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測定豬不同組織基因表達時RT-PCR內參基因的選擇

更新時間:2023-12-07 15:55:55 閱讀：評論：0

2023年12月7日發(作者：高一三角函數公式)

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齊波;朱榮生;王懷中;孫守禮;王建才;劉俊珍;黃保華;呼紅梅

【摘要】Taking different organizations of 95 kg weight fatten pigs,the

expressions of 11 houkeeping genes

(SDHA),(HMBS),(TOP2B),(ACTB),(B2M),(PPIA),(GAPDH),(HPRT1),(RPL4),(TBP)

and (YWHAZ) were detected using real-time quantitative the

stability of internal genes was evaluated by geNorm s of

geNorm program analysis showed that TBP and RPL4 were stable

expression internal genes in muscle tissue, GAPDH and RPL4 were stable

expression internal genes in heart tissue, TBP and HPRT1 were stable

expression internal genes in liver tissue, SDHA and ACTB were stable

expression internal genes in spleen tissue, B2M and HPRT1 were stable

expression internal genes in lung it can be en that the most

stable expression internal genes in different tissues of pig are different,and

the internal genes to standardize target genes in different tissues are also

different.%以95 kg體重育肥豬的不同組織為研究對象,應用實時熒光定量PCR技術,對SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ共11個候選內參基因表達量進行檢測,應用geNorm 程序對內參基因的穩定性進行分析.結果表明,肌肉組織中穩定表達的內參基因是TBP、RPL4,心臟組織中穩定表達的內參基因是GAPDH、RPL4,肝臟組織中穩定表達的內參基因是TBP、HPRT1,脾臟組織中穩定表達的內參基因是SDHA、ACTB,肺臟組織中穩定表達的內參基因是B2M、HPRT1,腎臟組織中穩定表達的內參基因是B2M、TBP.由此可見,不同組織中最穩定表達的內參基因不同,不同組織中標準化目的基因的內參基因也不一樣.

【期刊名稱】《家畜生態學報》

【年(卷),期】2017(038)006

【總頁數】5頁(P8-12)

【關鍵詞】豬;實時熒光定量PCR;內參基因選擇;geNorm程序;基因表達

【作者】齊波;朱榮生;王懷中;孫守禮;王建才;劉俊珍;黃保華;呼紅梅

【作者單位】青島農業大學動物科技學院,山東青島 266109;山東省農業科學院

畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東

濟南 250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南

250100;山東省農業科學院畜牧獸醫研究所,山東濟南 250100;山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室,山東濟南 250100

【正文語種】中文

【中圖分類】S811.5 實時熒光定量 PCR 技術(RT-PCR)是測定mRNA 表達水平的一種基準方法，與常規PCR相比，RT-PCR具有定量準確、靈敏度高、重復性好、特異性強以及能實現高通量操作等特點，因此在基因表達的定量研究中獲得廣泛應用[1-2]。然而，越來越多的報道表明RT-PCR數據的準確性和重現性緊密依賴于合適的標準化方法[3]。在基因表達分析中選擇一種合適的內參基因對目的基因的表達量進行校正可以提高該方法的靈敏度和重復性[4]。理想的內參基因應在所研究的各種試驗因素條件下均恒定表達，但是受到RNA提取中的RNA的質量和純度、逆轉率效率、PCR效率和試驗條件等因素的影響[5-6]，任何一種內參基因在所有的試驗條件下都不是恒定表達的，在不同類型組織的細胞、在組織細胞生長的不同階段，內參基因的表達都存在著較大的差異[7]。為了避免不同樣本之間內參基因的表達差異，并保證RT-PCR數據分析的準確性，研究者提出多種方法[8]，從候選內參基因中選擇出最穩定表達的標準化RT-PCR數據的內參基因的最好方法是由Vandesompele等編寫出的geNorm 程序，該方法改變了傳統的采用單一內參基因對目的基因進行標準化的方法，可以通過geNorm 程序，篩選出2個以上的候選內參基因作為內參基因，以便更能準確定量PCR反應中目的基因的表達[12]。本試驗針對育肥豬不同類型的組織，篩選出適合各組織的穩定表達的內參基因，并對目的基因進行校正和標準化，以期獲得比較真實可信的結果。

