liquid chromatography
丹參主要用于治療用于胸痹心痛，皖腹脅痛，癥痕積聚， 熱痹疼痛，心煩不眠，月經不調以及痛經經閉，古有“一味丹 參散，功同四物湯”之說⑷。其有效成分為脂溶性成分和水溶 性成分，而丹參酮HA 在脂溶性成分中占主要成分。丹參的抗
癌活性成分主要為丹參酮nA 和隱丹參酮，其中丹參酮H A 的 抗癌機制具體表現為以下幾個方面：（1）抑制癌細胞生長和增 殖；（2）誘導細胞調亡；（3）誘導癌細胞周期阻滯；（4）抑制癌 細胞入侵，遷移和轉移a"。丹參酮是一類從丹參及其相關物
種中分離出來的松香烷型二話類化合物，從結構上看，它們均 有四個環組成，包括四氫茶環A 和B，鄰或對醞，內酯環C 以 及咲喃環或二氫咲喃環D，目前已經分離出的丹參酮及其類似 物累計多達40余種3〕。丹參中丹參酮提取，傳統提取工藝主
要包括浸漬法、滲漉法、水蒸氣蒸憎法、有機溶劑回流提取及 連續回流提取法〔45。總體而言，傳統提取工藝普遍具有成本
低廉，操作簡單，設備要求低，然而雜質含量也相對偏高。超 臨界流體CO?萃取技術具有操作便捷，提取效率高，清潔環保 等優點「珂。與常規方法相比，分離效率高，分析時間短，分離 度極高，重復性好，為以后實驗以及開發利用提供依據，同時 為丹參提取物質量標準的提高提供參考依據。
1儀器與試劑
Agilent 1200高效液相色譜系統，美國安捷倫科技公司；
RE-201D 旋轉蒸發儀，長沙太康儀器設備有限公司；HH-4S
90
廣州化工2021年4月
電熱恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司；SHB-m 循環水 式多用真空泵，鄭州長盛實驗儀器有限公司；電熱鼓風干燥 箱，上海一恒科學儀器有限公司；分析天平，上海舜宇恒平科 學儀器有限公司。
永州丹參，恒偉藥業；丹參酮U A 對照品；乙睛為色譜 純，0. 02%磷酸；乙醇；其他試劑為分析純。
2方法與結果
2. 1實驗樣品的處理
藥材丹參來自恒偉藥業，丹參經過洗凈之后放入電熱鼓風 干燥箱，調節溫度至60弋（由于丹參酮屬熱不穩定物質，其大 部分在高溫下易分解），烘干取出。然后將其用粉碎機進行粉 碎，3號篩過濾，裝入密封袋中放置陰涼處。
2.2實驗溶劑的配置
2. 2.1對照品溶液的制備
取丹參酮UA 對照品適量，精密稱定，放置棕色量瓶中， 加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，即得。2. 2.2供試品溶液的制備
取本品粉末約0.3 g，精密稱定，放置錐形瓶中，精密加 入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率140 W，頻率 42 kHz ）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量， 搖勻，濾過，取上清液，即得。2. 2.3標準待測溶液的配制
標準待測溶液的配制主要是采用定量而變溶劑的體積達到 稀釋而不同濃度。具體步驟是用移液管精密量取對照品溶液1. 00 mL, 2. 00 mL 、3. 00 mL, 4. 00 mL, 5. 00 mL，然后用移液 管分別加入一定量的甲醇，經0.45 nm 微孔濾膜過濾，就分別 配制成了 濃度為 0. 20 mg/mL 、0. 40 mg/mL 、0. 60 mg/mL 、 0. 80 mg/mL 、1. 00 mg/mL 的標準品待測溶液。2. 2.4高效液相流動相的配制
本實驗以乙睛-0.02%磷酸（61 : 39）為流動相；檢測波長 為 270 nm o
2.3標準曲線的繪制
表1加樣回收實驗結果
Table 1 Experimental results of sample recovery
成分樣品量/g
丹參酮UA 含量/mg
加入量/mg
測得量/mg
回收率/%
平均回收率/%
RSD/%
5.00110. 152 1.00011. 12997.7
5.002
10. 354
1.00011.344
99.0
丹參酮n
a
5.0019. 502 1.00010. 4849& 29& 620. 663
5.003
10. 206
1.00011. 19598.95.0059.910
1.000
10. 903
99.3
2.5提取方法
精確稱取丹參粉末10 g，置于圓底燒瓶內，依據實驗要求 按照一定料液比加入95%乙醇，進行一定時間的浸泡處理，置 于恒溫水浴鍋，一定溫度下加熱回流提取1次，藥液經抽濾除 去固態雜質，得到供試品溶液，用高效液相色譜測出峰面積, 通過峰面積計算丹參酮n a 的含量。按下列公式計算丹參酮n
A 含量；
AxcxV
