中國北方沿海竿蝦虎魚(Luciogobius guttatus)隱存多樣性與群體歷史動

2023年12月3日發(作者：新員工入職歡迎詞)

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中國北方沿海竿蝦虎魚(Luciogobius guttatus)隱存多樣性與群體歷史動態

鄧穎達;薛東秀;劉進賢

【摘 要】竿蝦虎魚(Luciogobius guttatus)隸屬于擬蝦虎魚亞科(Gobionellinae),已知分布于中國沿海、朝鮮半島和日本的巖基礫石質潮間帶.日本學者發現竿蝦虎魚在日本沿海存在三個譜系,但在我國,針對竿蝦虎魚的研究僅限于形態測量和野外調查記錄.基于線粒體DNA和核基因序列標記,本研究從系統發育和群體遺傳兩個角度,揭示竿蝦虎魚在我國北方沿海的隱存多樣性與群體歷史.結果表明,與日本分布的竿蝦虎魚對比,我國北方沿海分布的竿蝦虎魚存在以嶗山為潛在屏障的偏南、偏北兩個譜系,分別對應于日本沿海的譜系A和譜系C,缺少譜系B.本研究推測,末次冰期對竿蝦虎魚的有效種群擴張和群體的分化及擴散起到關鍵作用,且不同譜系對冰期氣候變化的反應并不一致.本研究初步查明了中國北方沿海竿蝦虎魚的隱存多樣性現狀,為我國竿蝦虎魚的保護提供了分子依據.

【期刊名稱】《海洋與湖沼》

【年(卷),期】2016(047)004

【總頁數】8頁(P813-820)

【關鍵詞】線粒體DNA;核基因;隱存多樣性;竿蝦虎魚;群體分化

【作 者】鄧穎達;薛東秀;劉進賢

【作者單位】中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 青島266071;中國科學院大學 北京 100049;中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室 青島266071;青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室 青島 266071;中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室

青島266071;青島海洋科學與技術國家實驗室海洋生態與環境科學功能實驗室 青島 266071

【正文語種】中 文

【中圖分類】Q346

由于地理隔離造成的基因交流限制和環境變化帶來的選擇壓力, 在近緣物種或種內譜系間, 分子水平的顯著分化可能先于其形態學差異而發生。然而,這些從形態學無法或難以區分的隱存單元可能預示著新物種的形成。線粒體DNA是海洋魚類系統發育研究中常用的一種分子標記。由于其突變速率較高,且在脊椎動物中單親遺傳、極少發生同源重組, 故線粒體 DNA多態性位點豐富且連續, 對歷史環境變化響應迅速, 在近緣魚類物種間具有較高的解析度。竿蝦虎魚屬(Luciogobius)是蝦虎魚科(Gobiidae)、擬蝦虎魚亞科(Gobionellinae)中的一個特化屬, 已知分布于中、日、韓沿海(伍漢霖等, 2008)。早在1932年, 我國學者Chen Johnson(1932)首先報道了竿蝦虎魚屬在我國沿海的分布記錄, 并從形態學角度對其分類地位作出初步探討。竿蝦虎魚屬物種成體的第一背鰭完全退化消失, 無鱗, 側線系統退化, 且脊椎數目增加以致軀干延長(伍漢霖等, 2008; Yamada et al, 2009),使得本屬從形態上容易與其它屬相互區分。但在本屬內部的譜系甚至物種之間, 由于棲息地適應性的趨同進化, 從形態上難以有效進行分類。線粒體是細胞能量代謝的主要場所, 對于從寒溫帶到亞熱帶廣泛分布的竿蝦虎魚屬而言, 更新世東亞沿海氣候和地理環境的變化可能在其線粒體DNA中留下了深刻的印跡; 尤其在形態分類不一致的情況下, 線粒體DNA標記有助于揭示竿蝦虎魚屬物種的隱存多樣性,從而促進明確一致的系統分類, 并反演群體的近期歷史動態。

竿蝦虎魚(Luciogobius guttatus)是竿蝦虎魚屬的常見種之一。竿蝦虎魚一齡魚即性成熟, 懷卵量370—1542粒, 冬季產卵; 二齡魚體長 4—6cm(伍漢霖等, 2008),