選擇22頭92～95 kg體重長白豬×太湖豬二元豬進行屠宰，屠宰按照NY/T 825-2004進行。宰后45 min內取肌肉(最后肋骨處)、心、肝、脾、肺、腎，迅速置液氮中保存，用以提取總RNA。

利用RNAiso Plus(TaKaRa, Dalian, China)試劑進行肌肉和內臟組織總RNA的提取。提取的總RNA，經0.8%變性瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，America)檢測RNA的質量和濃度。取1 μg左右的RNA，先利用The PrimeScript RT reagent kit with gDNA Erar(Takara，Dalian，China)試劑盒中的gDNA Erar降解RNA中殘留的DNA，以避免RNA中殘留的DNA對目的基因表達定量結果的影響，然后再利用該試劑盒中的PrimeScript RT Enzyme Mix 1逆轉錄RNA為cDNA。定量PCR反應前，用雙蒸水對cDNA溶液進行4倍稀釋。

根據相關文獻報道，選擇11個不同功能的常用內參基因，包括SDHA、HMBS、TOP2B、ACTB、B2M、PPIA、GAPDH、HPRT1、RPL4、TBP和YWHAZ，作為候選內參基因進行表達穩定性分析。候選內參基因的具體信息詳見表1所示，HPRT1、HMBS和YWHAZ的引物由TaKaRa公司設計，剩余基因的引物參考相關文獻。

熒光定量試劑盒為LightCycler○R 480 SYBR Green I Master(Roche公司)，熒光定量儀器為Roche公司的Roche LightCycler○R 480。反應體系為20 μL，包括：Blue-SYBR-Green mix 10 μL，上、下游引物(10 pM/μL)各1 μL，cDNA 1 μL，雙蒸水7 μL。反應程序為：①預變性：95 ℃ 5 min；②擴增反應：95 ℃預變性10 s，60 ℃退火和延伸20 s，45個循環；③溶解曲線形成：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1

min，97 ℃ 10 s。反應后根據溶解曲線分析PCR產物的特異性，分別導出目的基因和內參基因的CT值。

1.4 數據分析

內參基因的分析：在Excel中設定不同樣本中某一參考基因Ct值最小者為1，其他樣本中參考基因的相對表達量則為2-ΔCt(ΔCt=樣本Ct值-最小Ct值)，將這些數據導入geNorm V3.5，對各候選內參基因進行穩定性評價[12]。

2 結果與分析

2.1 組織表達穩定度

經 geNorm 軟件評價分析，肌肉組織中 11 個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為：SDHA(0.698)>ACTB(0.523)>YWHAZ(0.495)>PPIA(0.437)>HMBS(0.391)>TOP2B(0.389)>HPRT1(0.375)>B2M(0.370)>GAPDH(0.358)>TBP(0.322)>RPL4(0.321)(圖1)。去掉穩定性最差的一個內參基因，重新計算剩余內參基因的 M 值的平均值，依次類推可得到最穩定的2 個內參基因的 M 均值為 0.11658，即 TBP

和 RPL4兩個內參基因聯合使用可以達到最高的表達穩定性；心臟組織中 11 個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為：HPRT1(0.907)>SDHA(0.860)>YWHAZ(0.792)>TOP2B(0.766)>TBP(0.730)>ACTB(0.692)>B2M(0.654)>PPIA(0.561)>GAPDH(0.546)>HMBS(0.532)>RPL4(0.511)，篩選出的兩個聯合使用的內參基因是GAPDH和RPL4；肝臟組織中 11

個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為：YWHAZ(2.694)>SDHA(1.512)>TOP2B(1.349)>PPIA(1.222)>HPRT1(1.193)>RPL4(1.152)>GAPDH(1.079)>TBP(1.072)>ACTB(1.036)>B2M(0.998)>HMBS(0.985)，篩選出的兩個聯合使用的內參基因是TBP和HPRT1；脾臟組織中 11 個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為:

TBP(2.618)>GAPDH(2.132)>B2M(0.903)>HPRT1(0.880)>SDHA(0.865)>ACTB(0.840)>PPIA(0.826)>TOP2B(0.819)>HMBS(0.762)>YWHAZ(0.754)>RPL4(0.732),篩選出的兩個聯合使用的內參基因是SDHA和ACTB；肺臟組織中 11 個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為：RPL4(2.378)>SDHA(1.726)>

GAPDH(1.531)>TOP2B(1.272)>PPIA(1.098)>HMBS(1.078)>TBP(1.078)>YWHAZ(1.059)>ACTB(1.008)>HPRT1(0.961)>B2M(0.936),篩選出的兩個聯合使用的內參基因是B2M和HPRT1；腎臟組織中 11 個內參基因穩定性平均值 M 從大到小依次為：TOP2B(1.174)>SDHA(0.970)>YWHAZ(0.924)>ACTB(0.872)>PPIA(0.860)>HPRT1(0.749)>RPL4(0.683)>TBP(0.668)>GAPDH(0.633)>HMBS(0.594)>B2M(0.588)，篩選出的兩個聯合使用的內參基因是B2M和TBP。

圖1 不同組織候選內參基因的平均表達穩定度A.肌肉組織；B.心臟組織；C.肝臟組織；D.脾臟組織；E.肺臟組織；F.腎臟組織Fig.1 The average expression

degree of stability of the candidate internal genes in different tissuesA.

muscle tissue; B. heart tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue;

F. kidney tissue

2.2 內參基因之間的相對表達量

GeNorm 軟件以 0.15 為默認取舍值，即當 Vn/n+1< 0.15 時，說明沒必要使用數量≥n+1的看家基因作為內參，由圖2可以得出V2/3都小于0.15，內參基因的最適數目為2個，不需要再選擇第三個候選基因作為內參就能滿足試驗需要。

3 討論

對 mRNA 表達進行定量的技術，包括 RNA 印跡、基因芯片、實時熒光定量 PCR等，都需要選擇內參基因來對目的基因的表達結果進行校正，并要求理想的內參基因應在所研究的組織、細胞和試驗條件下均穩定表達。在眾多的實時熒光定量PCR 試驗中，研究者多采用單一內參基因對目的基因校正的方法。目前，大量篩選內參基因的研究都是針對某些物種的特定組織[13-14]。但是任何一種看家基因的恒定表達都只是在一定條件下特殊的恒定，在不同類型的細胞、組織，在器官發育的不同階段以及不同試驗條件下，內參基因的表達量通常會存在較大變異。選擇單一看家基因作為內參基因，可能檢測不出 PCR反應中基因的細微變化，甚至會導致錯誤的結論[15-17]。為了獲得有意義的試驗數據，研究者應根據各自特殊的

組織及試驗條件來選擇合適的內參基因。

圖2 不同組織內候選內參基因的配對差異值VA.肌肉組織；B.心臟組織；C.肝臟組織；D.脾臟組織；E.肺臟組織；F.腎臟組織Fig.2 The paired difference value V

of the candidate internal genes in different tissuesA. muscle tissue; B. heart

tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue; F. kidney tissue

本研究檢測了豬的不同組織中內參基因的穩定性和表達水平。分別通過實時熒光定量PCR對11個不同功能的看家基因的mRNA表達進行檢測，通過geNorm 程序計算其表達穩定度 M 值。GeNorm程序通過基因配對的形式，去除最不穩定的基因，然后將剩下基因重新排序重新配對進行篩選最終選出合適數目的內參基因[18]。在同一試驗條件下，當有多個內參基因可以選擇時，軟件會分析其最佳配對變異值 Vn/n+1，從而為我們選擇最適的內參基因數目提供參考依據。程序默認的基因配對比值為 0.15，當有n個內參基因時，比值 Vn/n+1<0.15，說明 n個內參基因已經能夠準確校正目標基因的表達量，此時無需引入第(n+1)個內參基因。從GeNorm 軟件分析結果(圖2)可以得出，V2/3(肌肉組織) = 0.047，V2/3(心臟組織)= 0.056，V2/3(肝臟組織)=0.131，V2/3(脾臟組織)=0.115，V2/3(肺臟組織)=0.139，V2/3(腎臟組織)=0.084，均小于0.15，說明在豬不同組織樣品中，都沒有必要引入第3個內參基因來消除差異。并且根據 M 值以及其最適的基因配對數，肌肉組織中最佳的內參基因組合為 TBP 和 RPL4，心臟組織中最佳的內參基因組合為GAPDH和RPL4，肝臟組織中最佳的內參基因組合為TBP和HPRT1，脾臟組織中最佳的內參基因組合為SDHA和ACTB，肺臟組織中最佳的內參基因組合為B2M和HPRT1，腎臟組織中最佳的內參基因組合為B2M和TBP。

