畢赤酵母表達知識歸納

2023年12月4日發(作者：歲月留聲)

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畢赤酵母表達知識歸納1

a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有這么3種方案：

1、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；

2、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；

3、水浴加熱，溫度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養基中一般可以不單獨添加，因為YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發酵還是必須要添加的。

b.有幾個比較迷惑的問題請教大家：(很典型的小問題）

1、制感受態細胞，OD多少比較好？

pyrimidine 戰友的方法：取1mlGS115過夜培養物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中。

說明書還有一些文獻是說在1.3左右效率高，再高了效率會很低

2、關于高效轉化法，文獻說用(LiAc)，而invitrogen的說明書說轉化畢赤酵母用(LiAc)沒用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. U only lithium chloride.

3、YNB到底能高溫滅么？有的說能有的說不能。

過濾滅菌的怎么操作？

我是把濾器裝好膜綁到瓶口用紗布蓋上，報紙包上，瓶蓋放燒杯里單滅。然后把配好的溶液用注射器一點點推進去。

4、葡萄糖為什么在YPD里一起滅顏色很深，單滅則不會。

該115度還是121度滅？網上搜了下，都有人用！

5、電轉化參數用400歐還是200歐？有的用400，有的還專門說不是用400。

都是從園里看到的！

電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400）

6、電轉后，在MD平板上長的應該就是整合了目的基因的重組子了吧？

如果不想篩 高拷貝的，是否PCR驗證一下即可？

網友的回答：

ynb最好不滅菌，我是0.22um過濾處理的。invitrogen手冊上可以滅菌的。

gluco和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配制培養基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。

想請教下關于菌種保存的方法。

我現在是采用斜面保存的方法，但感覺每次接菌都要打開斜面，而且每次的接菌量難免會有不少的誤差，所以很想問一下大家都是怎么保存菌種的，特別是甘油菌的保存方法。

我一般吸取300ul的菌液到滅菌的ＥＰ管然后加等體積的甘油，混勻．防于－２０度．保存長的話最好放－８０度冰箱 一般OD是2-6，過夜菌

在篩選高表達菌種中，我一般有一下步驟，很很多人做的不太一樣，和說明書也有點差異，如下：

每次轉化前，均用多種酶切，BlgII/salI/sacI同時切，然后轉化時，用GS115/KM71/KM71H同時轉化，轉化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉化后涂MM及YPD+0.25G，長出菌落后，即進行大規模的表達試驗，這里我要重點說明的是，我直接用YPD表達的，一般48h后即進行大量的SDS-PAGE鑒定，鑒定時，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶后再做PCR，測序。

我已用這兒方法做了好幾個基因出來。

關于酵母表達時BMMY的PH值

我也覺得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表達的兩個蛋白都是這樣，表達量要高一些。但也不能一概而論，不同目標蛋白表達最適pH不一樣，不過表達的pH值最好要遠離目標蛋白的pI。

像目前國內外做的最好的rHSA，最適pH大概5-6左右，也有不同的報道，可能和工藝頁有關系。而我自己正在做的一個蛋白pH4較好，3、5表達時上清電泳目標帶大量減少，雜帶大量增多。

求助一下很棘手的問題，大家在酵母表達過程中控制目標蛋白降解方面有什么高招，小弟最近為這個有點兒焦頭爛額。

我試過用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明顯。

不知道兄臺是胞內表達還是胞外表達，如果是分泌表達，目標蛋白確實容易被降解。你可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養液的pH值減少酶活，酵母生長pH值比較廣，4～7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當酶解底物；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達點也別給降解光了。實在沒辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點（當然不能影響表達和蛋白活性）。

Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of

specific foreign proteins creted into the is culture medium.

The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or

casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one

or more problem proteas.

The cond strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH

3.0 and pH7.0. The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which

is explained by the hypothesis that portea activity is induced under nitrogen starvation.

The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

如何優化密碼子來提高蛋白表達量，具體考慮哪些因素（肯定不是單純的全部置換為使用頻率高的密碼子吧）看有些文獻優化后的密碼子有些都是使用頻率不高的，實在很困惑.有沒有做過這方面的，急切的想得到你的指導，收取一定的費用也可以。謝謝了，我在上海。

密碼子改造對提高表達量只有有限的作用。

影響外源蛋白在Pichia中表達水平的限速步驟（rate-limiting factors)很多。

涉及到轉錄，翻譯，蛋白在ER和Golgi的合成和折疊，以及分泌信號肽定位和切割，蛋白修飾等很多方面（H. Hohenblum, Biotechnology and Bioenginering, 2004, 85:367-374) 。

關鍵是根據你要表達的蛋白性質以及DNA序列特性來推測（！）哪個步驟是關鍵的限速步驟。

實際上，很多分泌表達的蛋白，蛋白在ER中合成和折疊以及信號肽的切割是關鍵步驟。現象是很多錯誤折疊的蛋白在胞內聚集和降解。

密碼子作為限速步驟很多時候體現在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素轉錄提前終止，這方面文獻在NCBI上有一些。

畢赤酵母表達知識歸納2

我用Pichia酵母分泌表達兩個不同的蛋白，結果Western Blot的結果顯示，兩個蛋白均比理論分子量少了20k左右。難道都是被發酵液中的蛋白酶降解了？大家碰到過這樣的情況嗎？

如果是少了20K左右,肯定要考慮酶解的可能了.你的目的蛋白一級序列是否有Pichia酵母的Kex2酶降解位點.我現在做的蛋白就有這種情況,但是是降解產物和目的蛋白共存,有的蛋白幸免遇難

用BglII、SalI、SacI酶切 的區別是什么？

我是想做蛋白表達，用BglII后轉化行么？

它們三個是不是哪個可以用了？

BglII 好像能把質粒切成兩段，與其它兩種線性化方法比較，較易生成muts型的轉化子，當然比例也是少。

SalI、SacI酶切基本只能產生mut+型的轉化子，我看文獻介紹，后者的轉化效率比前者要高。

我用前者線性化的，感受態也是用常規方法，沒有DTT LiCl什么的，板子也是長得滿滿的。 哪位有畢赤酵母上罐的一些無機培養基配方能提供參考！謝謝！

畢赤酵母表達知識歸納3

畢赤酵母基因組DNA PCR怎么也p不出來，

質粒和線性化后的質粒都能P出來，

但是電轉化進入畢赤酵母GS115后怎么也p不出來，

不知怎么了？

以前做的都是小菜一碟呀，

那位戰友有這方面的經驗啊？

是不菌株有問題啊？

懇求指點一下！

非常感謝！

電轉化后涂在MD平板上的么？

應該大部分都是陽性克隆，可能是你提基因組的方法有問題，

以前有戰友介紹過菌落PCR的方法，我剛試過，效果非常非常好。

2.2kb的片段非常清楚。

退火溫度我用的56度1min，72度2min，35個循環。

挑取單菌落均勻涂抹于管底，開蓋在微波爐中檔加熱1min，-80℃5min，再加熱一次，然后加入20ul水，取1ul作為PCR模板。

他本來說離心取上清為模板，我就直接取的。

非常非常好用，

一般的方法提基因組，比如煮凍煮法等，很難P出2.2kb的AOX1 基因

而這個方法就能，還非常明顯。你翻一下前兩頁吧，我還把自己的圖貼出來了。

選5?aox和3‘aox這兩個引物，這樣還能判斷你的轉化子是mut+或muts型的。

跑出兩條來說明是mut+，其中一條2.2kb的就是aox1基因。

這里不涉及aox2，建議你去invitrogen網站下一本multicopy pichia expression manual，看一遍就很清楚了。

MD平板上的陽性克隆應該比例很大的，我覺得3個就至少有一個是。

萬事都沒那么覺對的，在整合時，可能僅His4基因整合入了酵母基因組，所以也能生長，但無目的基因。

請教幾個問題 1. 鑒定重組時候，我煮凍煮方法獲取酵母基因組作為模板，用目的基因的引物進行擴增，結果有些產物很強，有些很弱，為什么？

2。是否存在這樣情況，線性化載體進入酵母內，沒有進入核內進行重組，或者進入核內，僅僅黏附在酵母基因組上，沒有發生重組呢？

如果有這個情況，該如何區別？

3.用燒瓶搖菌的轉速對表達有什么影響，聽說過高轉速使酵母總處于分裂增殖，而表達低？

4.大家大規模發酵的步驟是怎么樣的，能提供一個方案嗎？

關于PCR的問題，我覺得你的模板差異大嗎？我做很多次PCR鑒定，發覺模板量的差別對PCR的結果會有非常大的影響。不過我做的PCR鑒定，基本上都是用AOX1引物P的，倒是沒用過目的基因引物。

搖瓶的問題我也說不出來，因為我到目前為止都沒做出分泌性表達來，汗啊……（都在胞內了）速度我都是按照Protocol上的推薦速度搖的，一般都是250rpm以上。

我做的時候使用蝸牛酶消化0.5h，然后沸水浴15min，12000g離心3min，取1ul做模板即可。

再問個有關GAP質粒表達的問題。

小量搖瓶表達的時候需要保證氧通量而使用雙層紗布包住瓶口嗎？還是直接用牛皮紙包住就行了？

一般說來，小瓶發酵的時候只需要用牛皮紙包住瓶口就可以了，搖床的速度不要過快，那樣會使得通氣量不夠，小瓶發酵時由于不添加消泡劑所以應該避免搖速過快而引起得泡沫。泡沫得產生直接影響到通氣的效果。

我們在做大規模發酵時才用紗布將發酵罐的餓通氣口都包住，小瓶發酵，那么做得話，可能會導致污染，因為酵母是長得比較慢的。

這個想法可以阿

鹽濃度對表達的影響

我想有個問題，緩沖液是起緩沖作用的，

濃度低了影響緩沖效果，濃度高了抑制菌生長？

可以做不同pH的比較試驗，

再加上其他的因素，比如轉速，所加培養基的量（通氣量），甲醇量等

做個正交設計，學了統計，就是不會用阿，呵呵

pH和甲醇濃度我之前都有嘗試過。轉速啥的沒做過。

濃度也是偶然想到的，所以想嘗試下。

我的目的基因序列中有一個AAAATT,不知道這個序列是否會影響我的目的蛋白的表達，心里沒有譜，希望能有高手指點。

應該不會，現在鑒定出來的導致轉錄提前終止的序列只有HIV gp120蛋白上一段序列包含TTTTATA。如果不怕麻煩，做一下Northern鑒定，或者直接突變掉一兩個堿基。

