葉綠素含量測定

測葉綠素的方法

葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、光聲光譜法和高效液相色譜法。不過目前應用最為廣泛的還是分光光度法。
葉綠素提取液的吸收光譜表明：有兩個強吸收峰，分別在紅光區和藍紫區，不同提取溶劑和原料所得的葉綠素溶液的吸收光譜比較相似。葉綠素a、葉綠素b的紅區最大吸收峰分別在663nm、645nm附近，在藍紫區分別為429nm、453nm附近。由于提取溶劑和原料不同，對葉綠素提取液進行光譜掃描后，所得的最大吸收值可能有較小范圍的浮動。
高效液相色譜(HPLC)定量檢測葉綠素含量準確率較高，效果很好。用甲醇和丙酮作為流動相，體積比為80：20時，同時在流動相中加入質量分數為0.1%的冰醋酸，流速為1.0mL/min。利用每一種色素的色譜峰面積進行定量，葉綠素a、葉綠素b的定量可通過外標法由工作曲線求得。[8]
穩定性影響因子
光
在活體植物中，葉綠素得到了很好的保護，既可以發揮光合作用，又不會發生降解。但離體葉綠素對光照很敏感，光和氧氣作用可導致葉綠素不可逆的分解。在自然條件或以膠態分子團存在的水溶液中，葉綠素在有氧的條件下，可進行光氧化而產生自由基，因此一些研究人員認為葉綠素的光氧化降解必需有氧分子參與，而且其降解速率隨氧分子濃度的升高而加快。單線態氧和羥基自由基是葉綠素光化學反應的活性中間體，可與葉綠素吡咯鏈作用而進一步產生過氧自由基和其他自由基，最終可導致卟啉環和吡咯鏈的分解既而造成顏色的褪去。當然影響光氧化的因素有很多，比如體系中的水分、溫度、光照時間、光照強度、光的波長范圍等等，在這些影響因素中主要有光照時間、光照強度、光的波長范圍、氧的濃度。目前在此方面的研究主要集中在自然光(復合光)對色素的影響而且大多數研究不是很深人。對于單色光(不同波段的光)對葉綠素穩定性的影響研究方面的報道卻較少。
葉綠素酶
已有研究表明，葉綠素酶是一種糖蛋白。葉綠素酶催化葉綠素結構中的植醇鍵而水解生成脫植葉綠素，是葉綠素降解中的關鍵酶。葉綠素酶是以葉綠素作為底物的，它是一種酯酶。脫鎂葉綠素也是葉綠素酶的底物，酶促反應的產物是脫鎂脫植葉綠素。葉綠素酶的最適反應溫度在60～80℃范圍，實驗證明，葉綠素酶在80℃以上其活性下降，100%時已完全失活。
溫度
一些研究表明，葉綠素提取液在不同受熱溫度下，其降解速率曲線有明顯的拐點，葉綠素在80℃以下，降解速度較慢，90℃以上降解速度急劇加快。總體而言，隨著溫度的升高，葉綠素降解的速率是逐漸加快的，只是較低的溫度下降解速率不明顯。
pH值

葉綠素含量測定

常用葉綠素提取試劑： 丙酮 、乙醇、 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)
提取方法：研磨、浸泡
丙酮法測定葉綠素含量
乙醇:丙酮:H2O = 4.5:4.5:1 (體積比)
提取方法對比：
常規方法是研磨提取
改進方法是浸泡提取
提取注意事項：

葉綠素a = (12.72A663-2.59A645) × v/w × 1,000
葉綠素b = (22.88A645-4.67A663) × v/w × 1,000
葉綠素總含量 = (20.29A645+8.05A663) × v/w × 1,000

葉綠素含量的測定

葉綠素含量的測定，葉綠素的含量與植物光合作用及氮素營養有密切的關系,在科學施肥、育種 及植物病理研究上常有測定的需要。

一、目的 掌握葉綠素a、b 含量測定的基本原理和方法。 葉綠素含量的測定葉綠素的含量與植物光合作用及氮素營養有密切的關系,在科學施肥、育種 及植物病理研究上常有測定的需要。

二、葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，是一類含脂的色素家族，位于類囊體膜。葉綠素吸收大部分的紅光和紫光，但反射綠光，所以葉綠素呈現綠色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。

葉綠素為鎂卟啉化合物，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細菌葉綠素等。葉綠素不很穩定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素有造血、提供維生素、解毒、抗病等多種用途。

葉綠素含量的測定

取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3ml95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續研磨至組織變白。靜置3～5min。

取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100ml棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至100ml，搖勻。取葉綠體色素提取液在波長665nm、645nm和652nm下測定吸光度，以95％乙醇為空白對照。

葉綠素含量的測定及計算結果

葉綠素含量的測定及計算結果如下：

葉綠素a、b在紅光區的最大吸收峰分別為663nm和645nm，可用以下聯立方程求葉綠素溶液中的葉綠素a、b的含量。

D663=82.04Ca9.27Cb……………………(1)

D645=16.75Ca45.6Cb……………………(2)

式中D663、D664分別為波長663nm和645nm處測定葉綠素溶液的光密度；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(g/L)；82.04、9.27分別為葉綠素a、b在波長663nm時的比吸收系數，16.75、46.6分別為葉綠素a、b在波長645nm時的比吸收系數。

解聯立方程(1)、(2)則得：

Ca=0.0127D663-0.00269D645……………(3)

Cb=0.0229D645-0.00468D663……………(4)

如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，(3)、(4)式則可改寫為：

Ca(mg/L)=12.7D663-2.69D645…………(5)

Cb(mg/L)=22.9D645-4.68D663…………(6)

葉綠素總量C(mg/L)=CaCb=20.2D6458.02D663……(7)

葉綠素總量也可根據下式求導

D652=34.5×C……………(8)

652nm為葉綠素a與b在紅光區吸收光譜曲線的交叉點(等吸收點)，34.5為葉綠素a、b在波長652nm處的吸收系數。

DC=D652/34.5(g/L)Cd

DC=D652×1000/34.5(mg/L)………(9)

因此，利用(5)、(6)式可分別計算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(9)式可計算葉綠素總量。

葉綠體色素的提取液中除含有葉綠素a與b外，還含有葉黃素和胡蘿卜素，因為葉黃素和胡蘿卜素的吸收光譜均在藍光區，故不會干擾葉綠素含量在紅光區的分光光度法測定。

葉綠素ab含量的測定注意事項

注意事項

1、由于植物子葉中含有水分，故先用純丙酮進行提取，以色素提取液中丙酮的最終濃度近似80%。

2、由于葉綠素A，B的吸收峰很陡，儀器波長稍有偏差，就會使結果產生很大的誤差，因此最好能用波長較正確的高級型分光光度計。

實驗原理：在葉綠素a和b的吸收光譜曲線中，紅波波長范圍內，葉綠素a的最大吸收峰在663nm，葉綠素b的最大吸收峰在645nm。

實驗步驟

1、 取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。

2、 稱取剪碎的新鮮樣品0.2g，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，繼續研磨至組織變白。靜置3～5min。

3、取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

4、 用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。

5、把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內。以95％乙醇為空白，在波長665nm、649nm下測定吸光度。