紅蓮子草耐寒無性系選育研究

2023年12月12日發(作者：文學性)

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中國園藝文摘２０１　１年第９期　紅蓮子草耐寒無性系選育研究　明　月　李琦王哲徐娜姜長陽　（遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連１　１　６０２９）　摘要：為滿足人們觀賞栽培的需求，以能越冬的紅蓮子草嫩莖為材料，進行愈傷組織誘導、低溫處理、冷凍處　理、復凍處理，愈傷組織分化、試管苗生根與繼代增殖培養，以及試管苗移栽和定植的研究，建立起紅蓮子草耐　寒無性系。結果證明：ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ為嫩莖愈傷組織誘導和耐　凍愈傷組織繼代增殖培養的理想培養基；１／２　ＭＳ＋蔗糖５０　ｇ／Ｌ是復凍后增殖培養的愈傷組織分化的理想培養基；　Ｎ。＋ＮＡＡ　Ｏ．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖Ｉ　５　ｇ／Ｌ是生根培養和生根繼代增殖培養的理想培養基；移植到水庫岸邊的　試管苗保持了紅蓮子草的所有生物學性狀，且連續５年正常越冬。　關鍵詞：紅蓮子草；組織培養；耐寒選育；無性系　紅蓮子草（Ａｌｔｅｍａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ）又叫紫葉草、　１．２培養條件　滿天星、蓮子草等，屬于莧科蓮子草屬多年生草本植物【１］。　參見黃葳等小花鬼子針的研究　。　主要生長于高溫高濕地區河岸、水邊或沼澤等環境中。原　１．３試驗方法　產于巴西，在華東以南地區的淺水處也有成片生長，現在　１．３．１愈傷組織的誘導與分化把無菌嫩莖切成長約０．３　ｃｍ　我國多有盆栽［２１。紅蓮子草可作飼料，且具有一定的藥用價　的莖段后，搠榧ＩＩＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　值。但由于紅蓮子草莖葉為紅紫色，所以，無論是南方的　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ培養基上，進行愈傷組織的誘導培　地栽，還是我國各地的盆栽，幾乎都是以觀賞目的進行栽　養。愈傷組織的誘導培養進行３次重復試驗，每種處理接種　培的。由于大連地區冬季較為寒冷，因此多年來只能對其　培養２００個材料。　進行盆栽。為了美化環境，有人于春末將其成片的栽培到　１．３．２愈傷組織的低溫處理當上述繼代培養的愈傷組織　水庫邊緣的淺水處，幾乎都是春天成片栽培紅蓮子草，到　生長非常旺盛時，轉移到光照２　０００　ｌｘ、溫度為２＂Ｃ的培養　冬天就凍死。但在２００３年栽培的紅蓮子草中，發現了１株紅　箱中進行愈傷組織的低溫處理１０　ｄ，而后再放到正常的條　蓮子草能夠越冬，未被凍死。觀察證明，這種蓮子草雖然　件下恢復培養１０　ｄ。低溫處理試驗重復３次，處理的愈傷組　可在寒冷地區越冬，但卻不能結出種子。用扦插的方法對　織分別為５８塊、６４塊和６２塊。　其進行繁殖，約１５％的扦插苗仍能越冬。為滿足人們對耐　１．３．３愈傷組織的冷凍處理把經過低溫處理恢復培養后　寒紅蓮子草栽培的需求，我們對紅蓮子草愈傷組織進行了　成活的愈傷組織，接種到相同的培養基上進行增殖培養２代　進一步的耐寒選擇。雖然目前已有栽培植物耐寒選擇的報　后，再放到溫度為一８℃的培養箱中進行冷凍處理１０　ｄ，而　道【３一，并有愈傷組織選擇效應的報道　，但迄今未見莧科　后放到溫度為２℃的培養箱中進行愈傷組織的低溫處理　植物通過愈傷組織進行耐寒選擇的報道。　１０　ｄ，接著再放到正常的條件下恢復培養１０　ｄ。冷凍處理　ｌ材料與方法　試驗重復２次，處理的愈傷組織分別為１２６塊和１１４塊。　１．１材料及滅菌　１．３．４冷凍后成活愈傷組織的繼代增殖培養把成活的細　６月上旬，將大連大西山水庫邊上人工扦插已經越冬的　胞團剝離出來，接種到ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｎａｇ／　紅蓮子草嫩莖采回實驗室后，用清水沖洗１　ｈ左右，切成長　Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ的培養基上，置于常溫環　約４　ｃｍ的莖段后，放到２５０　ｍｌ的磨口廣口瓶中，先用　境中進行愈傷組織的增殖培養。冷凍后的愈傷組織連續進　０．