酵母發酵兩三天后有些菌體發紅，是怎么回事啊

是突變還是真菌污染呢

我的最近也出現這樣情況，是否真的是污染呢？

我的最近也出現這樣情況，是否真的是污染呢？

個人認為是老化了

試過同一批轉化的克隆，有些克隆在培養幾天后就轉粉紅，但多數克隆沒有轉變，聽說是培養的代數多了，酵母的某個酶發生突變

回纖夫兄：

你的目的基因是1.7kb，有沒有加493bp左右的載體序列？你有沒有做一個空載體的轉化？應該是500bp左右，這樣你的帶也在2.2kb左右，呵呵

分不清了，可以用a-factor 3?aox來擴，這樣好像增加196

pPIC9K ：9276 bp

AOX1基因為2.2kb

以GS115基因組為模板，5‘ AOX1/ 3‘ AOX1為引物，將擴出2.2kb的AOX1基因。以α-factor/

3‘ AOX1為引物，將不能擴出任何片段。

以整合了pPIC9K的GS115基因組為模板，5‘ AOX1/ 3‘ AOX1為引物，將擴出2.2kb的AOX1基因以及pPIC9K載體上的493bp，以α-factor/ 3‘ AOX1為引物，將擴出pPIC9K載體上的196bp。

畢赤酵母表達知識歸納4 另外求助以下幾個問題：

1、BCA法測酵母上清總蛋白含量（BMMY）可以么？

詳細的見下面的帖子，請在此貼回復，謝謝。

BCA法測酵母上清蛋白濃度的問題

我做的時候是把上清稀釋了20倍，然后才落在標準曲線范圍內，

蛋白的量是6ug吧（標準曲線范圍是0-10ug，是每孔的蛋白量，不是濃度）

那樣，也就是說稀釋20倍后的上清濃度是6ug除以20ul（96孔板測得，每孔加20ul樣品）

未稀釋的上清就是6ug/ul，每升就是6g，我的蛋白跑SDS-PAGE，占上清的80%，那我蛋白的量豈不達到克級了！

而通過SDS-PAGE判斷，30多mg左右吧，這是怎么回事呢？

請問是否有干擾？就是BMMY培養上清阿

添加了1%的酪蛋白氨基酸，會影響么？

/bbs/post/view?bid=65&id=5990019&tpg=1&ppg=1&sty=1#6008621

2、用軟件分析的SDS-PAGE光密度，是否與其蛋白濃度成正比？

如果一條帶是另一個帶的3倍，是否蛋白量就是它的3倍？

但我測其蛋白濃度，卻相差不是很多？

3、電泳看到我的蛋白占上清的絕大多數，70%以上吧，但上親和柱，流出液的吸收都在5000mAU，好像大部分都流出了阿，我流速1ml/min，柱子是5ml的，絕對沒有過載，因為洗脫時可以看到，我的蛋白才從頂端下來，也就利用了1/10的柱子不到。

這是怎么回事呢？是否也與BCA法測蛋白濃度達到g級有關呢？

我用Lowry法測定的BMMY培養基中總蛋白濃度約200－300mg/L，使用的是Sigma的試劑盒，不過沒有加1％酪蛋白氨基酸，我看過的文獻BMMY培養基上清總蛋白濃度一般這個范圍。

BCA法應該也可以，但是6g/L的總蛋白濃度似乎太高，不過也有可能，因為1升培養基你加了10g酪蛋白氨基酸。

另外你絕對不能根據你所謂的SDS-PAGE的蛋白含量來計算你的蛋白表達量，實際值應該要小很多很多倍，酵母粉、蛋白胨和酪蛋白中那么多的蛋白降解片段和小肽等，電泳上是看不出來的，你過柱時光吸收值5000mAU，這就說明了5000mAU絕大部分是BMMY培養基中的雜蛋白。

感謝husiyi兄出來給我解答！

我也不知為什么BCA法測出來這么高，

我用TCA法將上清沉淀后，跑電泳，后來見蛋白質技術手冊上說用TCA法沉淀上清能去除干擾物質，我就測了下TCA沉淀后的蛋白濃度，經過換算，是153mg/L。

TCA法應該不沉淀小肽吧？我記得以前做空載體對照的誘導表達，好像沉淀不出東西。

那我該如何估算我目的蛋白的表達量呢？

我見過都是用SDS-PAGE分析目的蛋白占上清總蛋白的比例阿，然后根據上清總蛋白推算。標準的方法該是什么樣呢？

SDS-PAGE上顯示不出小肽，顯示的只是分泌的蛋白，這樣的話推算也該比較準的吧？

我的GS115宿主放在-80°C凍存有兩年多了，最近拿出來做了感受態做轉化，用的是LiCl法，載體是pPIC9，按照推薦的量最后鋪板，生長48h后RDB板上密密麻麻一層，設陰性對照同樣也長了一層。我覺得可能是GS115的組氨酸缺陷標記丟失了，于是用RDB ＆RDBH板篩選（這兩個板我沒配錯可以確定），結果挑了16個單菌落化版在RDB板上也均能生長，我不知道是不是全部凍存的GS115均已丟失標記，大家有遇到過這種情況嘛？能給我一些建議？

我在兩年前做過一批酵母轉化，用此方法均很順利的就挑出來陽性克隆，那個時候宿主是剛剛和別人討來的應該是篩選過的。其他試劑我都重新配過了應該沒有問題。

組氨酸缺陷標記丟失不太可能

因為GS115菌株組氨酸基因本身就是整合在基因上組的

保種菌株搞混倒有可能，說不定是一個你以前的轉化菌株

"原始單克隆菌重復生長"是這個意思:單克隆菌搖起來再涂板的話,也會長出許多個,它們其實是一種,這對于以后篩選多拷貝重組子來說增加了無謂的困難。

sooow，你好！你說的方法我看到了，正在嘗試，只是煮了煮，沒有液氮處理，擴了兩次，可能是我挑菌后用無菌去離子水稀釋的濃度不對，或是其它原因，還沒有擴增出來，我會繼續摸索條件的。

husiyi 你說的方法在Invitrogen手冊上是用96孔板，小孔液體培養的，我看過外文也有在電轉化之后，將轉化子直接涂不同G418濃度的YPDS平板（不是涂MD平板），我還沒有試過這種方法，我現在是要篩選MD板上長出的HIS＋重組子，我覺得這個方法不合適，還是對"原始單克隆菌重復生長"有顧慮。因為課題是以應用為主的，必須為后面的高產著想。用極少量的菌涂YPD－G418板，濃度提高，我會嘗試的。謝謝你們

依我看過的文獻和我們這邊表達的至少十幾個不同類型的蛋白來看

高拷貝對應高表達在99％的情況下是瞎扯，尤其對分泌表達的蛋白來說

決定蛋白分泌表達水平的一個重要因素是蛋白在胞內正確折疊和信號肽分泌處理過程，很多蛋白表達量太低基本上都是由于這個問題

酵母對二硫鍵的加工能力有一定局限性，所以二硫鍵含量較多的蛋白，以及一些很大的蛋白表達不是很好 我個人認為MD板結合G418－YPD板篩選的主要作用是利用兩個標記進行―雙保險‖篩選，保證挑選的克隆基本是整合了目的基因的陽性克隆，但是不代表重組蛋白一定會有表達

畢赤酵母表達知識歸納5

影響蛋白分泌表達水平的因素有很多，如:蛋白本身性質、基因劑量（拷貝數）、啟動子類型、信號肽種類、細胞內蛋白折疊能力、蛋白降解以及培養條件、誘導起始菌體濃度、誘導時間等等。這些從DNA、轉錄、翻譯到翻譯后加工水平的各種因素都可以說是蛋白高水平分泌表達的必要條件，不是充分條件。在起始條件下，可能某一因素是限制條件，如基因劑量。你提高了基因拷貝數，表達有所提高。提高到一定水平，細胞內蛋白折疊能力又成為了限制因素。加入分子伴侶提高了折疊能力，表達提高了，這時蛋白降解問題又出來了。所以具體蛋白要具體分析。能找到蛋白表達水平的特定限制因素那就是水平。就單一強調某一因素而不結合具體表達目標情況，那都是片面的。

畢赤酵母表達系統現在研究的熱點包括：

1 尋找新的啟動子、信號肽和篩選標志；

2 蛋白折疊、聚合和降解；

3 表達蛋白糖基化；

4 表達全抗體、膜蛋白及富含二硫鍵蛋白；

5 基礎研究包括過氧化物酶體、基因組測序（已完成，正注釋）。

哎！我的問題解決了！！！！！！冷丙酮造成的鹽共沉淀，不是蛋白沉淀！！！！！

看來我的分泌表達量是太少了，做了半年了，哎！！！！

我該如何優化表達條件，提高表達量呢？？我半年的工作時間呀！！！！！！

我也碰到了類似問題。請問，你如何知道是―冷丙酮造成的鹽共沉淀‖呢？

1.蛋白沉淀為絮狀,鹽沉淀呈片狀晶體;

2.我用tca沉淀做了對照,沉淀兩很少,在有丙酮不預熱沉淀會很少,不過還是鹽沉淀.

就是這樣了!

Casamino acid 中文名叫什么呢？

能加熱滅菌嗎?

酸水解酪素，可以加熱滅菌。沒有問題。

1、采用pyrimidine 兄弟推薦的畢赤酵母高效轉化實驗方案,方法附后.果然每個MD板子上長了上千個克隆.但是洗滌菌體后,稀釋200倍涂G418板子,在2~4mg的G418上都沒有生長.相反,上次每個MD板子上只長了30個左右克隆,在在2~4mg的G418上都有生長.大家知道什么原因嗎?

2、在G418板子上長出的克隆,大家都用什么辦法,簡捷而又準確地知道蛋白是否表達了呢?是否PCR鑒定正確的克隆,都能表達呢?

1.對于能用抗體檢測的表達產物,用western blot法,可以直接檢測電轉化后MD板上生長出來的HIS+轉化子,方法就是在BMMY平板上,覆上NC膜(無菌),用牙簽將菌落點到膜上,培養幾天,期間往平板蓋上補加甲醇,因為是倒置的,甲醇揮發可以補充培養里的甲醇消耗. 到時取出NC膜,檢測,通過顯色圈位置與大小,就可初步判斷是否表達與表達量的多少.