是一種底內生活型(infaunal)的蝦虎魚;加之其成體常棲息于暖水潮間帶礫石之下,

捕食底棲無脊椎動物, 生殖季節時雄性個體在石下筑巢護卵, 故竿蝦虎魚亦是一種生態功能相對獨立且遷移能力較弱的潮間帶捕食者, 可能會通過下行控制效應和生物擾動效應影響其棲息地底棲生物群落的物種多樣性。日本學者Mukai等(2004)從分子層面(線粒體16S rRNA)報道了竿蝦虎魚(L. guttatus)在日本沿海的譜系組成和地理分布, 發現竿蝦虎魚種內存在三個譜系。此后, 這一結果被Yamada等(2009)用核基因外顯子和線粒體DNA標記(cytb)進一步證實。但這三個譜系在本屬的線粒體基因樹上并不總為單系群,且其中一個分布較廣并且最先形成的譜系(根據Yamada等(2009)的命名, 為A譜系)與另外兩個譜系(B和C)的遺傳距離(P-distance)在cytb上都超過了2%的 DNA條形碼種級經驗閾值(Avi et al,

1999;Hebert et al, 2003)。然而, 我國分布的竿蝦虎魚隱存多樣性的研究仍未見報道。為查明中國沿海竿蝦虎魚的譜系組成, 并深入比較譜系間歷史動態差異, 我們根據《中國動物志·硬骨魚綱·鱸形目·蝦虎魚亞目》的記載, 采集了竿蝦虎魚在我國北方沿海的群體樣本,選用兩個線粒體 DNA片段(cytb 和控制區 mcr), 和一個核基因外顯子(鈣離子通道蛋白腦亞型, 亦即：蘭尼堿受體 3, ryr3)為分子標記, 并結合已發表的日本群體的基因序列, 對我國北方沿海竿蝦虎魚的隱存多樣性與群體歷史動態進行了初步研究。研究結果將加深對我國海岸帶魚類多樣性的認識, 并為我國沿海竿蝦虎魚的保護提供分子依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于2013—2015年共在我國北方沿海10個位點采集到 125條竿蝦虎魚個體(圖 1)。所有個體均是退潮時在潮間帶手工捕捉采集, 活體帶回實驗室, 無水乙醇保存備用。其中, 2013年采樣點為： 青島市匯泉灣(HQ,4月, 12個個體)、石老人海水浴場(SLR, 8月, 8個個體)、嶗山仰口(LS, 6月, 12個個體); 2014年10月采樣點為：榮成俚島(RC, 11個個體)、大連黑石礁(DL, 21個個體);2015年4月青島采樣點：

匯泉灣(12個個體)、石老人海水浴場(12個個體)、唐島灣(td, 5個個體)、金沙灘(js, 7個個體)、棧橋(zq, 8個個體)、第三海水浴場(sy, 9個個體)、麥島(md, 8個個體)。

圖1 竿蝦虎魚譜系的已知分布格局Fig.1 Distribution of lineages of L. guttatus注： 黑色實心圓表示竿蝦虎魚譜系A主導分布; 黑邊空心圓表示譜系B主導分布;

正方形代表譜系C主導分布。 QD： 青島; HQ： 匯泉;SLR： 石老人; LS： 嶗山;

RC： 榮成; DL： 大連; td： 唐島灣; js： 金沙灘; zq： 棧橋; sy： 第三海水浴場;

md： 麥島

1.2 DNA提取

剪取鰭條組織提取總 DNA, 提取過程按照苯酚-氯仿-異戊醇法(Sambrook et al,

1989)進行。所提取的總DNA溶于TE溶液, -20°C保存。

1.3 PCR擴增

使用已發表的引物及自主設計的引物(表 1)進行目標DNA片段的PCR擴增, 具體PCR反應體系為：2×PCR-mix (東盛)12.5μL, H2O 9.5μL, 正反向引物各1μL(濃度 0.1mmol/L), 模板總 DNA 1μL, 共 25μL;PCR反應程序為： 94°C預變性10min, 94°C變性1min,退火1min (溫度見表1), 72°C延伸1min; 循環35次;然后在72°C終末延伸10min。

