基因測序（DNA測序）

基因測序（DNA測序）

基因測序 （DNA測序） 次瀏覽 | 2022.07.24 09:16:02 更新 來源 ：互聯(lián)網(wǎng) 精選百科 本文由作者推薦 基因測序DNA測序

基因測序，或稱DNA測序，是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式。基因測序技術(shù)能鎖定個人病變基因，提前預(yù)防和治療。只需一滴血或一點唾液，就能預(yù)測罹患多種疾病，如癌癥或白血病。但有專家擔(dān)心，一旦全基因檢測普及，含有基因缺陷的人的信息，一旦落入保險公司或者被測者雇主的手中，將對他的生活產(chǎn)生不良影響。

中文名

基因測序

所屬學(xué)科

醫(yī)學(xué)

概述基因測序

基因測序是對目標DNA進行堿基的序列測定，并進行各種相關(guān)分析。是現(xiàn)代生物學(xué)的重要手段之一，同時也是生物學(xué)迅猛發(fā)展的重要動力。它推動了生物學(xué)的發(fā)展，它促使生物學(xué)從DNA水平上進行各種研究。

基因（Gene,Mendelian?factor）是指攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，也稱為遺傳因子，是控制性狀的基本遺傳單位。基因通過指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表現(xiàn)。基因有控制遺傳性狀和活性調(diào)節(jié)的功能。基因通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制酶的合成來控制代謝過程，從而控制生物的個體性狀表現(xiàn)。基因還可以通過控制結(jié)構(gòu)蛋白的成分，直接控制生物性狀。因此對生物從分子生物學(xué)水平上進行研究，在醫(yī)學(xué)上對某種遺傳疾病的研究等都離不開對DNA或RNA的序列進行測定。基因測序也成為生物學(xué)研究的重要手段。

在基礎(chǔ)生物學(xué)研究中，和在眾多的應(yīng)用領(lǐng)域，如診斷，生物技術(shù)，法醫(yī)生物學(xué)，生物系統(tǒng)學(xué)中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。具有現(xiàn)代的DNA測序技術(shù)的快速測序速度已經(jīng)有助于達到測序完整的DNA序列，或多種類型的基因組測序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。RNA測序則通常將RNA提取后，反轉(zhuǎn)錄為DNA后使用DNA測序的方法進行測序。應(yīng)用最廣泛的是由弗雷德里克·桑格發(fā)明的Sanger雙脫氧鏈終止法（Chain?Termination?Method）。新的測序方法，例如454生物科學(xué)的方法和焦磷酸測序法。

原理基因測序

基因就是DNA大分子的一個片斷。核酸分為DNA（脫氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）兩類，它們共同執(zhí)掌著細胞的新陳代謝，核酸作為生命的根源是遺傳因子的本體，能完全控制細胞的分裂、成長與能量的產(chǎn)生。

現(xiàn)代遺傳學(xué)家認為，基因是DNA(脫氧核糖核酸)分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。基因位于染色體上，并在染色體上呈線性排列。基因不僅可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代，還可以使遺傳信息得到表達。不同人種之間頭發(fā)、膚色、眼睛、鼻子等不同，是基因差異所致。

由于DNA上的每一個堿基出現(xiàn)在可變終止端的機會均等，因此上述每一組產(chǎn)物都是一些寡核苷酸混合物，這些寡核苷酸的長度由某一種特定堿基在原DNA全片段上的位置所決定。

在可以區(qū)分長度僅差一個核苷酸的不同DNA分子的條件下，對各組寡核苷酸進行電泳分析，只要把幾組寡核苷酸加樣于測序凝膠中若干個相鄰的泳道上，即可從凝膠的放射自影片上直接讀出DNA上的核苷酸順序。

測序方法Sanger測序法基因測序

Sanger（桑格）雙脫氧鏈終止法是Frederick?Sanger于1975年發(fā)明的。測序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應(yīng)（PCR）。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續(xù)增加長度。最終的結(jié)果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。

目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒光標記。將PCR反應(yīng)獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發(fā)出熒光。由于ddATP,?ddGTP,?ddCTP,?ddTTP（4種雙脫氧核糖核苷酸）熒光標記不同，計算機可以自動根據(jù)顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。

Maxam－Gilbert DNA化學(xué)降解法

在這一方法（Maxam和Gilbert，1980）中，一個末端標記的DNA片段在5組互相獨立的的化學(xué)反應(yīng)分別得到部分降解，其中每一組反應(yīng)特異地針對某一種或某一類堿基。因此生成5組放射性標記的分子，從共同起點（放射性標記末端）延續(xù)到發(fā)生化學(xué)降解的位點。每組混合物中均含有長短不一的DNA分子，其長度取決于該組反應(yīng)所針對的堿基在原DNA全片段上的位置。