2.另外的情況,就是沒有抗體可用的. 遇到上千個重組子要篩選的話,真的很頭疼,看到很多發表的文獻上,用G418濃度梯度,從最小的0.25mg/mL,0.,4mg/mL. 操作條件和檢測效果真的有這么理想么? ? ?假若1000個重組子里有一個是抗4mg/mL的多拷貝,其他都無抗性,這一個重組子也會增值,可能在每個濃度梯度的板上都會長,在4mg/mL的板上也可能會長出好多個,結果做花了這么多功夫,到底還是就那么一個. (這是推測了,但可能就是事實)

所以當你面對 --幾千--個MD板上長出的HIS+轉化子時, 是---喜悅還是苦惱呢?!

(除了Invitrogen手冊上,在96孔板里傳3代,使每個轉化子都達到相同的稀釋外),還有什么好方法能使每個轉化子的濃度均一? 或有什么更簡便有效的方法?

用G418濃度梯度,想把梯度放大,少做幾板,有什么經驗可以參考呀? 請教了

對于樓上的，我也有相同的困惑。如果載體是pPIC9K,pPIC3K,這樣轉化出的重組子可以進行G418篩選，如果對于普通的載體轉化的重組子除了進行營養型篩選，PCR鑒定目的片斷已經整合到酵母基因組中，對于其是否表達，表達產物的量 多少，大家有沒有好點的方法啊？

對于樓上說的鑒定多拷貝的煩惱我也理解，

不過我覺得如果你的轉化子很多的話，

也就說明你的轉化率很高，

形成多拷貝的幾率也越大，

我這幾次做的時就是直接點到G418 4mg/ml的平板上，

這樣雖然費點事，

但是各個克隆還是獨立的，

比較可靠！

G418篩選不能用點的方法，你會發現所有的克隆在高濃度平板上都會長。應該是把MD板上的菌落全洗下來，稀釋到一定濃度，然后涂板。

0.25 0.5 1 1.5 2mg/ml，我做了這幾個濃度，每個濃度就是一個板，不是很多吧？ 可以看到每個板長得菌落數是越來越少，長出來的時間也越來越長。

當然存在你從0.25板上取得可能是抗更高濃度的，可以通過雜交法準確確定拷貝數的，說明書上提到了。

但肯定不存在venthcat說的那種情況，高拷貝生成的幾率是非常低的。

電轉化過程，生成了低拷貝的基礎上才能生成高拷貝。

我的結果是1.5的表達量最高，2.0的雖然蛋白總量挺高，但目的蛋白并不是最多的。

我們不可能對每個轉化子都去比較它們的表達量，而且它們之間差距并不大，我覺得后面的條件優化對表達量的影響更大。

一般的做研究生課題，表達了就達到了你的目的了，可以找上十幾個比較一下。

本人剛開始作畢赤酵母表達，碰到了一個實質性問題，我的欲表達蛋白前端有一個信號肽，設計引物時沒有注意到這個問題，現在就帶著信號肽直接連到載體上了，前面的工作都作完后，發現甲醇誘導表達的上清液中檢測不到目的蛋白，不知是不是我引入的這段信號肽影響了目的蛋白的表達，請高手賜教！急！

應該不會，信號肽是被切割后，目的蛋白才分泌到培養基中的，也就是說，只要酵母本身切割徹底，你的目的蛋白就能夠在培養基中得到。

這幾天做表達，

我覺得我的目的蛋白條帶較弱，

而且在前面有不明條帶，

我懷疑是被降解了，

不知畢赤酵母本身分泌的蛋白酶都是什么了？

怎么可以避免降解了？

我用的是BMGY/BMMY培養基，

謝謝了！

蛋白酶的成分很復雜，研究沒有意義，如果想避免降解，可以注意以下方面：

1.優化培養基PH值，從3到6，不影響酵母生長，用添加緩沖液的方式來調PH值。

2.加入酸水解酪素，1％比例，可作為保護劑。也可以添加一些蛋白胨。

3.降低酵母表達溫度，可以試驗25度，這樣蛋白酶的活性會受到抑制。

請問個位戰友：

煮-凍-煮提酵母DNA方法很靈驗么

為什么我做了兩次都沒有呀

用了5AOX和3AOX引物和目的基因的引物都沒有個擴出來，以前用化學方法做出來過呀 ！

望賜教 ！！

煮-凍-煮提酵母DNA方法,我試了6次,只有上次不成功,但是我認為我作的轉化肯定沒有問題,所以我用玻璃珠法抽基因組DNA,在PCR,2.2kb,目的條帶都P出來了，不過就是麻煩了一點。但是這個方法很好用，不管是啤酒酵母，還是PICHIA，都沒有問題。

玻璃珠法提取酵母基因組DNA

1）接種到5ml YEPD液體培養基中， 30℃，250RPM過夜培養。

2）把培養液轉到15ml離心管，4000RPM離心5分鐘，去上清。

3）用3ml 滅菌水洗細胞，離心去上清。

4）把細胞懸浮在500ul 細胞裂解液中，并轉到1.5ml Eppendorf管中。

5）加入250ul~300ul玻璃珠， 并加入25ul 5M Nacl.。

6）在蝸旋震蕩器上最大速度震蕩一分鐘。.

7）2000rpm 離心2 minute。

8）用1ml的移液槍把液體轉到1.5ml Eppendorf管中。

9）加入500ul Tris平衡酚（ph8.2）, 用手劇烈搖1 分鐘,13200rpm 離心1 分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉到一個干凈的Eppendorf管中。

10) 加入500ul SEVAG(24:1 氯仿: 異丙醇), 用手劇烈搖1 分鐘,13200rpm 離心1 分鐘。用1ml的移液槍把水相（上層）轉到一個干凈的Eppendorf管中。

11) 加入 1ml 預冷的95%乙醇并在 -20℃沉淀DNA一個小時。

12) 13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在500ul的TE中。

13) 加入 50ul EDTA-Sark 和3ul RNa (10mg/ml) ,在37℃孵育30分鐘。再加入 2.5ul

proteina K (20mg/ml) , 在37℃孵育30分鐘。

14) 加入17ul 5M Nacl , 終濃度為0.15M, 重復步驟9和10。

15）13200RPM離心5 分鐘,去上清, 用70%的乙醇洗兩次，把DNA懸浮在200ul的TE中。

緩沖液：

細胞裂解液 : 0.1M Tris-Hcl (pH 8.0)

50mM EDTA

1% SDS

EDTA-Sark: 0.4M EDTA(pH 8.0)

2% Sarkosyl

TE : 10mM Tris-Hcl

1mM EDTA (pH 8.0)

to 超馬兄， 你說的細胞內外的蛋白都是一樣的，

我倒是沒做過驗證，

但是我總覺得細胞內的應該是帶有信號肽的，

如果你說的正確的話，

那么也就是說，

當信號肽分泌到細胞膜的時候，

Kex2信號肽酶切割完了又回到胞內了？

還是外源蛋白有ATG，信號肽沒有翻譯，

直接從你的外源基因開始翻譯？

望賜教！

我上次表達的外源蛋白沒有自身的ATG，而且沒有kex2酶切序列（當時怕酶切不完全，沒有設計），我想信號肽應該是在內質網完成切割的，停留在胞內進行糖基化，磷酸化等修飾。這樣胞內帶信號肽的外源蛋白量很少，western的時候看不出來，而切了信號肽的外源蛋白占了絕大多數，不知我說的是否正確？.

這次我要表達的外源基因沒有自身的信號肽，為一個膜蛋白，我想是否 需要將它自身的ATG也要設計進去呢？謝謝

你說的―信號肽應該是在內質網完成切割的，停留在胞內進行糖基化，磷酸化等修飾。‖我覺得是正確的，

畢赤酵母表達載體pPIC9K上的信號肽是引導外源融合蛋白到內質網的，

但是要分泌到細胞外就得靠a－因子，

a－因子是一個13個氨基酸的多肽，

也就是說從內質網出來的蛋白，

在外源蛋白的N末端仍然有13個氨基酸（a－因子），

最后在分泌到細胞外的過程中被kex2酶切割，

成為合適的外源蛋白，

不知是否正確？

望賜教！

畢赤酵母表達知識歸納6

最近做了一次電轉化失敗了，想了好多原因，不太明白啊。 這里我想問一下，我看資料和書上都說轉化時間是4.2-4.9ms,

但我用的電轉化儀是BTX的ECM830的型號，它在高壓模式下時間只能調到最高200μs,只有在低壓模式下才可達到ms，不知道這個是不是會影響到轉化的成功啊，希望高手指點一下，很急啊！謝謝！對了忘了說我用的載體是PPIC9K,酵母是GS115,外源基因是用SalI線性化酶切后進行轉化的。

轉化時間不是通過設置來確定的，這個參數不用調，我也沒見哪個地方可以調，設好電壓、電容和電阻就OK了，按pul，然后會出來電擊的一個曲線，那就是轉化時間，和樣品及電轉杯用的次數有關。如果你的轉化時間在那個范圍，說明比較正常，如果小于4ms，說明鹽多了，記得以前有人這么說過。

還想問一個問題，質粒線性化后需要純化嗎？是如何進行純化的？

我是這樣做的，不知道有沒有什么毛病，請指教

酶切產物純化

①加1ml樹脂，混勻20s（不要vortex）

②連接miniprep和槍管，將混合物加到槍管內，用真空泵抽吸

③加入2ml 80%異丙醇，待液體完全流盡后干燥樹脂30s

④將miniprep轉到1.5ml離心管中，10000×g離心2min

⑤將miniprep轉到新的1.5ml離心管中，加50ul預熱65℃的去離子水，放置1min

⑥10000×g離心20s，洗脫DNA

⑦保存于－20℃冰箱中

需要純化，等體積的酚/氯仿抽提，然后2倍體積無水乙醇沉淀，一定要用70%的乙醇洗兩遍，去除鹽，鹽多了，可能擊穿電轉杯。

乙醇沉淀比用柱回收的好。

畢赤酵母表達知識歸納7

1. 磷酸鉀溶液手冊說要過慮,但能否高壓滅菌呢?