A^mXlO 3
xf
式中：X 代表供試品丹參酮UA 的含量，mg/g ； A 代表供試
用移液管精密量取對照品溶液1.00 mL 、2.00 mL 、3.00 mL 、 4.00mL 、5. 00 mL，然后用移液管分別加入一定量的甲醇，用 0. 45 nm 微孔濾膜過濾，分別配制成濃度為0. 20 mg/mL 、 0. 40 mg/mL 、0. 60 mg/mL 、0. 80 mg/mL 、1. 00 mg/mL 的標準 品，每次進樣10 piL，經過液相分析得出峰面積。以丹參酮U A 的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸分析。Y 二 77486X-5716. 3, R 2 = 0. 9999，說明丹參酮U A 的濃度與峰面 積在0. 20?1. 00 m^mL 范圍內呈良好線性關系。
80000
6000040000
彗 20000
°0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
丹參酮II A 濃度/（mg/mL ）
圖1標準曲線
Fig. 1 Standard curves
2.4精密度實驗
精密吸取同一濃度丹參酮U A 對照品（1 mg/mL ），平行進 樣分析5次，記錄峰面積。結果，丹參酮UA 峰面積的RSD 為 0. 28%（n = 5），表明儀器具有良好的精密度。2. 4.1穩定性實驗
選同一批且相同溶度供試品分別于0、1、2、4、8 h 進樣 分析3次，記錄峰面積。結果，丹參酮UA 峰面積的RSD 為1. 86% （n 二5），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內穩定性良 好。
2. 4.2加樣回收實驗
分別精密稱取已知丹參酮UA 含量的丹參粉末分別為5. 01 g 、 5. 02 g 、5. 01 名、5. 03 g 、5. 05 g
的 5 份，分別置于 250 mL 錐形 瓶中，精密加入質量濃度為1 mg/mL 標準品1.00 mL，按照 “2.2.2”中的供試品溶液配制的方法配制供試收率。實驗結果 如下表所示，以下列公式計算回收率：
加樣回收率二（測定量-丹參酮n A 含量）/加入量X100%
品丹參酮UA 峰面積；c 代表丹參酮UA 標準品的濃度，mg/mL ； V 代表最終定容體積，mL ； Al 代表丹參酮U A 標準品的峰面 積；m 代表試樣質量，g; f 代表稀釋倍數。
2.6設置單因素
設置單因素實驗考察溫度、料液比、浸泡時間、回流時間 對乙醇回流提取法從丹參中提取丹參酮n a 的工藝條件。
2. 6.1浸泡時間對含量的影響
稱取丹參粉末10 g，加入95%乙醇，按料液比（m 原料: v 溶劑）1 : 10，分別浸泡的時間為0、0.5 h 、1 h 、1.5 h 、2 h, 置于恒溫水浴鍋，70弋水浴回流1 h，分別計算不同浸泡時間
第49卷第8期馬欣然，等：永州丹參中丹參酮UA含量測定及提取工藝優化91
下的丹參中丹參酮U A含量。結果，丹參中丹參酮主要集中在其表皮部分，將其浸泡于乙醇中，粉末狀態使其表面積增大，可使其中丹參酮UA于乙醇充分接觸，溶解擴散于乙醇中。浸泡時間的增加，丹參酮UA含量逐漸上升，浸泡時間越長，其與乙醇接觸越充分，含量也逐漸提高，正交實驗選擇浸泡時間為1?2h。浸泡時間對含量的影響見圖2O
00.51 1.52
浸泡時間/h
圖2浸泡時間對含量的影響
Fig.2Effect of soaking time on the content
2.6.2料液比對含量的影響
稱取丹參粉末10g，加入95%乙醇，分別按料液比(ni原料: v溶劑)1：6、1：8、1：10、1：12、1：14，浸泡時間1h，置于恒溫水浴鍋，70弋水浴回流1h，分別計算在不同料液比下的丹參中丹參酮U A含量。結果，料液比從1：6增加至1：10，丹參中丹參酮UA含量逐漸提高，繼續增加料液比，丹參中丹參酮U A含量反而有所下降，增加料液比可以提高有效成分的擴散速度，有助于丹參中丹參酮UA從基質中溶出。其下降可能是因為料液比過大，導致樣品中一些非丹參酮類化合物溶解度增大，與丹參
酮UA競爭性溶出，從而干擾丹參酮UA的含量，使其含量下降。考慮到提取濃縮所需能量的消耗，正交實驗選擇料液比范圍為1：8?1：12。料液比對含量的影響見圖3。
2.0
3 1.5
g 1.0
0.5
0.0
1:61:81:101:12 1:14
料液比/(g:mL)
圖3料液比對含量的影響
Fig.3Effect of material liquid ratio on the content
2.6.3回流時間對含量的影響
