非編碼RNA

生物細胞非編碼RNA的調控

Abstract:Epigeneticsisthestudyofmeioticallyandmitotically

heritablechangesingeneexpressionthatarenotcodedforinthe

mepigeneticsisderivedfromepi-

(meaningupon)eticregulationofmammaliangene

expressionhasprofoundeffectsincontrollingcellgrowth,

ortantepigenetic

mechanismsincludeDNAcytosinemethylation,histonemodificationsand

-codingRNAsare

n

classofregulatorynon-codingRNAsincludesiRNA,miRNA,piRNAand

sgrowingevidencethatregulatorynon-

codingRNAsplayesntialrolesintheregulationofgeneexpression

,

wereviewcurrentrearcheffortsa中國建筑風格 imedatunderstandingnon-codingRNA

sandtheirmechanismsoffunctioninmammaliancells.

Keywords:epigenetics;non-codingRNAs;DNAmethylation;histone

modifications;mammaliancells

目前表觀遺傳學(Epigenetics)通常被定義為基因表達通過有絲分裂或減

數分裂發生了可遺傳的改變,而DNA序列不發生改變。

表觀遺傳學的機制主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA。

DNA甲基化(DNAmethylation)是指在DNA甲基轉移酶(DNA-

methyltransferas,DNMTs)的催化下,CpG二核苷酸中的胞嘧啶被選擇性地添

加甲基,形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基轉移酶有兩種,其中DNMT1主要起維

持甲基化的作用,能使半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶

甲基化,可參與DNA復制雙鏈中新合成鏈的甲基化;而DNMT3a和DNMT3b主要

起形成甲基化的作用,能在未發生甲基化的DNA雙鏈上進行甲基化。DNA甲基

化一般與基因的沉默相關,DNA去甲基化則與基因的活化相關。組蛋白修飾

(Histonemodifications)是指組蛋白的基礎氨基末端尾部突出于核小體,常在

轉錄后發生變化,包括甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等翻譯后的修飾,這些

修飾構成了豐富的“組蛋白密碼”(Histonecode),能影響染色質的壓縮松緊

程度,因此在基因表達中起重要的調節作用。其中甲基化是組蛋白重要的修飾方

式,多發生于組蛋白H3、H4的賴氨酸(K)和精氨酸(A)殘基上,組蛋白賴

氨酸甲基化既可以導致激活,也可以導致抑制,通常取決于它所位于的殘基情

況。如H3K9、H3K27和H4K20甲基化一般與異染色質形成有關,是學者們熟

知的重要的“失活”標記物(Hallmark),而“活性”標記物則包括H3K4

及H3K36的甲基化。乙?；彩墙M蛋白重要的修飾方式,多發生于N-末端保守

的賴氨酸殘基上,如組蛋白H3上的9號和14號賴氨酸殘基,H4上的5

號、8號、12號和16號賴氨酸殘基,組蛋白H3和H4上賴氨酸的乙酰化與

活化或開放的染色質有關。與此相反,賴氨酸殘基經脫乙酰作用導致染色質壓縮

和基因的失活。不同的組蛋白修飾之間可以相互影響,并與DNA甲基化相互作

用。非編碼RNA(Non-codingRNAs)是指不能翻譯為蛋白的功能性RNA分子,

分為看家非編碼RNA(Houkeepingnon-codingRNA)和調控非編碼

RNA(Regulatorynon-codingRNA),其中具有調控作用的非編碼RNA按其大小主