０５％的安利液洗滌３次（每次約１０　ｍｉｎ），再用蒸餾水振蕩　行６代增殖培養。　洗滌２次，然后將材料移到超凈工作臺上。在無菌條件下用　１．３．５愈傷組織的復凍處理及繼代增殖培養把上述經過　７５％的乙醇滅菌１５　ｓ左右后，用０．０５％的ＨｇＣｌｚ溶液振蕩滅　冷凍處理進行第６代增殖培養的愈傷組織培養￣１１４２　ｄ、當增　菌１３～１４　ｒａｉｎ，最后用無菌水振蕩洗滌５次，將嫩莖表面殘　殖培養的愈傷組織外觀上生長很旺盛時，再將其放到溫度　留的滅菌劑洗去后，即獲得無菌材料［６１。　為一ｌ０℃的培養箱中復凍處理１２　ｄ，接著再在正常的條件下恢　復培養１０　ｄ后，統計成活率。接著將成活的愈傷組織接種到　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２．４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｒａｇ／　第一作者簡介：明月（１９８８＿），女，本科；就讀于遼寧師范大　Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ的培養基上，進行５代增殖培養。　１．３．６復凍后愈傷組織的分化培養把經過復凍后增殖培　學生命科學學院。　養的愈傷組織分散為由６－ｌＯ￣－顆粒組成、直徑為０．２－０．３　ｃｍ　通訊作者：姜長陽，教授。Ｅ－ｍａｉ１：ｃｈａｎｇｙａｎｇｊｉａｎｇ＠１２６．ｃｏｍ　的塊狀后，分別接種到附加蔗糖３０　ｇ／Ｌ的ＭＳ、１／２　ＭＳ、１／４　項目來源：遼寧省高等教育教學改革資助項目（２００９０３０４）；遼寧　ＭＳ、Ｂ５、Ｗｈｉｔｅ、Ｎ６，ＮＭＳ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、１／２　ＭＳ＋ＩＢＡ　師范大學教學改革資助項目（ＬＳＪＧ：２００９０１０８）。　０。３　ｍｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、Ｂ５＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、　一１　９—　ＣＨ　Ｉ　ＮＥＳＥ　ＨＯＲＴ　ｌ　ＣＵＬＴＵＲＥ　ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ　Ｗｈｉｔｅ＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ、Ｎ６＋ＩＢＡ　０．３　ｍｇ／Ｌ　１２種培養基　上，進行愈傷組織的分化培養。愈傷組織的分化培養試驗進　養和繼代培養的結果說明：ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／［　十２，４一Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｒａｇ／Ｌ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ這一培養基為紅　行２次重復，每種培養基接種培養１　００塊愈傷組織。　蓮子草嫩莖愈傷組織誘導和繼代培養的理想培養基。　１．３．７不定芽的生根培養及試管苗的生根繼代培養把在　２．２低溫處理對愈傷組織的影響　低溫處理恢復培養１０　ｄ后統計證明：３次重復試驗的平　均成活率為２７％。觀察表明，經過低溫處理的愈傷組織，　在恢復培養中，大部分變成褐色，并逐漸死亡，即使成活　１／２　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ這種培養基上分化培養的高２　ａｍ左右　的不定芽從基部剪下后，分別接種到附２１ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋　蔗糖１５　ｇ／Ｌ的１／２　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、Ｗｈｉｔｅ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ、Ｎ６＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ　的愈傷組織塊在恢復培養中也會有約半數的細胞死亡。　４ｆＰ培養基上，進行不定芽的生根培養。每種培養基接種培　養１２０個不定芽。　２．３冷凍處理對愈傷組織的影響　冷凍處理恢復培養１０　ｄ后觀察統計證明：２次重復試驗　經過冷凍處理的２４０塊愈傷組織。