此后，各組均通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再通過放射自顯影來檢測末端標記的分子。這一方法的成敗，完全取決于上述這些佞兩步進行的降解反應(yīng)的特異性。

第一步先對特定堿基（或特定類型的堿基）進行化學(xué)修飾，而第二步修飾堿基從糖環(huán)上脫落，修飾堿基5'和3'的磷酸二酯鏈斷裂在每種情況下，這些反應(yīng)都要在精心控制的條件下進行，以確保每一個DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的5'和3'位置，得到一組長度從一到數(shù)百個核苷酸不等的末端標記分子。比較G、A＋G、C＋T、C和A>C各個泳道，右從測序凝膠的放射自顯影片上讀出DNA序列。Maxam-Gilber法所能測定的長充要比Sanger法短一些，它對放射性標記末端250個核苷酸以內(nèi)的DNA序列效果最佳。

化學(xué)降解較之鏈終止法具有一個明顯的優(yōu)點：所測序列來自原DNA分子而不是酶促合成所產(chǎn)生的拷貝。因此，利用Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析諸如甲基化等DNA修飾的情況，不可以通過化學(xué)保護及修飾干擾實驗來研究DNA二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)與DNA的相互作用。

霰彈槍定序法

霰彈槍定序法（Shotgun?quencing，又稱鳥槍法）是一種廣泛使用的為長DNA測序的方法，比傳統(tǒng)的定序法快速，但精確度較差。曾經(jīng)使用于塞雷拉基因組（Celera?Genomics）公司所主持的人類基因組計劃。

下一代測序技術(shù)基因測序

高通量測序技術(shù)（High-throughput?quencing）又稱“下一代”測序技術(shù)（"Next-generation"?quencing?technology），以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。

MPSS

由Lynx?Therapeutics公司在90年代發(fā)展的Massively?Parallel?Signature?Sequencing,?MPSS技術(shù)是“下一代”測序技術(shù)發(fā)展的先驅(qū)。MPSS?是一種基于磁珠（bead）和接頭（adaptor）連接和解碼的復(fù)雜技術(shù)，測定結(jié)果短，多用于轉(zhuǎn)錄組測序，測定基因表達量。MPSS測定結(jié)果有序列偏好性而易丟失DNA中某些特定序列，且操作復(fù)雜，已逐漸淡出，被新的方法替代。Lynx?Therapeutics公司于2004年和Solexa合并，隨后被Illumina收購。

Polony Sequencing

2005年哈佛George?Church實驗室發(fā)展起來的，基于乳化PCR(emulsion?PCR)和自動顯微鏡等技術(shù)的測序方法。相關(guān)技術(shù)已整合進ABI公司的SOLiD測序技術(shù)平臺。

454 焦磷酸測序

由454公司發(fā)展的并行焦磷酸測序方法。該方法在油溶液包裹的水滴中擴增DNA（即emulsion?PCR）,每一個水滴中開始時僅包含一個包被大量引物的磁珠和一個鏈接到微珠上的DNA模板分子（控制DNA濃度出現(xiàn)的大概率事件）。

將emlusion?PCR產(chǎn)物加載到特制的PTP板上，板上有上百萬個孔，每個微孔只能容納一個磁珠。DNA?Polymera在將一個dNTP聚合到模板上的時候，釋放出一個PPi（焦磷酸分子）；在ATP-Sulfuryla（ATP硫酸化酶）催化下，PPi與APS生成一個ATP分子；ATP分子在Lucifera（熒光素酶）的作用下，將luciferin（熒光素）氧化成oxy?luciferin，同時產(chǎn)生的可見光被CCD光學(xué)系統(tǒng)捕獲，獲得一個特異的檢測信號，信號強度與相應(yīng)的堿基數(shù)目成正比。

通過按順序分別并循環(huán)添加四種dNTP，讀取信號強度和發(fā)生時間，實現(xiàn)DNA序列測定。這一技術(shù)的讀長和每一堿基耗費都介于Sanger法測序和Solexa和SOLiD方法之間。454公司現(xiàn)下屬于Roche公司。

Illumina (Solexa) quencing

Solexa公司開發(fā)了一種可反轉(zhuǎn)的染料終止法。DNA模板首先連接到與固體介質(zhì)（如玻璃板）交聯(lián)的引物上，并擴增形成本地微克隆。四種ddNTPs依次添加到體系中，未結(jié)合的ddNTPs在添加下一種核苷酸前被沖洗走。與454的焦磷酸測序不同，這種方法一次只延伸一個堿基。