本試驗結果表明，育肥豬中不同組織中最穩定表達的內參基因有所不同。本研究推薦研究者做相關試驗時可以根據各自試驗的特點，選擇最穩定表達的內參基因的幾何平均數作為標準化相關RT-PCR數據的指標[19]。

參考文獻： [1] Valak M A, Repa J J. The power of real-time PCR[J]. Advances in

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for Quantitative Real-Time PCR Experiments[M]. Springer New York, 2014,

1160(1160):5-17.

Selection of Reference Genes of Real-time Quantitative PCR in the Gene

Expression of Different Tissues in Pig

QI Bo1，ZHU Rong-sheng2,3，WANG Huai-zhong2,3，SUN Shou-li2,3，WANG Jian-cai2,3，LIU Jun-zhen2,3，HUANG Bao-hua2,3*，HU Hong-mei2,3*

(1. College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural

University，Qingdao Shandong 266109，China;2. Institute of Animal

Husbandry and Veterinary，Shandong Academy of Agricultural University，Jinan Shandong 250100，China;3. Shandong Provincial Key Laboratory of

Animal Dia Control and Breeding， Jinan Shandong 250100，China)

Abstract：Taking different organizations of 95 kg weight fatten pigs，the

expressions of 11 houkeeping genes (SDHA)，(HMBS)，(TOP2B)，(ACTB)，(B2M)，(PPIA)，(GAPDH)，(HPRT1)，(RPL4)，(TBP) and (YWHAZ)

were detected using real-time quantitative PCR. And the stability of

internal genes was evaluated by geNorm program. Results of geNorm

program analysis showed that TBP and RPL4 were stable expression

internal genes in muscle tissue, GAPDH and RPL4 were stable expression internal genes in heart tissue, TBP and HPRT1 were stable expression

internal genes in liver tissue, SDHA and ACTB were stable expression

internal genes in spleen tissue, B2M and HPRT1 were stable expression

internal genes in lung tissue. Thus it can be en that the most stable

expression internal genes in different tissues of pig are different，and the

internal genes to standardize target genes in different tissues are also

different.

Key words：pig; real-time quantitative PCR; lection of the reference

genes; GeNorm program; gene expression

* [收稿日期] 2016-12-08

修回日期：2017-03-02

[基金項目] 國家自然科學基金(31501928)；山東省科技發展計劃(2015GNC111011)；山東省農業科學院青年基金(2014QNM41)；山東省自然基金(ZR2015CM007)；山東省農業科學院科技創新重點項目(2014CX202)

[作者簡介] 齊波(1990-)，男，山東平邑人，碩士研究生，主要研究方向：動物營養。E-mail:******************* [通訊作者] 黃保華(1964-)，男，山東昌邑人，研究員，主要研究方向：動物營養。E-mail:**************；呼紅梅(1976-)，女，山東冠縣人，副研究員，碩士，主要研究方向：動物營養。E-mail:**********************[中圖分類號] S811.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-5228(2017)06-0008-05

2.2 內參基因之間的相對表達量

3 討論

組織及試驗條件來選擇合適的內參基因。

圖2 不同組織內候選內參基因的配對差異值VA.肌肉組織；B.心臟組織；C.肝臟組織；D.脾臟組織；E.肺臟組織；F.腎臟組織Fig.2 The paired difference value V

of the candidate internal genes in different tissuesA. muscle tissue; B. heart tissue; C. liver tissue; D. spleen tissue; E. lung tissue; F. kidney tissue

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