在其中３塊愈傷組織中，　把生長旺盛的試管苗剪成至少具有２個葉片、長１．５　ｃｍ　的莖段后，接種到相同的培養基上，進行生根繼代培養。　連續進行６代生根繼代培養。　１．３．８試管苗的移栽和定植４Ｂ中旬，把上述生根繼代　各自發現１個未被凍死的愈傷組織細胞團。細胞團的直徑分　別為０．１　ｃｍ、０．１１　ｃｍ和０．０８　ｃｍ。成活的細胞團經過恢復　培養仍呈淺綠色、顆粒狀。　培養的試管苗在溫室中煉苗３　ｄ后，移栽到上層為干凈河　沙、下層為肥沃園土的營養缽中。移栽后１０　ｄ內保持無直　射光、溫度２０～３０℃、濕度９０％左右的環境條件，而后進行　正常管理。移栽試驗進行２次，移栽株數為４００株、６００株。　２．４冷凍后成活愈傷組織的繼代增殖培養　統計證明：冷凍后第１代增殖培養僅有１個細胞團成活　生長，成活率為３３％。成活后的愈傷組織生長較緩慢，經　過４５　ｄ的培養，所培養的綠色顆粒狀、半球形的愈傷組織　塊平均直徑為０．５　ｃｍ左右。第２～６代生長速度加快，不僅　愈傷組織的生長率近１００％，而且經過４２　ｄ的培養，就會培　養出一代表面由綠色顆粒狀組成、平均直徑為１．４　ｃＩｎ的半　５月下旬，把在溫室中移栽成活并開始正常生長的試管苗　定植到水庫邊上。定植試驗進行２０：，分別定植３０　口５００昧。　２結果與分析　２．１　嫩莖愈傷組織的誘導效果與不同培養基對愈傷　組織顆粒分化培養的效應　接種培養到第８天時，在有的培養嫩莖切口處形成可見　愈傷組織。隨后不僅形成愈傷組織的莖段數不斷增加，而且　已形成的愈傷組織也不斷生長。培養ｆｌＪ４５　ｄ時統計證明：在　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２。４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｇ／Ｌ＋　球狀愈傷組織塊，并且增殖培養的愈傷組織塊外觀上生長　旺盛，平均每ｌ代的增殖率５倍左右。　２．５愈傷組織的復凍處理及繼代增殖培養　統計證明：經過復凍處理，并進行恢復培養１０　ｄ的愈　傷組織成活率為７１％。第１代增殖培養增殖２．１倍，第２～６代　的平均增殖５．１倍。增殖培養的愈傷組織呈淡綠色、表面為　顆粒狀半球形，外觀上生長旺盛。這樣的愈傷組織為具有　分化能力的愈傷組織。　蔗糖３０　ｇ／Ｌ培養基上，培養莖段愈傷組織的誘導率為９９％，　并且都生長為表面由綠色顆粒狀組成、大小為１．１～１．８ｃｍ的　愈傷組織塊。把上述誘導培養的愈傷組織切割為直徑約為　０．４　ｃｍ的愈傷組織塊后，接種到相同的培養基上，進行愈傷　組織的繼代培養。３０￣重復誘導培養試驗，每次繼代培養４代。　繼代培養的統計結果證明：經過４２　ｄ的培養，就會培養出１代　與誘導培養４５　ｄ基本一致的愈傷組織。上述愈傷組織的誘導培　附表２．６不同培養基對復凍后愈傷組織分化培養的影響　培養１０　ｄＥ右在有的培養基上可見在愈傷組織上部分化出　綠色的芽點，接著，伴隨分化芽點數量的增加，先分化的芽點　逐漸生長成為不定芽。培養ＮＳ０　ｄ統計，２次重復試驗的平均　結果見附表。由附表可見：在ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ、１／２　ＭＳ＋蔗　不同培養基愈傷組織對分化培養的影響　一２０—　中國園藝文摘２０１　１年第９期　糖３０　ｇ／Ｌ、１／４　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ、Ｗｈｉｔｅ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ　４種　培養基上復凍后的愈傷組織能分化。其中在１／２　ＭＳ＋蔗糖　３０　ｇ／Ｌ這種培養基上，分化率為９３．５％，并且分化的不定芽　數多，株高２．１　ｃｍ，平均具有４．３個葉片，外觀上長勢好。２次　重復試驗的結果基本一致。這說明：１／２　ＭＳ＋蔗糖３０　ｇ／Ｌ這　該研究的分化培養中，在沒有任何植物生長調節劑的　培養基上的愈傷組織分化的效果最理想。王琳等　在銀粉背　蕨的研究中也觀察到同樣的現象。產生這種現象并不意味　這種愈傷組織的分化不需要植物生長調節劑，而是由于在　復凍后繼代增殖培養愈傷組織的培養基中加入了較高濃度　種培養基是復凍后增殖培養的愈傷組織分化的理想培養基。　的植物生長調節劑，分化培養時，愈傷組織中仍然殘留著　一２．７不定芽的生根培養及試管苗的生根繼代培養　觀察表明，在４種培養基上，培養的不定芽均可生根。