2. 未轉化的酵母單克隆YPD培養液在搖了16h后,菌體像豆腐渣的,這樣正常嗎?

1 磷酸鉀溶液高壓滅菌沒有問題

2 肯定不正常，是不是染菌了，涂片看看。

某些外源性蛋白在酵母中表達不理想，但經過基因優化以后有不少蛋白還是可以獲得一定量的表達。常見的優化方式有密碼子優化及發卡結構消除。我們實驗室已經有兩個這樣的情況通過上述辦法得到解決。一個基因的表達主要也就轉錄和翻譯兩步。如果說還有一部比較關鍵的話，也許再加一步分泌（在此，只討論分泌型表達的情況），這樣就算作三步：轉錄、翻譯、分泌。那一步有問題都將導致表達量過低，但就我個人認為轉綠應該不是大問題，諸如密碼子優化、二級結構消除等優化策略均直指翻譯一步且效果不錯，最近看到一篇文獻，作者針對于其表達的基因從mRNA水平、蛋白質水平分別進行了檢測結果發現野生型低表達與優化后告表達在mRNA水平上無明顯差別，而在蛋白質水平有較大差別。翻譯和分泌我個人認為可能是影響目的蛋白表達的關鍵環節。先說翻譯，密碼子的偏好性無疑是影響蛋白表大量的一個關鍵因素，基因二級結構比如發卡結構也應當是一個重要因素。但是在基因優化過程中一味地選用高效密碼子或單一地消除二級結構都不見得有好的效果。因此有關基因優化的策略還希望有高人貢獻一下自己的心得或大家一起探索一些可能的策略。最后，分泌一步導致培液中蛋白量過少或沒有可能確與蛋白自身有些關系，更換信號肽或選擇其它表達方式可能是一條出路。

今天最想和大家討論也是最想求助與大家的是：如果要通過Real-time PCR去分析一個外源基因的mRNA水平（哈哈，別笑我太奢侈）選擇一個什么樣的內參合適，beta-actin？GAPDH？酵母中是否也有這些看家基因。我沒有能從NCBI上查到酵母中這兩個基因的序列。希望有哪位知道的施舍一下。

提高表達量的方法有很多:

1 構建多拷貝質粒

2 選用酵母偏愛密碼子

3 增加產物穩定性,在培養基中加PMSF,蛋白水解物等

我也正在進行Pichia的表達，可是在誘導過程的第2，3 天是，酵母液的顏色變紅且味道發臭，請問這是污染嗎？我一共搖了3次，都是這種情況，請問有什么可以預防的方法嗎？

是污染了，我的也曾經出現過這種情況，但我不知道污染的是什么，記得以前也有人討論過這個問題，好像是一種酵母，也有人說是老化了，預防的話就是嚴格無菌操作，另外你的培養基是否已經被污染了，我感覺我的就是培養基時間長了，被污染了，重新配了就好了，另外，我不知道你是怎樣誘導的，你最好在MD板上劃菌，調單菌落，因為有時板上也會長出紅色的菌落的啊，good luck!

1、酵母分泌的蛋白酶在pH中性附近活力高。表達液徹底離心后,調節pH避開中性范圍。

2、蛋白質幾次凍融應該沒大的問題，故先分裝-20度冷凍保存。

3、另外，可根據情況加入蛋白酶抑制劑。 我用的是Difco 0919-07,的YNB 無氨基酵母氮源, 250g裝,

For classifying yeasts bad on amino acid and carbohydrate requirements

Ammonium sulfate .....5.0g/L RT

這是 北京拜爾迪生物公司" 的YNB（無氨基酵母氮源），BD 291920(原DIFCO公司)，250g，價格：￥680/250g，現貨，Ammonium sulfate------5.0g/L，含有硫酸銨，請參考。

134g用1L去離子水融解,就是10X的YNB了,不用加其它成分,過濾除菌就可以,不能高壓(我就是這樣做的,我們實驗室就是買的這家公司的)

G418我們這用的是上海生工的 SD6308, 40mg/mL的

GS115的基因組DNA的提取方法分子克隆上講的很清楚,采用更簡單的方法,就是反復煮凍煮,我就是這樣做,擴不出來再煮凍,做了好幾輪PCR,最后出來了擴增很亮,結果重復性也很好(當然是用G418對HIS+轉化子進行了高拷貝篩選之后的重點菌落做的,需要鑒定的菌落個數也不多,十有七八都是陽性的,需要有耐心).

我還沒開始做，現在遇到一個問題是，怎么能使信號肽被完全切掉，一個氨基酸殘基都不剩，因為不知道剩下的氨基酸殘基會不會影響蛋白的活性，所以現在要先構建一個質粒，使其信號肽能100%被切掉。

所以請教一下高手們關于各種信號肽及其切割位點的信息。

幾天以后：最近查了一些文獻，α因子信號肽包含83個氨基酸殘基的前導肽及后面一段由lys—Arg(Glu—Ala)l-2或Lys—Arg—Glu—Ala—Asp—Ala氨基酸序列組成的間隔肽。膜結合蛋白酶KEX2基因產物識別lys—Arg—C端，STE13基因表達產物則識別(Glu—Ala)或Asp—Ala外側。前導肽和間隔肽對蛋白質的正確切割和分泌至關重要，但有時由于上述兩種基因產物的切割活力不同，會在外源蛋白的N端產生不同的切割位點，使一些分泌的蛋白N端帶有(Glu—Ala) 融合序列 ，即產生酵母信號肽切割不完全現象，也就是我在上面提到的問題。但是還是有很多人用以α因子為信號肽的載體并得到了成功表達。也有一些人采用別的信號肽來克服這方面的問題。迄今我查的基本上是中文資料，所以還要繼續努力。

我要做的蛋白N端對活性很重要，所以需要一個信號肽可以完全切掉的載體，目前正在查這方面的資料。各位園友誰比較了解這方面，望多多指教！

有沒有人試過低溫表達酵母(30以下), 據說有助于蛋白結構的折疊,對分泌表達也有好處. 試過的請說一下,在什么溫度下表達,效果如何?

我做的就是在28度下表達的，量還可以至于對于空間結構的影響沒有鑒定過.

畢赤酵母表達知識歸納8 甲醇酵母表達系統有不少優點，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達系統最為人熟知，并廣泛應用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內。

甲基酵母部分優點與其他真核表達系統比較與原核表達系統比較

1.屬于真核表達系統，具有一定的蛋白質翻譯后加工，有利于真核蛋白的表達優點-+

強效啟動子，外源基因產物表達量高，可以達到每升數克表達產物的水平++++

3.酵母培養、轉化、高密度發酵等操作接近原核生物，遠較真核系統簡單，非常適合大規模工業化生產。+++=

4.可以誘導表達，也可以分泌表達，便于產物純化。=+

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業產物替代葡萄糖作為碳源，生產成本低++++

+ 表示優勝于；- 表示不如；= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

產品性能：

優點——使用簡單，表達量高，His-tag便于純化

缺點——酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題

全面產品報告及心得體會：

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表達，并且在表達后α-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導表達的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導使用的IPTG便宜。

第一步——構建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。 紅葉山莊：有關是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用

抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30—50KD）的蛋白在產量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養的過程中要區別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經歷），如果在不知情的情況下繼續做下去，那可以就是浪費大把的時間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環境），生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達（其實后來發現大腸桿菌pET系列分泌表達系列也不錯）和糖基化修飾（主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：

①酶切位點不能出現在目的DNA片段中——如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設計表達的時候，如果在N端不能出現任何多余的aa（比如藥物蛋白表達），需要特別留意（說明書上有詳細說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設計克隆的時候要反復確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養基要用低鹽培養基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物； ⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯基因片段進行表達，另外也可以在轉化酵母的時候重復轉化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-r-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,r這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉化入Pichia酵母中。

Xiang

Yang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準備了化學轉化試劑——EasyComp

Transformation，但是由于轉化率的緣故，我建議使用電轉儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點有些不盡相同（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔心轉化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現型，也就是說可以在含甲醇的培養基中快速生長，但是據說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產物免受降解，促進表達量的提高。

一般來說，如果是胞內表達，應盡量用Mut－細胞，這樣得到的蛋白產物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢

(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細胞都可應用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同，因此在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。

另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現了轉化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準備酵母菌的同時也需要準備質粒，由于酵母菌轉化對轉化質粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時候都會用PEG大提質粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。在轉化前質粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達）。線性化位點個人認為也會影響到表達量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況，這個時候也不是說不能進行表達，但是準備的質粒就要增加10倍，另外也可以進行部分酶切（即先進行預實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質粒有部分是在線性化位點切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔心EDTA對于轉化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風干，這一步需要多加注意保證風干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉化的影響頗大。

接下來就是酵母轉化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關鍵步驟。轉化方法有不少，例如電轉，化學轉化，原生質體轉化，其方法的難易程度和轉化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉最容易，轉化率較高（但要求有電轉儀），而原生質體最麻煩，而且效果不好（比較傳統），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細說明了電轉，化學轉化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是：

（電轉過程）

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養過的酵母放置時間不要超過一個星期；

②擴大培養的濃度一定要控制好，個人認為不需要OD600達到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個時候的酵母比較新鮮，轉化率比較高；

③整個感受態制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉化的關鍵——為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉杯都要預冷；

④電轉儀需要預熱，所以準備感受態的時候就可以把電轉儀打開了，電轉后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉化的數量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉后可以看看時間，如果時間過短（比如〈4）就可能說明雜質較多，會影響轉化率；

⑤轉化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養基30℃搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉化率。

（化學轉化）

如果沒有電轉儀，LiCl轉化是一種可供選擇的方法，轉化率是102到103cfu/ug。

主要過程為：

取過夜活化培養的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養基，30℃培養至OD600達到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL

，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態細胞12

000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入

50%PEG 240ml

1mmol/L LiCl 36 ml

單鏈鮭精DNA 25ml

線性化質粒DNA 10 ml (約10mg)

用吸頭反復吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉化液，細胞沉淀加1ml

YPD培養基于30℃ 200 rpm培養2-4hr，取轉化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM

的YPDS平板，30℃培養2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang

Yang：在protocol中用了許多篇幅來指導這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因為比較快），具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養菌然后進行沸水和-20℃冷凍循環過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內是可以得到好的結果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養菌的濃度以及用來凍融的菌數量有關。其次是假陽性和假陰性結果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現3.6kb的片段，而Mut+則會出現AOX1基因原本長度的片段——大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區分。建議PCR過程中使用多對引物進行反應，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子的轉錄終止子(5‘AOX1和3‘AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記（HIS4區的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復野生型.HIS4區或AOX1區位點的整合都使轉化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉化子.）及3‘AOX1區,當整合型載體轉化受體菌感受態細胞時,他的5‘AOX1和3‘AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養基中,外源基因在5‘AOX1啟動子的控制下表達.在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉化子,轉化子的拷貝數與抗G418的能力有關,通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩定性.