要分為兩類:短鏈非編碼RNA(包括siRNA、m漲薪申請 iRNA、piRNA)和長鏈非編碼

RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)(表1)。盡管近年來大量研究表明非編碼

RNA在表觀遺傳學修飾中扮演了重要的角色,能在基因組水平及染色體水平對基

因獅子和處女 表達進行調控,決定細胞分化的命運,但相對于其他生物(酵母、果蠅、

線蟲及植物等),哺乳動物細胞中表觀遺傳學的研究相對滯后。

1siRNA

siRNA來源于長的雙鏈RNA

分子(包括RNA病毒復制子、

轉座子或轉基因靶點等),

經Dicer酶剪切為21~25nt

的雙鏈RNA片段,裝載

至AGO蛋白而發揮作用，近

年研究表明,siRNA能在哺乳

動物細胞中介導DNA甲基化

和組蛋白修飾,從而導致轉錄基

因沉默(Transcriptionalgenesilencing,TGS)。Kawasak等首先合成

了靶向CpG島E-cadherin基因啟動子的siRNA,通過亞硫酸氫鹽修飾結合測

序法(Bisulphitequencing)證實,同源siRNA轉染的細胞(人乳腺癌細胞

MCF-7和人正常乳腺細胞),其靶標DNA發生了特異性的甲基化及組蛋白H3K9

的甲基化,而且該沉默依DNMT1/DNMT3b,提示基因沉默發生于轉錄水平,是由

DNA甲基化引起的。Morris研究結果表明靶向延長因子1(Elongation

factor1alpha,EF1A)啟動子的siRNA能夠導致TGS,其機制與靶標的DNA甲

基化密切相關,進一步證實了哺乳動物細胞內siRNA介導的TGS的保守性。

表1表觀遺傳學中起主要調控作用的非編碼RNA

種類長度(nt)來源主要功能

siRNA~21~25長雙鏈RNA轉錄基因沉默

miRNA~21~25含發卡結構的pri-miRNA轉錄基因沉默

piRNA~24~31長單鏈前體或起始轉錄產物等多途徑生殖細胞內轉座子的沉默

lncRNA>200多種途徑基因組印記和X染色體失活

但有實驗報道:TGS過程并未發生DNA甲基化,提示DNA甲基化并非參與所

有小RNA介導的TGS,或者是DNA甲基化在暴露于小RNA的過程中發生了變化。

最近Morris實驗室的研究結果表明:以siRNA持續作用于人泛素C(Uboquitin

C,UbC)基因啟動子至少3d,可導致長期的基因沉默,靶標首先發生組蛋白甲基化,

隨后是DNA的甲基化,即靶標DNA甲基化的檢出明顯遲于組蛋白修飾,這在一定程

度上可以解釋并非所有的siRNA介導的TGS中都能檢測到DNA的甲基化。同時提

示,相對于組蛋白修飾而言,啟動子的DNA甲基化是一個更容易遺傳、更長久的

沉默,即DNA甲基化主要在維持長期的基因沉默方面起作用。為探討哺乳動物細

胞內siRNA介導的TGS機制,Morris等進一步研究了靶標啟動子的組蛋白甲基

化、轉錄的依賴性以及siRNA的雙鏈是否均參與了TGS,實驗結果表明siRNA能

引起靶標啟動子EF1A區域H3K9和H3K27的甲基化,而且靶向啟動子的siRNA中,

只有其21bp的反義RNA鏈——引導鏈(Guidestrain)對于TGS是必需的,且

其主動轉錄需要RNA多聚酶II(RNApolymeraII,RNAPII)的參與。

目前研究表明:Argonautes蛋白家族(AGO1及AGO2),DNMT3a,組蛋白去

乙酰化酶(Histone

deacetyla-1,HDAC-1)和/或Polycomb蛋白家族(Polycombgroup,PcG)

的EZH2(Enhancerofzestehomolog2)參與了siRNA誘導的TGS[30,37~39]。

哺乳動物細胞內有4種AGO,其中主要是AGO1及AGO2參與TGS,AGO1雖然與

AGO2的同源性為80%,但它缺乏一個關鍵的催化酶,不能有效地

裂解RNA,因此對于AGO1及AGO2的選擇可能依賴于小RNA與靶標之間的互

補性[38]。通常完全互補的dsRNA前體誘導的染色質重塑是由AGO2引發,而發卡

狀的dsRNA前體誘導的染色質重塑是由AGO1引發[40]。有意義的是,AGO在TGS

中的作用早于靶標啟動子的組蛋白甲基化,當靶標沉默態組蛋白修飾(H3K9甲基

化)增加時,AGO-1明顯減少,證明AGO1及RNAPII對H3K9的雙甲基化是必需的

[37]。

圖2siRNA、miRNA及piRNA的生物合成[26,27,58]