1.4 序列測定

采自2013—2014年的樣本至少在一個基因標記上被測序(表 2), 各片段皆為雙向測序。2015年采自匯泉灣和石老人海水浴場的樣本僅測定了控制區mcr片段序列。測序由上海英濰捷基公司完成。2015年采自唐島灣、金沙灘、棧橋、第三海水浴場以及麥島的樣本僅通過一對譜系特異性引物(fDloopThrF和LgCA, 引物LgCA根據mcr中的一處長20bp的譜系C特異性插入序列自主設計)用PCR-瓊脂糖凝膠電泳方法檢查其是否屬于譜系C。

表1 本研究使用引物及其來源、用途、退火溫度和序列Tab.1 Source,

application, annealing temperature, and quence of primers ud in this

study注： *： 與fDloopThrF一同用于唐島灣(td)、金沙灘(js)、棧橋(zq)、第三海水浴場(sy)以及麥島(md)樣本的譜系鑒定引物名稱 標記名稱 引物來源 使用環節

退火溫度 引物序列 5′—3′L14850-CYBa cytb Yamada et al, 2009 PCR/Sanger

quencing 45°C GCCTGATGAAACTTTGGCTG H15973-Prob cytb Yamada

et al, 2009 PCR/Sanger quencing 45°C TTGGGAGTTAGKGGTRRGAGTT

fDloopThrF mcr Cheng et al, 2012 PCR/Sanger quencing 57°C

AGCACCGGTCTTGTAAACCG fDloopPheR mcr Cheng et al, 2012

PCR/Sanger quencing 57°C GGGCTCATCTTAACATCTTCA RYR3F2 ryr3

Yamada et al, 2009 PCR/Sanger quencing 56°C

TTGACATGTTCCTGAAGCTGAAG RYR3R2 ryr3 Yamada et al, 2009

PCR/Sanger quencing 56°C AGAAGAAGCCGGTGATCACCTCCT LgCA*

mcr 本研究 PCR-瓊脂糖電泳 58°C ATGATATGCTTGTATTATATACTTA

表2 測序群體在每個標記上的測序個體數Tab.2 The number of individuals

quenced at each marker per populationcytb mcr ryr3匯泉2013 7 8 4匯泉2015 0 12 0石老人2013 8 8 7石老人2015 0 12 0嶗山 5 12 1榮成 11 11 7大連 21 14 5

1.5 序列比對

使用DNAStar軟件包中的SeqMan程序查看測序峰圖, 除去引物區, 舍棄雙峰區段并對稀有變異位點逐個檢查。在MegAlign程序中用ClustalV算法進行初步比對, 結果保存為paup文件, 后者再經DNASP軟件轉為fasta文件。在MEGA5(Tamumra et al, 2011)中對 fasta格式的序列進行再次比對后, 根據日本學者已發表的同源序列, 對標記cytb和ryr3截至相同長度用于后續分析; 對線粒體控制區 mcr保留測序全長?？紤]到不同標記的突變速率、堿基替代模型和選擇壓力可能存在差異, 我們沒有把不同標記拼接成聯合片段。本研究所提交序列的

GenBank登錄號為KT598738-KT598761(ryr3), KT598808-KT598860(cytb),KT598970-KT599022(mcr); 本研究引用序列登錄號為AB503858-AB504047(cytb), AB504202-AB504232(ryr3), KF486456-KF486460(ryr3)。

1.6 系統發育分析

首先基于最大似然法(ML method), 對 2013—2014年測序所獲得的所有竿蝦虎魚的 cytb片段和ryr3片段, 在MEGA5(Tamumra et al, 2011)中篩選最佳堿基替代模型(BIC信息標準值最低)并構建最大似然樹, 自舉1000次。另外, 分別基于cytb和ryr3兩個基因片段, 應用Beast程序(Drummond et al, 2012)中的貝葉斯方法(同時考慮遺傳距離、替代模型和堿基順序)并加入外群物種(Yamada et al,