第四步——表達

Xiang

Yang：將你的克隆在YPD培養基中培育到OD600值達到6.0，就可以離心收菌。用表達培養基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間——不同于大腸桿菌的兩天出結果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉化的酵母菌，另外調整進行重新轉化。

另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質粒），陽性對照（可以是曾經表達成功的重組子）和沒有進行轉化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養基獲得菌），轉入BMMY中誘導表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養基就，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時需要注意的是搖瓶內菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復凍融，最好分裝保存——因為蛋白經煮沸變性會不穩定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調節培養基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質，競爭性抑制蛋白水解酶的活性來防止表達產物降解。

如果使用的是分泌型培養基，按道理收集培養基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達蛋白量非常大。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發水分濃縮了。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內蛋白，以防沒有分泌出來。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個需要全盤重新準備的過程，要考慮清楚。如果選用的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Western

blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節可見Western

Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統表達出來的蛋白無法發生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達中可能出現的情況包括表達量低，沒有分泌表達（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結構在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉化，更換線性化位點或者更換菌株；如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產生了競爭表達；畢赤酵母無法重復的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復不了這個結果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正常現象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。

第五步——發酵和產物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE

Healthcare），經過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體（antiparallel

homodimer）的糖蛋白，經過純化，我通過一個細胞增殖實驗（cell proliferation

assay）檢測了其活性，結果表明表達出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結合活性，與對照（通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白）相比，his-tag有一點副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發酵罐培養條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養條件，使其產物的表達量與預期的發酵罐培養結果相近。

總而言之，EasySelect系統是一個便于操作的酵母表達系統，我已經使用這一系統表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養液的純化蛋白。

畢赤酵母表達知識歸納9

以pPIC9K為例，pPIC9K是用于在畢赤酵母中的多拷貝整合分泌表達蛋白的穿梭載體，利用組氨酸缺陷型標記進行互補篩選。

一、信號肽的2步切割 pPIC9K載體帶有自身信號肽，在分泌過程中被切除，但是由于切割效率，在目的產物N端帶有3－5個左右的信號肽的氨基酸。

設計引物時，為了防止切割不完全，能去掉GluAla兩個重復單位，不過文獻報道多個Glu會提高kex2的切割效率。

要求目的蛋白中不能含有信號肽酶切割序列：glu-lys-arg-glu-ala-glu-ala。

信號肽的切除分為兩步：kex2在glu-lys-arg和glu-ala-glu-ala之間初步切除，STE123在兩個glu-ala之間切割。

二、是否在3' 端是帶上一些其本來的序列？

1,首先，你要保證表達后細胞內信號肽酶能正確識別原來的位點，即此位點是不能隨便增減的，否則信號肽不能正常切割，在這個基礎上你再決定3' 端其本來序列的去留。

2，一般5'端多出一些氨基酸不會明顯影響到你的目的蛋白的活性，我們平時在做酵母表達時，信號肽切割后，目的蛋白往往有幾個多余的AA，這對活性好象沒什么影響，雖然如此，但你還得注意多余AA的性質，不能過酸或過堿。

三、重組pPIC9K/GS115表達出目的條帶后，

確定信號肽是否切除完全的方法：

1、N端測序

2、先查查你的氨基酸序列里有沒有糖基化位點，如果有就只能N端測序了。如果沒有，看分子量大小。

信號肽中有kex2和ste13兩個酶切位點，現在擔心的是kex2的位點酶切完全了，但ste13的兩個酶切位點glu， ala重復序列沒有切干凈，如果這兩個氨基酸沒有切除完全的話，分子量差異不大，兩個氨基酸的差異應該看不出來，一般來說，N端多一兩個AA應該對蛋白的活性沒有太大影響。western檢測有兩個條帶的問題，可能是目的蛋白有一部分被降解了。

四、附：信號肽切割原理和優化切割

《Expression of Your Recombinant Protein with a Native N-terminus》

If you wish to have your protein expresd with a native N-terminus, you should clone

your gene flush(直接地) with the Kex2 cleavage site. U PCR to rebuild the quence from the

Xho I site at bp 1184-1189 to the arginine codon at nucleotides 1193-1195. Remember to include

the first amino acid of your protein, if necessary, for correct fusion to the Kex2 cleavage site.

Signal Sequence Processing

The processing of the α-factor signal quence in pPICZα occurs in two steps: 1. The preliminary cleavage of the signal quence by the KEX2 gene product,

final Kex2 cleavage occurring between arginine and glutamine in the quence

Lys-Arg * Glu-Ala-Glu-Ala, where * is the site of cleavage.

2. The Glu-Ala repeats are further cleaved by the STE13 gene product.

Optimization of Signal Cleavage

In Saccharomyces cerevisiae, it has been noted that the Glu-Ala repeats are not necessary

for cleavage by Kex2, but cleavage after Glu-Lys-Arg may be more efficient when

followed by Glu-Ala repeats. A number of amino acids are tolerated at site X instead of

Glu in the quence Glu-Lys-Arg-X. The amino acids include the aromatic amino acids,

small amino acids, and histidine. Proline, however, will inhibit Kex2 cleavage. For more

information on Kex2 cleavage, plea e (Brake et al., 1984).

There are some cas where Ste13 cleavage of Glu-Ala repeats is not efficient, and Glu-

Ala repeats are left on the N-terminus of the expresd protein of interest. This is

generally dependent on the protein of interest.

continued on next page

五、翻譯Genebank所查序列

為設計一個引物，在Genebank上查找序列如下：

CDS 序列是 57～560， sig_peptide 從 57～119， mat_peptide 從 120～557。

問題如下：

1、sig_peptide和 mat_peptide 各代表什么意思，sig_peptide是不是就是信號肽，哪mat_peptide

是什么？

2、sig_peptide前面1～57是序列的什么部分？

3、cDNA序列中除了CDS是編碼區外其它部分主要起什么作用，在設計引物時應該從第一個堿基開始還是從信號肽開始，還是從CDS的第一個堿基開始！

答：sig_peptide 信號肽，mat_peptide 成熟肽，就是切除信號肽以后的成熟蛋白元件。sig_peptide前面1～57是5?非編碼序列，它一般含有Kozard序列，在翻譯起始過程中發揮作用。3‘非編碼序列是幫助翻譯的終止。

母轉化原理：

Like Saccharomyces cerevisiae, linear DNA can generate stable transformants of Pichia

pastoris via homologous recombination between the transforming DNA and regions of

homology within the genome (Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989). Such integrants show extreme stability in the abnce of lective pressure even when prent as multiple copies.

Note that single crossover events (inrtions) are much more likely to happen than double

crossover events (replacements). Multiple inrtion events occur spontaneously at about 1-10% of

the single inrtion events.

像釀酒酵母,線性化的轉化DNA和Pichia pastoris基因組的同源區域發生同源重組,使得線性化DNA產生穩定的轉化子(Cregg et al., 1985; Cregg et al., 1989).這樣的整合方式顯示極強的穩定性,即使多拷貝轉化子在沒有選擇壓力的情況下也很穩定.單交換事件(插入)比雙交換事件(置換)發生幾率更大.單插入事件中約發生1-10%概率的多插入事件.

電轉化注意點：

一、 制備感受態的菌液收集時間：

1、準確測定OD值：OD在1.2～1.5之間。

1） 為了準確測定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測定（1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關系）。每個倍數做3－5個重復，應該可以大致推斷OD值是否準確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數不夠！

2） OD值是否測準也可以這樣估算：OD600為40左右時，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體濕重將相應下降。

2、75ml的菌，經18h左右的培養，最后sorbital洗滌完畢后，50ml離心管里所剩菌體特別濃，需要1ml sorbitol才可溶解為糊狀。正常培養的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態也用1ml稀釋的，沒那么粘稠。可以看看降低培養溫度（27攝氏度）或縮短培養時間（12h）。

3、甚至不用轉接,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過夜，效果也很好

二、制備感受態的菌液量

如果只轉一個樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養液如果OD值正常的話夠做10管感受態的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態，每一步的離心時間30秒就行。整個流程時間短，制備好的感受態用來做轉化的效率很高。

山梨醇離心，洗滌的過程之后的重懸的時候注意濃度，不要過于粘稠和稀釋。

三、感受態的保存

感受態細胞做好后由于電轉化杯還沒有處理好等原因，在冰上放幾個小時再做可能有一定的影響，盡量馬上制備馬上轉化。如果感受態細胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分裝，-70 或 -80 攝氏度保存。 另附：酵母GS115點種分離純化

接種GS115于5ml YPD液體培養基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養48 小時，用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化，挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。

四、電轉化注意點：

1、感受態做好后，最后一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態純凈些。

2、最后用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻！（怕量不夠，吸得很多，電轉時效果反而不好。 ）

3、電轉杯清潔處理:一般先沖洗，洗凈；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我們都是放在超凈臺上，開啟紫外，邊吹風晾干，邊進行紫外照射。電轉杯的新包裝或重復使用可能對轉化率有一定的影響。

4、電擊的時候，電壓數以及電擊時間可以摸索一下，適當增加電壓或者延長電擊時間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進行，電擊時間可以減少一點，設置為5ms左右，電擊之后馬上加入預冷的山梨醇溶液，轉移至EP管，30度靜止培養1h。如果菌體懸液濃度比較大的時候，在制備感受態的時候要留心一下操作中的問題了。

5、電擊之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度搖床低速培養1h，再涂板。

6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。

7、轉化后1ml用sorbitol重懸的細胞懸液不能全部涂在一塊板子上，按標準程序制作的感受態一般3塊左右可能比較合適，以干燥后看見一薄層淡淡的白色為宜。轉化子會在白色的薄層上長出圓韻、飽滿的大菌落的。

五、轉化試劑和培養基的正確準備方法

1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長。

2、YNB42度水浴一會，然后過濾除菌，YNB是加到培養基里面的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關系不是太大）。

3、山梨醇，以及無菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中

4、一般用10ug以上質粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ul ddH2O重溶。轉化效率一般大于100個克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細胞，轉化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導致電擊時放電時間很短。

5個電轉化方案

方法一：高效

1.收集菌體

取1mlGS115過夜培養物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉淀用無菌水(4℃)洗滌，同樣條件下離心，棄上清。

2.菌體處理

加入1ml處理液，室溫下放置20min。

處理液：

10mM LiAc

10mM DTT

0.6M sorbitol

10mM TrisHCl(pH7.5)

3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清，

4.用1M sorbitol洗滌二次，到最終體積約為80μl.（菌體太多可適當棄去部分）

5.加入10μl.經過BglⅡ酶切處理的工程質粒，混勻后轉入 電擊杯中，冰浴5min.

