引物設計(引物設計軟件primer)

引物設計原則是什么？

一、引物設計有3條基本原則：

1、引物與模板的序列要緊密互補。

2、引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。

3、再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

二、PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設計。

擴展資料：

引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3’的下降形狀也有利于引物與模板的結合；

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利于正確引發反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少于20%，-10時接近于0。

參考資料來源：百度百科-引物設計

引物設計的引物設計原則

1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大于38bp；

2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3’的下降形狀也有利于引物與模板的結合；

4、引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。

擴展資料：

引物設計是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利于正確引發反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少于20%，-10時接近于0。

參考資料來源：百度百科-引物設計

如何設計引物?

2.在框中粘貼入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點)
3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定
4.點擊"pickup primers"就會出現下一頁,上面會列出多種設計,一般來說,第一對引物是最適合的.
同時引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：
(1) 引物長度約為16-30bp,太短會降低退火溫度影響引物與模板配對,從而使非特異性增高.太長則比較浪費,且難以合成.
(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).
(3) 四種堿基應隨機分布,在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發.
(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應,以減少由于密碼子擺動產生的不配對.
(5) 在引物內,尤其在3'端應不存在二級結構.
兩引物之間尤其在3'端不能互補,以防出現引物二聚體,減少產量.兩引物間最好不存在4個連續堿基的同源性或互補性.
(7) 引物5'端對擴增特異性影響不大,可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護堿基.
引物不與模板結合位點以外的序列互補.所擴增產物本身無穩定的二級結構,以免產生非特異性擴增,影響產量.
(9) 簡并引物應選用簡并程度低的密碼子,例如選用只有一種密碼子的Met,3'端應不存在簡并性.否則可能由于產量低而看不見擴增產物.

引物設計原則是什么?

引物設計的原則是：

1、引物最好在模板cDNA的保守區內設計。

2、引物長度一般在15-30堿基之間。

3、引物GC含量在40%-60%之間，Tm值最好接近72℃。

4、引物3′端要避開密碼子的第3位。

5、引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

6、堿基要隨機分布。

7、引物自身及引物之間不應存在互補序列。

8、引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。

9、引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

10、擴增產物的單鏈不能形成二級結構。

11、引物應具有特異性。

常用引物設計軟件

1、Oligo 6

Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設計軟件，除了可以簡單快捷地完成各種引物和探針的設計與分析外，還具有很多其他同類軟件所不具有的高級功能：已知一個PCR引物的序列，搜尋和設計另一個引物的序列；按照不同的物種對MM子的偏好性設計簡并引物；對環型DNA片段，設計反向PCR引物；設計多重PCR引物。

2、Primer Premier 5.0

Primer Premier 5.0是一種用來幫助研究人員設計最適合引物的應用軟件利用它的高級引物搜索引物數據庫巢式引物設計引物編輯和分析等功能可以設計出有高效擴增能力的理想引物也可以設計出用于擴增長達50kb以上的PCR產物的引物序列。

引物設計原則是什么?

引物設計有 3 條基本原則：

首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)。

形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（duplexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（fal priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。

一、引物與模板的序列要緊密互補。

二、引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。

三、再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

引物的設計原則

引物設計原則

1、長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。

2、G十C含量：應在40%一60%之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。

3、堿基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G十C富集序列區錯誤引發。

4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。

5、引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。

6、上下游引物的互補性：一個引物的3‘末端序列不允許結合到另一個引物的任何位點上。

7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應為G或C。

8、引物應當超出限制性內切酶識別位點至少3個核苷酸。

擴展資料

引物合成

1、是將預先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基。

2、合成DNA的原料，亞磷酰胺保護核苷酸單體，與活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，它的3′端被活化，5′-羥基仍然被DMT保護，與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應。

3、帶帽(capping)反應，縮合反應中可能有極少數5′-羥基沒有參加反應(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續發生反應，這種短片段可以在后續環節根據實驗需要來選擇純化方式分離掉。

4、在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。

參考資料來源：百度百科—引物設計