細胞色素C提取

2023年12月8日發(作者：虹怎么組詞)

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實驗一、細胞色素C的制備和測定

摘要：細胞色素C為含鐵卟啉的結合蛋白質，包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質。普遍存在于各類動植物組織和微生物中。它是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體。細胞色素C是一種細胞呼吸激活劑。在臨床上能夠糾正由于細胞呼吸障礙引發的一系列缺氧病癥，使其物質代謝、細胞呼吸恢復正常，病情取得減緩或痊愈。在自然界中，細胞色素C存在于一切生物細胞里，其含量與組織的活動強度成正比。本實驗以新鮮牛心為材料提取、制備和純化細胞色素C，取得其粗品溶液，并進行含量測定。

關鍵詞：細胞色素C 提取 制備 純化 含量測定

一、原理：

細胞色素C包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質總稱。普遍存在于各類動植物組織和微生物中。它是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，細胞色素C（cytochrome

c，CytC）只是細胞色素的一種。它在呼吸鏈上位于細胞色素還原酶和細胞色素氧化酶之間。線粒體中的細胞色素絕大部份與內膜緊密結合，僅有細胞色素C結合輕松，較易被分離純化。

細胞色素C為含鐵卟啉的結合蛋白質，每一個細胞色素C分子含有一個血紅素和一條多肽鏈。分子質量約為13000，蛋白質部份由104個左右的氨基酸殘基組成，其中賴氨酸含量較高，等電點，含鐵量。它易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。細胞色素C的傳遞電子作用是由于細胞色素C中的鐵原子能夠進行可逆的氧化和還原反映，故可分為氧化性和還原性，前者水溶液呈深紅色，后者水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱，酸和堿都比較穩固，但三氯乙酸和乙酸可使之變性，引發某些失活。

細胞色素C是一種細胞呼吸激活劑。在臨床上能夠糾正由于細胞呼吸障礙引發的一系列缺氧病癥，使其物質代謝、細胞呼吸恢復正常，病情取得減緩或痊愈。在自然界中，細胞色素C存在于一切生物細胞里，其含量與組織的活動強度成正比。本實驗以新鮮豬心為材料提取制備和純化細胞色素C，取得其粗品溶液，方式簡單易操作。

2 實驗材料和方式 材料：

新鮮（冷凍）豬心樣品。

試劑

① 1mol/L H2SO4 （L）：500mL

② 1mol/L NH4OH（L）：500mL

③ 12%BaCl2：250mL

④ 25%(NH4)2SO4：500mL

⑤ % NaCl：500mL

⑥ 20% 三氯乙酸（TCA）：100mL

⑦ 人造沸石：白色顆粒， 40-60目

⑧ 聯二亞硫酸鈉

⑨ 細胞色素C標準液（3mg/ml）

儀器：

① 絞肉機

②電磁攪拌器

③離心機

④分光光度計

⑤透析袋等

實驗方式：

2.4.1 材料處置

新鮮或冷凍豬心，除盡脂肪、血管和韌帶，洗盡積血，切成小快，放入絞肉機中絞碎（兩遍）。

2.4.2 細胞色素C粗品制備

2.4.2.1 提取：

稱取豬心碎肉200克，加自來水300毫升酸化水（水預先用6~8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用電磁攪拌器攪拌提取，再用1mol/L的硫酸調PH=（需要不斷調整），攪拌提取小時。用1mol/L的氨水調PH=，停止攪拌。四層紗布擠壓過濾，搜集濾液。

2.4.2.2 中和： 用1mol/L的氨水調濾液PH=，利用等電點沉淀雜蛋白，靜置20~30分鐘，使沉淀沉下。虹吸上部清夜，過濾除雜質，下部渾濁液離心（3000rpm,15min）。歸并取得的紅色清夜，測量體積。

2.4.2.3 吸附：

每人稱取人造沸石4g，加水攪拌，除去12s內不下沉的細顆粒。向柱內加去離子水至1/2體積，然后邊攪拌邊持續、均勻地將預處置好的人造沸石水溶液裝填入柱，幸免柱內顯現氣泡。裝柱完畢，打開柱下端夾子，使柱內沸石面上剩下一薄層水。

將中和好的澄清濾液警惕加到沸石上面，勿沖動沸石，使之流入柱內進行吸附，操縱流出液的速度不超過10ml/min。隨著細胞色素C被吸附，人造沸石由白色變成紅色，流出液應為淡黃色或微紅色。