6.電轉. 1.5kv，25μF，200Ω條件下進行電轉。

7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培養2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分別為100、200微升，剩余的經離心處理后全部涂在一個平板上)

有一點要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。

方法二：按下面步驟轉化,開始每個板子只長了一二十菌落;小細節修改后,每個板長了約100個.

步驟如下：

1、目的DNA（pPIC9K)，經電泳檢測已經線性化（SalI酶切）；

2、DNA純化方法是經酚仿－氯仿兩步抽提后，無水乙醇沉淀的，目測定量應足夠；

3、GS115甘油菌經新鮮平板復蘇后，5ML培養過夜，16h左右后，取菌1：100稀釋，接種于70ml菌液擴大培養，14h后測得OD600約1.3左右。 4、將sorbital、水和菌液均冰浴；

5、菌液離心5min－100ml冰水洗滌－50ml冰水洗滌－4ml sorbital洗滌，然后溶解于300ul冰sorbital；

6、加入約5～10ug的DNA，槍吹勻，置0.2CM電轉杯靜置5min；

7、電擊，1,5KV.

8、立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止10min。

9、取100ul轉化液，涂布10cm的MD平板。

做了一點修改每塊板子大概能長100來個菌落（一般需要2天左右）：

1、菌液收集時間：以前可能是OD值測得不太準確，我然后把菌液分別做了1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關系。1、菌液測OD值時，建議將菌液稀釋不同濃度測定，這樣才準確些。菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能就是你的OD稀釋倍數不夠！你分別稀釋2倍、4倍、8倍、10倍等，每個倍數做3－5個重復，應該可以大致推斷OD值是否準確！

2、我開始是先挑單克隆于5mlYPD中，過夜16h后，轉接于50ml YPD中，培養大概18個小時吧。OD值是否測準可以這樣估算：OD600為40左右時，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體濕重將相應下降。[測OD，用什么作空白對照呢？菌體稀釋液，我一般使用PBS]

3、電擊條件等上面帖子上都有，1.5kv，放電4.8～5.5ms。

2、其它做法相同，就是感受態做好后，最后一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態純凈些。

3、最后用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻！（我以前怕量不夠，吸得很多，電轉時效果反而不好。 ）

4、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時候吸收效果會好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長。

5、你說的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一會，然后過濾除菌。我沒有加硫酸銨。YNB是加到培養基里面的，去離子水pH偏低哦，我建議直接用蒸餾水就可以了（關系不是太大）。

方法三：簡便獨特

在篩選高表達菌種中，與大多數人和說明書有區別(成功做出幾個基因):

每次轉化前，均用多種酶BlgII/salI/sacI同時切，轉化時，用GS115/KM71/KM71H同時轉化，轉化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉化后涂MM及YPD+0.25G，長出菌落后，即進行大規模的表達試驗，直接用YPD表達的，一般48h后即進行大量的SDS-PAGE鑒定，鑒定時，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶后再做PCR，測序。

方法四：沒有轉化子（無aa的YNB和硫酸銨稱好后，去離子水溶解，然后高壓滅菌）

1.挑取酵母單菌落，接種至含有50ml YPD培養基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培養過夜約14h，OD600約1.3

2.菌液離心5min－50ml冰水洗滌－25ml冰水洗滌－2ml sorbital洗滌，然后溶解于200ul冰sorbital；兩管分裝，每管100ul

3.加入約5～10ug的線性化的DNA20ul，槍吹勻，置0.2CM電轉杯冰浴5min；

4.電擊，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用于轉化細菌及酵母。

5.立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止1h。

將菌體懸液涂布于MD平板上，每300μl涂布一塊平板；

方法五: 和Invitrogen公司說明書差不多的方法

X33菌株于100ml YPD搖到OD600約1.1-1.3，太高影響感受態效率

(1) 1500－1700g離心5min，將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下，充分棄上清

(2) 加入100ml 冰浴的超純水ddH2O，可在振蕩器上振蕩混勻，可靜置3－5分鐘

(3) 離心，棄上清，再加100ml ddH2O洗一遍

(4) 離心，棄上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍

(5) 離心，棄上清，菌體置于冰浴中，加入約100－200ul Sorbitol混勻

加入Sorbitol量需自己調整，這時菌液很濃，只要能夠用200ul黃槍頭吸出來就可以了，一般共有約400－500ul，夠做幾管感受態了。

(7) 吸取100－150ul感受態到線性化的DNA中，用槍頭打勻或手指彈勻

靜置5min，于2mm電轉化杯中，電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400），一般放電時間在4.5-4.9ms之間，小于4說明你的DNA鹽濃度太高

(9) 立即加入1ml Sorbitol，轉入10ml 離心管，30度靜置1小時，然后加入1ml YPD，30度，200rpm搖1小時，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板

(10) 一般轉化效率可以達到：200個以上轉化子每200ul菌液，足夠篩選表達菌株了。

方法六:酵母感受態細胞的制備

? 接種Pichia pastoris GS115于5 ml YPD液體培養基，30℃，250~300250 rpm ，過夜。

? 取200μl的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養過夜，一般12小時左右。

? 將細胞培養物于4℃，5000g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；

? 按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸； ? 按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；

? 按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為2ml；

? NOTE：可將其分裝為200μl一份的包裝冷凍起來，但如果保存時間過長會影響其轉化效率。

酵母PCR的6種基因組提取方法

1、簡易微波爐加熱/-20℃冷凍法提取基因組

在微波爐中檔加熱1min，-20℃2min，(如果你怕之前效果不夠，加熱驟冷這兩步可以重復一次)加入20ul水，振蕩1min，離心30s，上清作為PCR模板。

附：

1.挑選克隆培養過夜；

2.取1ml（或500ul）離心，收集菌體，蒸餾水洗一次，1ml山梨醇洗一次，（輕輕吹打），離心，收集菌體；

3.溶于100ul蒸餾水，80‘C/10min,可在PCR儀中完成；

4.離心，收集上清

，引物可以用5‘AOX, 3‘AOX引物

或這個方案：

1.取1ml菌液2500rpm離心5min，棄上清

2.用500ulPBS懸浮沉淀，2500rpm離心3min，棄上清

3.100ulTE融解沉淀，沸水浴10min，－70?C冷凍40min，1500rpm離心，

4.再次沸水浴10min，1500rpm離心，

5.取上清為模板，以5‘AOX1和3?AOX1引物進行反應

2、手冊的溶壁酶法： ―畢赤酵母基因組的提取‖方法完整的步驟

? 接種重組和空質粒轉化子于5ml YPDZ培養基， GS115菌于YPD培養基作對照，30℃，培養16～18小時。

? 室溫下，1500 g離心5-10min收集菌體

? 100 ulTE（pH 7.0）重懸，加入300 ul EDTA（pH 8.0），0.07M Tris－HCl，3 ulβ-巰基乙醇，1ul Lytica ，37℃水浴30 min。

? 10000g離心5~10min，取沉淀，加90ul TE重懸。 ?加入1 ul 100x proteinK ，10ul 10xSDS，56℃作用30min。

? 200ul 飽和酚，200ul氯仿，混勻，離心30s ，取上層水相。

? 加入兩倍體積無水乙醇以及1/10體積的NaAC，-20℃放置30min；

? 10000g離心20min，棄上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；

? 干燥后，加入15 μl的TE或H2O溶解，-20℃備用。

手冊中酵母基因組的提取的方法，稱之為―溶壁酶法‖，還有其他的一些方法，例如―酸性玻璃珠法‖，還有一些試劑盒的提取等途徑，等等。

―溶壁酶法‖法的主要原理是在EDTA存在的情況下，用proteinK（蛋白酶K）消化真核細胞，用SDS溶解細胞膜并使蛋白質變性。核酸通過有機溶劑（如氯仿，飽和酚等）抽提進行純化。這種方法可以產生十微克至數百微克的DNA。{利用Lytica（sigma公司）打破細胞，釋放重組質粒，需要通過離心收集質粒，以備下一步利用蛋白酶K和SDS作用于質粒，提取整合有外源基因的DNA。}

3、參考―精編分子生物學‖上的方法，省去玻璃珠這一步，PCR擴出目的基因，效果還不錯。

（1） YPD 培養基的配制：15gYPD粉末,來自Clontech公司,溶于300ml水中，6分鐘121℃高壓滅菌后，加入4.5 ml Adenine 溶液（Adenine，Sigma,200ug溶于10ml 0.5M HCl中 ）。

（2） 取YPD培養液3ml 到15ml 離心管中，挑AH109 酵母單克隆到培養液中，30℃，200RPM，4小時培養。

（3） 用10ml YPD培養液培養次級AH109，過夜。

（4） 3000RPM，10分鐘離心。用0.5ml水重懸。移液于新的1.5ml EP 管中，在室溫下離心，倒掉上清，快速振蕩。

（5） 取少量酵母菌沉淀，加1 ml消化緩沖液（見《精編分子生物學》,包括：100mmol/L,NaCl;

10mmol/L, ; 25mmol/L EDTA; 0.5% W/V,SDS ）及蛋白酶K（20 mg/ml）,使終濃度達到0.1 mg/ml，65℃水浴使充分消化。