2009), 構建了貝葉斯系統發育樹。突變速率設為正態分布, 其均值在cytb為2.7%每堿基每百萬年(Yamada et al, 2009),ryr3的突變均速按總體P遺傳距離在兩個標記間的比例設定; 其標準差的設定保證 95%可能的突變速率落入 0.1%—10%每堿基每百萬年的取值區間內; 各標記的突變模型與相應最大似然樹所用模型相同;馬爾科夫鏈長200萬代, 采用Speciation： Yule Process假設, 每 1000代建立一棵系統發育樹; 舍棄前 10%后將所有分枝平均后驗概率最高者選出, 在 FigTree中顯示最后所得樹形圖(貝葉斯系統發育樹)。

1.7 群體分化與歷史動態分析 針對單一譜系 A 或 C, 在群體分化方面, 應用DNASP軟件(Librado et al, 2009)比較各分子標記的多態性(核苷酸多態度、多態位點數目、單倍型數目);通過Arlequin3.5軟件(Excoffier et al, 2010)計算cytb和mcr基因片段所揭示的群體間遺傳分化指數FST及其顯著性概率 P值。另外, 為比較中日大群體(所有中國沿海單倍型和所有日本沿海單倍型)間的遺傳分化, 亦應用 Arlequin3.5軟件構建竿蝦虎魚譜系間的單倍型最小進化網絡圖。最后, 應用 Beast軟件包中的Tracer程序,

選擇與本文系統發育分析同樣的突變速率分布和堿基替代模型, 但采用

Coalescent：Bayesian Skyline假設與linear stepwi溯祖模型, 對每個譜系進行了有效種群大小的歷史動態反演, 其結果以Bayesian skyline plots(BSP)方式呈現。

此外, 為探討竿蝦虎魚譜系 A中群體內的遺傳變異是否在時間上具有穩定性, 我們對所獲得的匯泉灣和石老人海水浴場的2013年群體樣本和2015年群體樣本的

mcr基因片段序列進行比對分析, 應用MEGA5軟件構建ML進化樹。

2 結果與分析

2.1 DNA分子標記多態性比較

在本研究中, 所獲得的cytb的608bp片段中共有103個多態性位點, 在52個測序個體中檢測到22個單倍型, 核苷酸多樣性 π值為 0.069; 所獲得的 mcr的917bp片段中共有88個多態性位點與27個indel位點, 在53個測序個體(不包括2015年采集的匯泉灣和石老人群體樣品)中檢測到40個單倍型, 核苷酸多樣性π值為0.036(考慮indels： 0.047); 所獲得的核基因ryr3的505bp片段中共有12個多態性位點, 在24個測序個體中區分出 10個單倍型, 核苷酸多樣性 π值為0.0063。

2.2 竿蝦虎魚隱存多樣性及其地理格局

如圖1所示, 中國北方沿海分布有偏南、偏北兩個竿蝦虎魚的譜系, 分別對應竿蝦虎魚日本沿海群體的譜系A和C(Yamada et al, 2009)。其中, 偏南譜系(譜系A)集中分布在青島市石老人海域及其以南(除一個個體混居于大連群體中, 兩個個體混居于榮成群體外); 而偏北譜系(譜系C)只分布在嶗山沿海及其以北。

2.3 譜系間分子系統發育比較

結合已發表的 L. guttatus的同源基因序列(Yamada et al, 2009), 我們發現從線粒體DNA片段和核基因外顯子片段上分開的竿蝦虎魚譜系能夠相互對應, 但分支順序不同(圖2)。且當加入外群時, 基于ryr3構建的貝葉斯樹揭示竿蝦虎魚譜系C最先分出,譜系B其次, 譜系A處于樹的頂端; 而基于線粒體基因cytb構建的貝葉斯樹則表明譜系B、C先聚成一枝,譜系A單成一枝并先與其他竿蝦虎魚屬物種相聚(圖3)。

2.4 中日沿海群體分化與有效種群擴張

圖2 基于cytb基因片段(上)和ryr3基因片段(下)構建的竿蝦虎魚ML進化樹Fig.2

ML trees of L. guttatus bad on cytb (upper) and ryr3(nether)

對單一譜系從群體間遺傳分化指數 FST值判斷,在中日群體間, 竿蝦虎魚譜系A在線粒體cytb標記上的遺傳分化較大(FST = 0.12, P＜0.05), 但譜系C在中日大群體間的分化更具顯著性(FST = 0.31, P＜0.01)。單倍型網絡圖(圖 4)更直觀地揭示了中日大群體間的遺傳分化?；诰€粒體cytb我國所有測序群體除大連-榮成外,