2.4.2.4 洗脫

吸附完畢，可在柱內洗滌：依次用30ml自來水、去離子水、%氯化鈉溶液、去離子水洗柱。然后用25%硫酸銨溶液洗脫（流速小于2ml/min），搜集紅色洗脫液（洗脫液一旦變白，當即停止搜集），測量體積（操縱在15ml左右）。洗脫完畢，人造沸石回收，可再生利用。

2.4.2.5 鹽析

為了進一步提純細胞色素C，向洗脫液中緩慢加入固體硫酸銨，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液濃度為45%（約相當于67%的飽和度，即100ml洗脫液加17g硫酸銨），放置留宿，雜蛋白沉淀析出，過濾，搜集紅色透亮的細胞色素C濾液，測量體積。

2.4.2.6 TCA 沉淀

按8%體積滴加20%TCA，邊加邊攪拌。現在細胞色素帶正電荷，與其結合生成可逆沉淀析出，當即離心（3000rpm，15min）,搜集沉淀（假設上清液仍為紅色，倒出后再補加5%體積的TCA，再次離心，搜集沉淀）。沉淀用少量去離子水溶解（體積不超過10mL）。

2.4.2.7透析

溶解液裝入透析袋對自來水（30min）、去離子水（10~20min）透析（用磁力攪拌器攪拌），用BaCL2 檢測袋周圍水的SO4（用試管搜集流下來的2?透析液約1ml，滴加1-2滴BaCL2試劑至試管中。搖勻假設無白色沉淀，表示透析完全）。過濾除去不溶物質，取得細胞色素C的粗品液，量體積，測定其含量。

3 結果與分析

以細胞色素C的濃度（mg/ml）為橫坐標，以吸光度A520nm為縱坐標制作標準曲線，按表1繪制細胞色素C含量的標準曲線(圖1)，從標準曲線上按公式：

計算出樣品液中細胞色素C的質量（mg）。

試管編號

標準溶液（ml）

蒸餾水（ml）

還原粉（聯二亞硫酸鈉）

A520nm

1

0

4

2

3

4

5

6

7（樣品液)

(ml）

8

0

少許（約3mg）

圖1 細胞色素C標準曲線

標準曲線0.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.0000.000.10y = 0.8284x + 0.0035R = 0.99792吸光度0.200.300.40濃度0.500.600.700.80C

C色素= =（mg/ml）

注意事項：

(1) 酸水提取時，由于組織液的釋出使pH上升，因此需不斷調整pH直至穩固在。 (2) 為使細胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附時流速應該慢些。洗脫時一樣操縱流速慢些，使細胞色素C在比較少體積內被充分洗脫出來。

(3) 鹽析時需加入粉末狀硫酸銨，而且邊加邊攪拌，切忌一下子到進去，造成局部濃度過大使細胞色素C被鹽析。

(4) 三氯乙酸是一種蛋白變性劑，可使蛋白質變性沉淀。要通過操縱三氯乙酸的濃度和作歷時刻，使其產生的是可逆沉淀，達到進一步純化作用。因此必需要逐滴加入三氯乙酸，攪勻后盡快離心，幸免局部酸濃度過大和接觸時刻太長，產生細胞色素C不可逆變性沉淀造成損失。

(5) 透析脫鹽是利用細胞色素C分子較大，不能通過必然截留值的半透膜，而其中的鹽分由于分子較小，濃度很高，容易透過半透膜從高濃度向低濃度的水相移動，達到去除成效。而且在透析前必然要檢查透析袋有無滲漏。

(6) 為盡可能減少損失，在每一個操作進程都要細心，例如過濾用的紗布、濾紙事前必然要用少量水潤濕。

(7) 加入過量還原粉（聯二亞硫酸鈉）會使測定溶液迅速變混濁而無法比色，因此加入量應嚴格操縱，并迅速比色。

4 試探題

1、試以細胞色素C的制備為例，總結出蛋白質制備（分離純化）的要緊方式，并簡述其原理。

答：（1）透析和超濾：利用大分子不能透過半透膜，而小分子能夠穿過半透膜，從而達到分離純化的目的；（2）等電點沉淀：利用蛋白質在其等電點的溶解度最小，且不同蛋白質的等電點不相同，從而達到分離純化的目的；（3）鹽析：利用蛋白質在鹽溶液中可產生可逆沉淀而達到分離純化的目的；（4）有機溶劑沉淀（5）電泳（6）親和色譜

2、本實驗應用了哪些大體的生化分離純化的方式？

答：（1）透析；（2）等電點沉淀；（3）鹽析；（4）層析

3、有哪些方式能夠進行蛋白質脫鹽處置？

答：（1）透析；（2）凝膠過濾

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