（6） 取出200ul, 加200ul酚/氯仿（1：1）高速震蕩3分鐘。加TE 200ul, 高速震蕩，高速離心13000RPM，5分鐘。

（7） 加1/2體積 7.5mol/L (NH3)Ac 及兩倍體積無水乙醇,顛倒混勻,室溫下13000RPM,3分鐘離心。冰70%乙醇洗滌。

（8） 去上清,干燥沉淀, 30ul 無菌水溶解。測OD，-20℃保存。

4、參考細菌總DNA提取方法，簡化摸索得到，提取釀酒酵母和畢赤酵母完全可行。產物足以用來做N多次PCR模板。如果使用試劑盒提取的話會非常的純。 （1）、菌體培養：出發菌先培養18-36小時，獲得足夠的菌體。

菌體收集：取1.5ml培養液于1.5ml離心管中，12000rpm離心20秒，棄上清，收集菌體（注意吸干多余的水分）。

（2）、消化：每管加入200mg/ml的蝸牛酶50μl，RNa 5μl，處理30-60min。

（3）、裂解：向每管加入200μl裂解緩沖液（40mMTris-乙酸，pH 8.0 20mM乙酸鈉，1mM

EDTA,1%SDS，其實就是加了SDS的TAE（50倍TAE母液和SDS母液）,用吸管頭迅速強烈抽吸以懸浮和裂解細菌細胞。

（4）、沉淀蛋白：向每管加入66μl5M NaCl，充分混勻后，12000rpm離心10分鐘，除去蛋白質復合物及細胞壁等殘查。

（5）、得到上清液后

A:

將上清轉移到新離心管中，加入等體積的氯仿，充分混勻后，12000rpm離心3分鐘，進一步沉淀蛋白質。

沉淀DNA：小心取出上清用兩倍的無水乙醇沉淀，離心棄上清。

洗滌DNA：用400μl 70%的乙醇洗滌兩次。

室溫或真空干燥后，50μlTE或超純水溶解DNA，-20℃冰箱放置備用。

B:

使用DNA快速純化試劑盒（其實膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒都可以靈活使用）

5、軍科院的方法：

（1）、用酵母細胞裂解液重懸酵母菌

（2）、加酚－氯仿

（3）、加玻璃珠

（4）、振蕩半小時

（5）、乙醇沉淀

（6）、電轉大腸桿菌

Detailed:

Plasmid Isolation from Yeast

Reagents and Materials Required

The YEASTMAKER Yeast Plasmid Isolation Kit (#K1611-1) provides the SDS and lytica

solutions, CHROMA SPIN-

1000 DEPC-H2O Columns, and 2-ml centrifuge tubes for u with the columns.

? Appropriate SD liquid or agar medium to keep lection on the plasmids (Appendix C.A; Appendix E).

? Sterile, 1.5-ml microcentrifuge tubes (or a 96-tube microtiter array, multichannel pipettors, and

centrifuge adaptor for multiwell plates).

? 20% SDS

? Lytica Solution (5 units/ml in TE buffer; store at 4°C for up to 2 months or at –20°C for up to

6 months. If colloidal material precipitates, mix the solution by inversion before using.)

? Recommended: CHROMA SPIN-1000 DEPC-H2O Columns (#K1334-1) and 2-ml centrifuge

tubes for u with the columns

? If you do not u CHROMA SPIN Columns, you will need materials to perform

phenol:chloroform

extraction and ethanol precipitation:

? Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1; See Sambrook et al., 1989, for information on

preparing neutralized phenol solutions)

? 10 M ammonium acetate

? 95–100% ethanol

e yeast cultures for lysis (Step a, b, or c below).

a. From a solid patch of growth:

i. Spread a thin film of yeast cells (~2-cm2 patch) onto the appropriate SD agar medium.

ii. Incubate plate at 30°C for 3–4 days. (The patch should show abundant yeast growth.)

iii. Scrape up a portion of the patch (~10 mm2) and resuspend the cells in 50 ml of sterile

H2O or TE in a 1.5-ml microcentrifuge tube.

b. From a liquid culture:

i. Inoculate a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the

appropriate SD liquid medium. Vortex tube vigorously to completely break up the colony

and resuspend the cells.

ii. Incubate at 30°C overnight with shaking at 230–250 rpm.

iii. Spin down the cells by centrifuging at 14,000 rpm for 5 min.

iv. Carefully pour off the supernatant and resuspend pellets in the residual liquid (total

volume ~50 ml).

c. For mi-automated handling of a large number of samples:

i. Place a large (2–4-mm), fresh (2–4-day-old) yeast colony into 0.5 ml of the appropriate

SD liquid medium in parate wells of a 96-tube microtiter array. Vortex each tube

vigorously to resuspend the cells. (Alternatively, u 0.5 ml of an overnight SD liquid culture instead of a yeast colony.)

ii. Using a centrifuge adapted for multiwell plates, centrifuge the entire array at 1,000 x g

for 5 min to pellet the cells.

iii. Carefully pour (or draw) off supernatants and resuspend pellets in the residual medium

(~50 ml) by vortexing or pipetting up and down.

2. Add 10 ml of lytica solution to each tube. Thoroughly resuspend the cells by vortexing

or repeatedly pipetting up and down.

3. Incubate tubes at 37°C for 30–60 min with shaking at 200-250 rpm.

[Optional] Check a drop of the cell suspension under a pha contrast microscope (400X) for the

progress of

cell lysis by adding a drop of 20% SDS to the side of the coverslip. As they come into contact

with the SDS, most

cells should lo their refractile appearance and appear as "ghost-like" spheroplasts. If there are

still many intact

cells prent, incubate the samples for another 30 min.

4. Add 10 ml of 20% SDS to each tube and vortex vigorously for 1 min to mix.

5. Put the samples through one freeze/thaw cycle (at –20°C) and vortex again to ensure

complete lysis of the cells.

6. If necessary, samples can be stored frozen at –20°C. If samples have been frozen, vortex

them again before using them.

7. Pour the entire contents of the tube from Step 5 above onto a prespun CHROMA SPIN-

1000 Column and purify the plasmid DNA according to the CHROMA SPIN Ur Manual.

Purified plasmid DNA will elute from the column.

If you do not u CHROMA SPIN Columns, clean up the prep as follows:

a. Bring the volume of the sample up to 200 ml in TE buffer (pH 7.0).

b. Add 200 ml of phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1).

c. Vortex at highest speed for 5 min.

d. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.

e. Transfer the aqueous (upper) pha to a fresh tube.

f. Add 8 ml of 10 M ammonium acetate and 500 ml of 95–100% Ethanol.

h. Place at –70°C or in a dry-ice/ethanol bath for 1 hr.

i. Centrifuge at 14,000 rpm for 10 min.

j. Discard supernatant and dry the pellet.

k. Resuspend pellet in 20 ml of H2O. Note: The amount of plasmid DNA recovered is small relative to the contaminating genomic DNA;

therefore, it cannot be measured by A260 or en on an agaro gel.

另外：酵母菌落PCR方法

Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法

模板的處理：

1.平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；

2.將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；

3.用半根滅菌的牙簽（節約，而且好用）挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一個滅菌的1.5毫升離心管，對PCR管和1.5毫升離心管編號；

擴增，1％ 瓊脂糖凝膠電泳；

5.對于PCR擴增顯現特異性條帶的克隆，把置于1.5毫升離心管中的半截牙簽扔到5毫升YPDZ培養基中，30度培養，8－12小時后提質粒，酶切鑒定確認。

PCR反應體系：

以TaKaRa Taq DNA聚合酶反應為例，引物為5′ AOX1 primer，3′AOX primer：

組分 20μl體系

10xReaction Buffer 2.0μl

dNTP 1.6μl

Primer 1（20pmol/L） 0.5μl

Primer 2（20pmol/L） 0.5μl

ddH2O 15.2μl

Taq DNA聚合酶 0.2μl

TOTAL 20.0μl

PCR反應條件：

初始變性 94℃ 4min 1

變性 94℃ 30s 30個循環

退火 50~54℃ 30s

延伸 72℃ 30s

結束延伸 72℃ 10min 1

保存 4℃ 1

如果篩選的是Mut+，將會出現兩條帶，一個是目的基因，另一個是2.2kb的AOX1基因，空質粒會出現以下條帶（pPICZαA 588 bp)，將兩者的大小加在一起來解釋出現的實驗結果。

我的結果是空載體的有大約580多的條帶，但重組子的PCR只有將近1000bp的條帶（我的目的基因是400bp），沒有2.2kb的條帶。

6其它一法：

er 1.5 ml of liquid culture of yeast grown for 20 – 24 h at 30°C in YPD (1% yeast extract,

2% peptone, 2% dextro) into a microcentrifuge tube. Pellet cells by centrifugation at 20,000 × g

for 5 minutes.

2. Add 200 μl of lysis buffer (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH

8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0).

3. Immer tubes in a dry ice-ethanol bath for 2 minutes, transfer to in a 95°C water bath for 1

minute. Repeat; vortex 30 conds.

4. Add 200 μl of chloroform; vortex 2 minutes.

5. Centrifuge 3 minutes, room temperature, 20,000 × g.

6. Transfer the upper aqueous pha to a microcentrifuge tube containing 400 μl ice-cold 100%

ethanol. Mix by inversion or gentle vortexing.

7. Incubate at room temperature, 5 minutes. Alternatively, precipitate at -20°C to increa yield.

8. Centrifuge 5 minutes, room temperature, 20,000 × g. Remove supernatant with a pulled Pasteur

pipette by vacuum aspiration.

9. Wash the pellet with 0.5 ml 70% ethanol, spin down as described in step 8 above. Remove

supernatant.