其余兩兩群體間皆存在顯著的遺傳分化(0.17＜FST＜0.23, P＜0.05); 使用線粒體控制區標記 mcr亦檢測到較大的群體間遺傳分化(-0.02 ＜ FST ＜ 0.96),且匯泉-石老人(FST =0.08)，大連-榮成(FST =-0.02)，大連-嶗山間(FST =0.00)分化不顯著(P ＞ 0.05)，其余兩兩群體間的遺傳分化均達到顯著水平(P＜0.03)。另一方面,

基于cytb的BSP結果表明, 譜系A、C都呈現出3—5萬年以來的有效種群擴張,

且譜系C的變化幅度更大; 用核基因片段ryr3并未檢測到近期的種群擴張, 但譜系C的總體瓶頸效應更為明顯(圖5)。 2.5 竿蝦虎魚群體遺傳組成時間上的穩定性

基于線粒體 mcr基因片斷對分別于 2013年和2015年采自匯泉灣與石老人海水浴場的四個群體進行群體遺傳學分析, 結果顯示同一地理群體不同采樣年份的樣本間 FST值均較低(HQ2013-HQ2015, 群體間 FST = -0.01, P ＞ 0.05; SLR2013-SLR2015, 群體間FST = 0.05, P ＞ 0.05)。如圖6所示, 采自匯泉灣和石老人海水浴場的個體并未在所構建的 ML樹上分出與年份對應的枝系, 兩個群體在同一年份的樣本都是分散的, 且以遺傳距離衡量其分枝長度在 1.5%以內。此外, 在混合這兩個群體時, ML樹仍呈現出以地理群體為主導的分枝結構, 匯泉灣群體更多地處于樹的基部, 而石老人群體更向頂端分枝集中(圖 6,左)。這一結果表明, 竿蝦虎魚具有較強的本地化棲息習性, 群體內世代間的遺傳分化較小, 整體遺傳結構主要受空間因素影響。

圖3 基于ryr3(a)和cytb(b)的竿蝦虎魚屬貝葉斯進化樹Fig.3 Bayesian trees of

Luciogobius bad on ryr3 (a) and cytb (b)注： a： TN+G+I堿基替代模型; b：

GTR+G+I堿基替代模型; 圖中A、B、C分別為竿蝦虎魚譜系A、譜系B、譜系C

圖4 竿蝦虎魚各譜系中國大群體(黑色)與日本大群體(白色)的cytb單倍型網絡圖Fig.4 Haplotype network of L. guttatus lineage A and C bad on cytb注：

數字和短劃線代表不同單倍型間的核苷酸替換數目

3 討論

在我國和日本沿海, 竿蝦虎魚譜系A、C都存在同域分布的情形, 而我國竿蝦虎魚譜系A、C的分布比重改變于嶗山西南側的石老人與東側的仰口之間。嶗山是我國海岸線上海拔最高的山峰, 第四紀冰川在嶗山(尤其東側海岸)留有多處遺跡(Kusky et

al,2011)。且嶗山附近海底地貌復雜、坡度較大, 以致夏季表層水溫在青島沿海區域性急劇下降(王彬, 2010),且東(北)風下的表層海流在嶗山附近形成渦旋(王彬,2010)。而根據近海遙感資料, 懸浮物濃度、葉綠素a濃度、硅氮比等生態指標都能在青島近海沿南北方向形成主要梯度(竇勇, 2012)。這些歷史、地理和生態背景可能是阻礙竿蝦虎魚譜系A、C在嶗山附近海岸相互滲透的重要原因。而根據

GenBank上已有的竿蝦虎魚線粒體DNA能夠推斷, 竿蝦虎魚譜系A在北海道至本州島南部沿海以及對馬海峽西岸都有分布(Yamada et al, 2009; Jeon et al,

2012), 本研究也進一步佐證了這一海洋型譜系(Hashimoto et al, 2014)在我國北方沿海相對于偏淡水型譜系 C的廣布性(沒有來自韓國沿海譜系C的分子信息)。譜系B已知分布于西南日本沿海及琉球群島, 在本研究中未能檢測到。