a:(人類)siRNA來源于長的雙鏈RNA分子,經Dicer酶剪切為21~25nt

的雙鏈RNA片段,Dicer酶和dsRNA結合蛋白將siRNA二聚體裝載至Argonaute

蛋白(AGO2)而發揮作用;b:(人類)miRNA由內源性的生物體基因產生含有發卡結

構的65~70nt長的pri-miRNA,該發卡結構在細胞核內經Drosha-DGCR8復合物

加工產生pre-miRNA。在細胞漿內,pre-miRNA進一步經Dicer酶剪切為miRNA-

miRNA*二聚體(其中miRNA為引導鏈,miRNA*為信息鏈),裝載至Argonaute蛋

白1(AGO1)而發揮作用。C:(鼠類)piRNA的生物合成尚不清楚。piRNA來源于

單鏈RNA前體,而且不依賴于Dicer酶。產生的初級正義piRNA傾向于與MILI

結合,在出生前的睪丸、MILI和MIWI2均參與復制周期,在次級反義piRNA中

MIWI2比MILI更為豐富,次級反義p墨鏡牌子 iRNA可能直接裂解轉座子mRNA。

EZH2作為組蛋白甲基轉移酶,在一定程度上能夠引起H3K27的甲基化,而

甲基化的H3K27作為

錨點可募集多余的PcG,從而參與沉默態染色質的形成,導致TGS[39]。染色

體免疫沉淀結果表明:

DNMTs與EZH2抑制的基因之間的結合依賴于EZH2的存在;亞硫酸氫鹽修飾

結合直接測序結果

也證明EZH2對于其靶向的啟動子甲基化是必需的,提示EZH2作為募集DNA

甲基轉移酶的平臺,參與了DNA的甲基化。研究報道,在某些基因的靶春節的傳統故事 標啟動子

內DNMT3a能與小RNA發生免疫共沉淀,表明DNMT3a也參與了靶標啟動子的

TGS[36]。

總之,TGS的建立與維持需要多種不同的蛋白:通常AGO1、DNMT3a及HDAC-1

對于起始的沉默是必需的,而DNMT1對于維持沉默是必需的[34]。

已知RNAPII參與了小RNA介導的TGS,研究報道RNAPII與AGO1免疫共沉

淀于啟動子區域,但

尚不清楚RNAPII是如何發揮作用的。目前研究主要集中為兩種模型。第一

種為RNA-RNA模型(圖

3A):其主要特征是RNA引導鏈與家常燉羊蝎子 RNAPII合成的低拷貝轉錄子結合,從而導

致沉默。近來更多的研究支持這一模型,其中一個關鍵的實驗是應用對siRNA敏

感的INK4/ARF位點的調節域(Regulatorydomain,RD)作為實驗平臺,研究siRNA

介導的RD染色質重塑,結果顯示其重疊轉錄是靶向轉錄鏈而非模板鏈,而且完全

互補的雙鏈RNA前體及不完全互補的雙鏈RNA前體均可介導異染色質的形成

[41]。另有研究結果表明經RNAPII合成的低拷貝轉錄子,可被siRNA的引導鏈識

別,并作為識別域引導沉默復合物至啟動子區域導致TGS[29]。以互補的硫代磷酸

酯寡核苷酸(Phosphorothioateoligonucleotides,PS-ODNs)封閉這些低拷貝轉

錄子,可終止siRNA靶向的啟動子沉默。第二種為RNA-DNA模型(圖3B):其主要

特征是在轉錄過程中,RNA引導鏈與靶標的一條DNA形成二聚體,從而導致沉

默。支持該模型的直接證據包括:RNAPII能與TATAA轉錄起始點上游松解的核小

體結合,從而參與TGS[42],以及DNMT3b直接參與了siRNA介導的TGS[30]。事

實上,這兩種模型并非相互排斥,可能是siRNA參與了不同的功能過程,當siRNA

直接靶向TATAA或RNPII結合位點時,以RNA-DNA方式介導TGS,而大多數情況下

siRNA是以RNA-RNA方式發揮作用。