回流時間/h
圖4回流時間對含量的影響
Fig.4Effect of reflux time on the content
稱取丹參粉末10g，加入95%乙醇，按料液比(m原料: v溶劑)1:10，分別浸泡時間1h，置于恒溫水浴鍋，分別進行70乞水浴回流0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，分別計算不同回流時間的丹參中丹參酮n a含量并研究該條件對含量的影響。結果，丹參酮u a的含量與回流時間呈負相關關系。隨著回流時間的增加，含量逐漸下降，因為回流時間太長會導致丹參酮UA的部分分解。因此選用合適的回流時間對含量的影響，正交實驗選擇回流時間0.5?1.5h。回流時間對含量的影響見圖4。
2.6.4反應溫度對含量的影響
稱取丹參粉末10g，加入95%乙醇，按料液比(in原料: v溶劑)1:10，浸泡時間1h，置于恒溫水浴鍋，分別進行60弋、65瓦、70弋、75弋、80弋水浴回流1h，分別計算在不同溫度下的丹參中丹參酮UA含量的影響。結果，隨著反應溫度的升高，丹參酮U A含量呈先增加后減少的趨勢，反應溫度過高，丹參酮UA含量逐漸下降，其一是因為丹參酮U A屬于熱不穩定物質，大部分在高溫下易分解；其二是因為溫度過高時接近乙醇沸點，可能乙醇汽化導致含量下降。因此，正交實驗選擇溫度范圍為65?75P。反應溫度對含量的影響見圖5O
圖5反應溫度對含量的影響
Fig.5Effect of reaction temperature on the content
2.7正交試驗
表2正交試驗因素水平表
Table2Factor level table of orthogonal test 水平
因素
料液比溫度代浸泡時間/h回流時間/h 11:865 1.00.5
21:1070 1.5 1.0
31:1275 2.0 1.5
表3正交試驗設計及結果
Table3Orthogonal experiment design and result
實驗序號
(A)
料液比
(B)
溫度/*
(C)
浸泡
時間/h
(D)
回流
時間/h
丹參酮n a
含量/(mg/g) 11111 1.831
21222 1.953
31333 2.005
42123 1.782
52231 1.894
62312 1.94
73132 1.682
83213 2.009
93321 1.847
K1 1.93 1.765 1.927 1.857
K2 1.872 1.952 1.861 1.858
K3 1.846 1.931 1.86 1.932
R0.0840.1870.0670.075
為了進一步的得到丹參酮UA的最佳制備工藝，根據單因素考察結果及參考文獻，采取三水平四因素的正交試驗如表2所示，以丹參酮U A的萃取率為指標，對浸泡時間，料液比,
92廣州化工2021年4月
回流時間，反應溫度進行進一步分析。得出結果如表3、表4所示。
表4方差分析
Table4Variance analysis
因素離差平方和自由度F比F臨界值顯著性
A0.0112 1.222 3.110
B0.06327.000 3.110*
C0.0092 1.000 3.110
D0.0112 1.222 3.110
誤差0.01
由表4可知，4個因素的極差分析結果為R b>R a>R d>R c，即影響丹參中丹參酮HA含量效果的因素依次為：反應溫度〉料液比〉回流時間〉浸泡時間，最佳實驗因素組合為
即最佳工藝條件為料液比為1:8、反應溫度為70七、浸泡時間為0.5h、回流時間為1.5h0由表4可知，反應溫度對實驗結果具有顯著性影響，而料液比、回流時間、浸泡時間等因素對實驗結果影響均不顯著。
3結論
經過對丹參酮口A的提取工藝的研究，得出以下結論：
(1)單因素實驗：浸泡時間為2h時丹參酮H A的含量最高；料液比為1:10時丹參酮口A的含量最高；回流時間為0.5h時丹參酮n a的含量最高；反應溫度為70°c時丹參酮n A的含量最高。
(2)正交試驗：當提取條件A1B2C1D3，即料液比為1：8、反應溫度為70咒、浸泡時間為0.5h、回流時間為1.5h。丹參酮n A的含量最高，提取含量為2010mg/g。
(3)用乙醇回流提取丹參酮n A是操作比較簡單的方法，且成本低，實用。能很好的適用于工業化生產，希望對其工業化擴大提供一定的依據，也能拓展永州丹參市場以及帶來一定的經濟效應同時為以后生活提供更廣泛的利用。
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(上接第48頁)
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