圖5 基于cytb與ryr3基因片段構建的竿蝦虎魚A、C譜系的BSP圖Fig.5

Bayesian skyline plots of L. guttatus lineage A and C bad on cytb and

ryr3注： Ne為有效群體大小, T為時間

竿蝦虎魚屬內物種分類的混亂與各譜系形態的趨同進化密不可分。本研究進一步證明, 對隱存多樣性高的海洋魚類物種(如： 竿蝦虎魚), 使用高多態性的 DNA標記(如： 線粒體 DNA)可以得到比形態分類更準確的系統發育關系。同時我們也看到,

從線粒體基因與核基因上分出的竿蝦虎魚譜系雖然能夠對應起來, 但分支的順序是不一致的。核基因ryr3編碼一種內質網上的鈣離子通道蛋白, 主要在神經系統中表達(Nakashima et al, 1997); 在高緯度沿海更大的年溫差下, 譜系C可能具備更靈活的鈣離子信號的調控以促進對季節間溫度變化的適應; 而譜系間所受選擇壓力的差異可能是竿蝦虎魚在核基因與線粒體DNA上呈現出系統發育模式差異的一個潛在因素。另外, 本研究只選用了一個核基因片段, 所得結果可能受到片段特異性選擇壓力的影響。為更加完整地闡明竿蝦虎魚譜系間的遺傳分化, 后續工作中應選用更多的核基因序列片段進行深入研究。

查明群體遺傳組成的時空變化對于全面理解竿蝦虎魚譜系內群體間遺傳分化至關重要。雖然竿蝦虎魚成體不適合長距離游泳, 但其幼體浮游期一般為20—35天, 且隨降溫而增加, 這在其 1—2年的生活史中, 與多數洄游型魚類相比所占的比例并不小(Kitano et al, 2003); 加之其對海水、淡水環境均能迅速適應, 故竿蝦虎魚的幼體擴散能力可能要高于預期。因此, 竿蝦虎魚幼體可能在海流的作用下發生較遠的空間遷移, 同一地理群體不同時間的補充群體的遺傳組成也可能存在差異。本研究結果表明, 雖然采樣時間并不在同一年的同一季節, 竿蝦虎魚譜系內部群體的遺傳組成在時間上仍具有穩定性。此外, 竿蝦虎魚各譜系內部的我國各群體間雖然存在一定的遺傳分化, 但部分群體間可能由于幼體擴散導致高水平的基因交流, 其遺傳分化未能達到顯著水平。

圖6 基于mcr基因片段的匯泉-石老人兩群體(左)、石老人(右上)與匯泉(右下)單群體年際ML樹Fig.6 ML trees of L. guttatus sampled in different years from

HQ-SLR (left), SLR (upper right) and HQ (lower right) bad on mcr注：

HQ： 2013年匯泉采樣; SLR： 2013年石老人采樣; H： 2015年匯泉采樣; S：

2015年石老人采樣

本研究基于線粒體 DNA的分析結果表明, 竿蝦虎魚各譜系都經歷了與末次冰期相關的有效種群擴張(開始于約3—5萬年前), 以及開始于日本海南部海域東岸的群體分化(開始時間更早, 約10—30萬年前)：其中譜系C的中日間群體分化早于譜系A, 且更可能受到近30萬年來全球海平面漲落的影響(Lambeck et al, 2014)。本研究中的核基因片段多態性較低, 且序列較少, 未能反映出末次冰期后的有效種群恢復, 但基于核基因ryr3獲得的BSP圖進一步支持了譜系C在末次冰期前(約

12—30萬年前)有效種群數量趨于減小, 而譜系A并未體現出末次冰期前的瓶頸效應。我們推斷, 偏北分布的譜系C在末次冰期初期可能經受了更強的選擇壓力, 而譜系 A很有可能在間冰期時隨海侵擴散到青島沿海。綜觀各標記的分析結果,竿蝦虎魚可能是一個物種復合體(L. guttatus agg.)：其中譜系B、C起源于第四紀初期并在冰期發生緯向隔離(譜系B可能是L. ryukyuensis的同種異名); 譜系A起源于中新世末期并廣泛分布于中間緯度, 雖可能與譜系 C同域分布, 但應該加以分子鑒別并單獨保護。

參 考 文 獻

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