應(yīng)用測序應(yīng)用（genequence）基因測序服務(wù)

對目標DNA進行堿基的序列測定，并在此基礎(chǔ)上，進行各種相關(guān)分析。

基因治療

把正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達到治療疾病的目的，這是治療遺傳病的最有效的手段。基該方法是：基因置換、基因修復(fù)、基因增補和基因失活等。[1]

片段分析應(yīng)用(genescan）

?在測序儀上走一個熒光標記的高精度電泳，通過條帶和分子量標準比較，判定分子量，并進行相關(guān)分析。醫(yī)學(xué)測序（基因突變、缺失等與疾病的關(guān)系等），細菌、真菌鑒定（16SrRNA、D2rDNA測序），雜合子、突變檢測（SNP檢測、微生物基因變異等），基因進化分析（微生物溯源研究等）。

疾病診斷

1996年，一對雙胞胎出生了，男孩叫諾亞，女孩叫艾麗西斯。然而，他們的行為舉止與別的孩子有所不同。從回到家的那天起，這對雙胞胎就開始腹痛，并且一天要嘔吐好幾次。在孩子們兩歲的時候，他們被確診為腦癱。在精心的治療和護理之下，這對雙胞胎的病情似乎得到了控制。然而，5歲半的時候，雙胞胎的病情又開始惡化。女孩艾麗西斯的眼珠開始上翻，手也無法正常下垂；男孩諾亞則是一天24小時地不斷嘔吐。他們甚至無法像正常人一樣走路、說話。此后，雙胞胎的病情又幾次反復(fù)，一直沒有找到能治愈他們的方法。

2003年，機緣巧合，這對雙胞胎和他們的哥哥以及父母進行了一次基因測序。經(jīng)過對比分析，最終發(fā)現(xiàn)雙胞胎致病的罪魁禍首是體內(nèi)一種還原酶發(fā)生了基因突變。它破壞了產(chǎn)生多巴胺以及其他兩種神經(jīng)遞質(zhì)的細胞途徑。找到病因后，醫(yī)生立刻做出了精確的治療方案。一個月后，這對雙胞胎被治愈。讓這對雙胞胎重獲健康的，便是來自于生命技術(shù)公司的基因測序技術(shù)。

體檢

基因測序，本是一種實驗室研究技術(shù)手段，因“名人效應(yīng)”應(yīng)用于高端體檢、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域，價格不菲。基因測序最廣為人知的，是影星安吉麗娜·朱莉通過基因檢測，選擇手術(shù)切除乳腺以降低患乳腺癌風(fēng)險。2011年去世的蘋果公司創(chuàng)始人史蒂夫·喬布斯患癌時，曾經(jīng)花費10萬美元將他的癌腫瘤和正常的DNA進行測序

NGS是一種高通量的大規(guī)模平行測序技術(shù)，可以同步獲得腫瘤患者個體特定樣本中數(shù)以十億計的DNA堿基序列信息，是發(fā)現(xiàn)已知和未知疾病相關(guān)基因變異的高效手段。雖然在單基因遺傳病、產(chǎn)前診斷方面已有廣泛應(yīng)用，但NGS用于腫瘤基因檢測尚缺乏統(tǒng)一規(guī)范和共識。我國腫瘤患者數(shù)目龐大，基因診斷和檢測需求巨大，而實際應(yīng)用中，因為準入門檻低、缺乏業(yè)界公認的指導(dǎo)規(guī)范，可能存在檢測質(zhì)量低下、結(jié)果準確性差、解讀不專業(yè)，甚至盲目追求基因檢測結(jié)果等現(xiàn)象。[2]

官方叫停基因測序爭議

2014年2月17日晚，國家食品藥品監(jiān)督管理總局相關(guān)負責(zé)人坦言，基因測序的臨床應(yīng)用多出現(xiàn)于醫(yī)療機構(gòu)和體檢中心的高端體檢，但其使用的基因測序儀及相關(guān)診斷試劑和軟件，很多沒有經(jīng)過醫(yī)療器械的注冊審批。 對于突然叫停的原因，這是通知里最接近答案的一句話：“基因測序相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)已由實驗室研究演變到臨床應(yīng)用，其中涉及到倫理、隱私和人類遺傳資源保護、生物安全以及醫(yī)療機構(gòu)開展基因診斷服務(wù)技術(shù)管理、價格、質(zhì)量監(jiān)管等問題。”

參考資料