培　養至【Ｊ２８　ｄＨ捌寸證明：￣ＡＮ６＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｎａｇ／　定濃度的生長調節劑；同時，在培養過程中，增殖培養　生長旺盛的愈傷組織自身也能合成一些植物生長調節劑。　這２種來源的生長調節劑的濃度已經達到了能使愈傷組織分　化的水平。所以，在分化培養的培養基中就不需要再加入　植物生長調節劑。　在該研究進行冷凍篩選的２４０塊愈傷組織中，出現３個　未被凍死的細胞團。雖然這３個細胞團的直徑僅為０．１　ｃｍ　左右，但都是由數千個細胞組成的。實際上，這３個細胞團　是由３個耐凍細胞分裂形成的，其細胞團是在愈傷組織增殖　生長培養過程中分裂形成的。這３個耐凍細胞是在進行冷凍　處理前就已經發生了耐凍變異，在進行一８℃冷凍處理時，　Ｌ＋蔗糖１５　ｇ／Ｌ這種培養基上生根效果最好，不僅生根率為　９４．　、平均每株生根數為６．３條、試管苗平均高度為３．９　ｃｍ，　而且培養５　ｄ就會生長出可見根，外觀上試管苗生長旺盛。　６代的生根繼代培養結果證明：每次生根繼代培養的周　期為２５　ｄ，生根率為９８．６％，所培養的試管苗長勢與不定　芽生根培養基本一致。每個周期的繁殖系數為２．８。按照這　個速度，采用生根繼代的方法進行繁殖，每年的繁殖速度　為２．８１４－６（幾千萬）株試管苗，這種繁殖速度完全可滿足人們　栽培和研究的需求。　其他不耐凍細胞被凍死，而這３個耐凍細胞被篩選出來。這　３個耐凍細胞的耐凍適應性屬于先期適應［翻。　參考文獻：　［１］包滿珠．花卉學［Ｍ］．北京：中國農業出版社，２００３．　［２］吳玲．濕地植物與景觀［Ｍ］．北京：中國農業出版社，２０１０．　［３］王琦，王豁然．桉樹耐寒選育及測定［Ｊ］．桉樹科技，１９９７，（１）：　１－４．　２．８試管苗的移栽和定植　移栽后觀察表明，移栽后８　ｄ可見成活并生長。移栽后　３０　ｄ統計證明：２次移栽的成活率分別為９２．３％￣Ｎ９４．７％。　定植３０　ｄ統計結果證明：２次定植的平均成活率為　９９．３％。觀察表明，定植成活的試管苗前４０　ｄ生長緩慢，　后期生長速度加快，并保持了紅蓮子草的所有生物學性狀。　對定植大連大西山水庫邊上越冬的試管苗連續進行３年　的觀察，第１年越冬率為９５．６％，第２年越冬率為９４．９％；第３　［４］李紅艷，李建國，張耀芳等．輻射誘變愈傷組織選育耐寒型蕨菜　［Ｊ］．遼寧大學學報．２０１０，３７（３）：２７４—２７７．　［５］王洪慶，王關林，姜長陽等．輻射聚合草花藥愈傷組織的效應　［Ｊ］．中國草地，１９８８，９（６）：３５—３７．　年越冬率９６．１％。３年的越冬結果說明，通過紅蓮子草耐寒植　株愈傷組織冷凍處理所獲得的試管苗，是獲得了耐寒性狀的　紅蓮子草無性系，這種耐寒試管苗在大連地區能正常越冬。　３討論　該研究是通過對愈傷組織冷凍處理而獲得了抗凍無性　系。這種對愈傷組織進行篩選的方法具有篩選的數量巨大、　容易操作等其他篩選無法替代的特點，這為抗性植物的選　育探索出一條新途徑。　［６］黃葳，施玉婷，楊微等．小花鬼子針組織培養及無性系建立的研　究［Ｊ］．中國園藝文摘，２０１０，（５）：９－１２．　［７］王琳，王曉麟，藺博超等．銀粉背蕨的組織培養及無性系建立的　研究［Ｊ］．黑龍江農業科學，２００８，（３）：４－６．　［８］李難．進化論教程［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００４．　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｃｏｌｄ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｃｌｏｎａｌ　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａ　ｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ　ＭＩＮＧ　Ｙｕｅ　ＬＩ　Ｑｉ　ＷＡＮＧ　Ｚｈｅ　ＸＵ　Ｎａ　ＪＩＡＮＧ　Ｃｈａｎｇ－ｙａｎｇ　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｍｅｅｔ　ｔｈｅ　ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　ｎｅｅｄ　ｏｆ　ａｐｐｒｅｃｉａｔｅｌｙ　ｗａｔｃｈ　ａｎｄ　ｒｅａｌｉｚｅ　ａｒｔｉｉｆｃｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｔｅｎｄｅｒ　ｓｔｅｍｓ　ｏｆ　Ａ　ｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ｔｏ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｒｅｆｒｅｅｚｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，　ｃａｌｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｒｏｏｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｉｅｌｄ　ｐｌａｎｔｉｎｇ　ｏｆ　ｔｅｓｔ－ｔｕｂｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ，ｆｉｎａｌｌｙ　ｔｈｅ　ｃｌｏｎｅ　ｏｆ　ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓ—　ｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ａ　Ｉｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｌｄｅｓ　ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＭＳ＋ＢＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋２，４－Ｄ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＮＡＡ　０．５　ｍｓ／Ｌ＋　ｓｕｃｒｏｓｅ３０　ｓ／Ｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｃａｌｌｕｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｃａｌｌｕｓ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ；１１２　ＭＳ＋ｓｕｃｒｏｓｅ　３０　ｓ／Ｌ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒｅｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｃａｌｌｕｓ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｒｏｏｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ　ｗａｓ　Ｎ６＋ＮＡＡ　Ｏ．１　ｍｇ／Ｌ＋ＩＡＡ　０．４　ｍｇ／Ｌ＋ｓｕｃｒｏｓｅｌ５　ｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｔｅｓｔ—ｔｕｂｅ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｗｈｉｃｈ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｔｏ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　ｓｈｏｒｅ　ｃｏｕｌｄ　ｋｅｅｐ　ａｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｔｒａｉｔｓ　ａｎｄ　ｗｉｎｔｅｒ　ｎｏ卜　ｍａｌｌｙ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ　ｙｅａｒｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｌｔｅｒｍｍｔｈｅｒａ　ｐａｒｏｎｙｃｈｉｏｉｄｅｓ；ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ；ｃｏｌｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ；ｃｌｏｎｅ　一２１—　

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