10. Air-dry the pellets at room temperature or for 5 minutes at 60°C in a vacuum dryer.

11. Resuspend in 25–50 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)] or water. Samples

obtained directly from plates should be resuspended in a 10 μl volume。 酵母表達外源蛋白的注意點和相關檢測

1、 菌株

用GS115表達不出蛋白，換KM71H后，大部分克隆能表達。

2、溫度：

在28度和室溫下誘導表達，表達水平可能都不低。

3、pH

手冊上用6.0，pH提高到6.8，不表達的蛋白可能就表達出來。BMMY的pH7.0-7.5比較合適。國內外做的最好的rHSA，最適pH大概5-6左右。pH3的時候yeast和peptone好像會沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氫鉀調，具體比例自己去試試。

4、偏愛密碼子

codon bias一般不是主要的問題，你要表達的蛋白特性才是主要問題，酵母對分子量大（30KD以上），結構復雜（如一些蛋白酶），二硫鍵含量多的蛋白往往不能有效表達，尤其是分泌表達。密碼子改造對一些較小的而且結構簡單的蛋白表達量的提高可能有一些作用。比如一位戰友用Pichia酵母表達一個單鏈抗體，29KD，含有2對二硫鍵，表達量約幾毫克每升，選用酵母偏好密碼子全基因合成后，表達量沒有什么提高。

5、表達時間與空質粒轉化對照

誘導時間長了以后，是會有很多蛋白分泌出來的，時間越長雜蛋白就越多，且分子量都比較大。最好做一個空質粒轉化的對照，這樣就會比較肯定到底是不是自身的蛋白分泌的結果。

6、污染

每個樣品從G418板上挑10個左右單克隆于2ml BMGY搖菌（30ml玻璃管，比LB管大一點），紗布一般用8層，一天左右看著比較渾離心，留樣1ml，余1ml換2ml BMMY誘導表達，3,4層紗布足夠了。

污染一般都是跟瓶口覆蓋有關的原因造成的，只蓋紗布肯定會污染。加蓋報紙后，就再沒遇到過污染。如果只用6層紗布，污染的可能當然很大，100ml三角瓶，裝量10ml培養液，用橡筋把8層紗布和2層報紙拴緊封口，空氣浴搖床。

7、不表達

蛋白有沒有表達就要看你的運氣了，一般重復2－3次實驗都沒有表達菌株，這個蛋白就放棄表達了。 8、表達量

30KD,10mg/L表達量已經很高，最直接的方法是發酵，一般提高5－10倍。大腸桿菌一樣出現大團的超表達蛋白。

9、糖基化

酵母分泌表達的N糖基化是可以預測的，有如下序列：N X S/T就是潛在的糖基化位點，X為任意氨基酸，1個糖基化位點會加上1－3KD左右的糖基。另外可能還有O糖基化話，但是無法預測其位點，不過很少聽說表達蛋白有O糖基化的。如果胞內表達，不存在糖基化的問題 。

10、表型與表達

重組SalI和BglII酶切產生單交換和雙交換，結果就是產生Mut+和Muts表型的菌株；前者在甲醇誘導表達時生長快，消耗的甲醇多，后者生長慢，消耗的甲醇少，所以誘導表達時Muts表型要求更高的菌體濃度。一般用Mut+表型的較多，但是對某些蛋白Muts菌株可能表達的更好，只有試試才知道你的蛋白用那種菌株表達較好。

11、培養基

YPD：最基本的培養用；BMGY：誘導表達前培養用；BMMY：誘導表達用；MD：電轉化后篩選his＋用。

YEPD是不能代替BMGY的，因為有葡萄糖，這樣殘留的葡萄糖會影響下一步的誘導表達。不過有一種方法是可行的，就是用YPG培養基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。搖瓶畢竟不能和發酵罐比，甘油殘余會抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY滅菌后才能加甲醇、磷酸鉀、生物素。配制BMMY時也沒必要用5%過濾除菌的甲醇，在滅菌后使用前加100%甲醇至你要的濃度。

YNB可以高壓滅菌，沒問題的，也可以0.22um過濾處理，天冬氨酸和蘇氨酸要待培養基高壓滅菌后加入；配YPD時可以加入YPD一起滅菌，但時間不能太長，溫度不能太高，一般121-125度12-15分鐘足夠了。若時間過長，溫度過高，可能導致YPD焦化。gluco和含氮化合物在一起容易產生美拉德反應，這是配制培養基中的禁忌。顏色很深的話，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培養基108度35min高壓滅菌。

小量發酵其實可以把培養基成分中的YNB和生物素去除，培養基價格便宜，操作又方便，可以直接滅菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。

如果是用自己配置的培養基，如玉米浸提液、麥芽浸提液、麥麩浸提液等等，可以不用換液，采取添料來維持酵母對培養基的營養需要。 用無機鹽進行大規模發酵，更省錢。

大規模發酵時，甲醇的流加速度增加不要太快。另外使用純氧并不昂貴，在武漢買個鋼瓶600元左右，一瓶純氧20元。一個批次100h左右估計3－4瓶氧氣。

關于Tryptone和Peptone的選擇：

1）用培養的Tryptone替代Peptone對有些酵母菌可以,例如一般的表達酵母.但是對有酵母菌些絕對不行.例如做雙雜交的AH109,Y187之類表達酵母，根本就長不好．

2）Tryptone和Peptone雖然都是營養胨，但營養成分不一樣．即使是一般的表達酵母可以在Tryptone生長，生長狀態也沒有在Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有點不同外，其他沒什么區別，用peptone的目的不是為了提供氮源，提供氮源的是培養基里面的YNB。

3）如果要求不高，一般使用也還湊合．盡可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它國產的蛋白胨都可以很正常的培養絕大多數酵母菌．

4）用含Peptone的培養基顏色很深，純化表達蛋白時顏色要去掉，所以還要進行麻煩的后續處理。而改用Tryptone后，培養基顏色變得很淺，和LB（液體）顏色差不多，后續處理要簡單些。invitrogen說明書說 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶類水解，加入peptone的目的就是競爭性抑制目的蛋白的水解，因為peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。

培養畢赤酵母,書上說BIOTIN儲液是水溶液,但事實上BIOTIN很難溶于水, 可以稍稍水浴加熱一下。配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有這么3種方案：

1）、懶人是將Biotin直接溶在去離子水中，放過夜，基本就能溶；

2）、急性子是將溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；

3）、水浴加熱，溫度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。在畢赤酵母代謝過程中，作為多種酶的輔基起作用。天然培養基中一般可以不單獨添加，因為YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度發酵還是必須要添加的。MD、MM屬于基礎培養基，沒有哪種成分會含有微量生長因子（如生物素）。所以肯定要加的。

附：無機培養基配方

BSM無機培養基：

85% H3PO4 26.7ml/L

CaSO4 ?2H2O 0.93g/L

K2SO4 18.2g/L

MgSO4?2H2O 14.9g/L

KOH 4.13g/L 甘油 40g/L

PMT1 4.0ml/L

100%氨水調pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸銨調pH5.0，氨水用于上罐調pH（便宜，方便）。誘導表達前調pH6.0。pH5.0是為了防止BSM形成磷酸鈣沉淀，pH6.0是表達HSA融合蛋白的最適pH。

BSM高壓滅菌后再加4.0ml/L 過濾除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。100%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于補加甲醇誘導表達目的融合蛋白。

PMT1（1L）配方：

CuSO4?5H2O 6.0g/L

KI 0.088g/L

MnSO4?H2O 3.0g/L

Na2MoO4?2H2O 0.2g/L

H3BO3 0.02g/L

CoCl2?6H2O 0.5g/L

ZnCl2 20.0g/L

FeSO4?7H2O 65.0g/L

Biotin 0.2g/L

濃H2SO4 5.0ml

12、蛋白降解

分泌表達的目標蛋白比胞內蛋白確實容易被降解。可以嘗試以下幾種辦法：1、盡可能降低培養液的pH值減少酶活，酵母生長pH值比較廣，4～7都可以試一下；2、多試幾種蛋白添加劑，充當酶解底物（比如酵母酸）；3、摸索最適下罐（搖瓶也一樣），寧可少表達點也別給降解光了。實在沒辦法，只好換菌株或做pcr突變酶切位點（當然不能影響表達和蛋白活性）。

Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of

specific foreign proteins creted into the is culture medium.

1）、The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or

casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one

or more problem proteas.

2）、The cond strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between

pH 3.0 and pH7.0.

3）、The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portea activity is induced under nitrogen starvation.

The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

連續兩個或兩個以上的堿性氨基酸相鄰的結構，如果有的話，在這一位點是很容易被蛋白酶切斷，產生偏小的多肽。

13、換液

通常用BMGY和BMMY是要換液的，但也可以不用換液。培養到菌液渾濁后，直接向BMGY里加甲醇誘導就行了。GS115在第4天達到了最高表達量。換液不是必要的，適量甘油的存在有時反而會使表達量提高，

10ml生長培養后，等體積換液。我用250三角瓶，裝量25mlBMGY發酵2天，再取0.5ml加入BMMY（250三角瓶，裝量25ml)中誘導發酵.

BMGY和BMMY的換液方式有2種：

1）一種是離心換液，即在生長培養結束后，轉移到滅菌大離心管中，4000rpm室溫離心5分鐘后，用BMMY洗下菌體，再轉移到搖瓶，整個過程均用滅菌移液管操作。另外2）一種是靜止換液，即在生長培養結束后，將搖瓶在無菌室靜止4小時后，直接在酒精燈旁傾倒培養液，再加入誘導培養基，此種方法的缺點有少量生長培養基殘留。

是離心換液或者靜止換液，到底那個好，只有根據自己的實驗結果來考量。如果只是從防治污染的角度來說，靜止換液也好一些，因為操作畢竟少一些，速度也快。

總之，無論是取樣還是補料、加甲醇，盡量用滅菌的移液管（因為比較長，不容易引起污染）。當然，微量的如200ul，還是用移液器加（快而準確），可以在瓶口處往瓶內加入100％甲醇等。用新開啟的分析純甲醇，我們都沒有過濾或者其他處理，一直放在無菌室里面，每次直接用滅菌TIP吸取加入搖瓶就可以了。實驗室里也有人試過用膜過濾，結果膜都溶解了。

14、上罐表達

放罐時OD能達到400左右，生長過程最高OD500左右，重組蛋白發酵水平大約300-400mg/L。30g/L甘油初始培養OD約40左右，流加約420g/L甘油后，菌體密度達到最高約500。開始誘導后，起初3－5h之內流加的甲醇很少，發酵體積變化小，但是菌體的OD值是快速下降的，一般是原來的90%左右，每次都是這樣，確切原因我們也還不清楚，估計是酵母從高速生長轉向營養饑餓過程中，菌體形態發生很大變化，比如大小、含水量、折光率等。隨酵母逐漸適應利用甲醇為碳源，mut＋型酵母的誘導可以將甲醇的流速逐步提高，此時仍然能發現OD值下降，我們認為這主要是發酵體積增加的原因造成的。我們誘導過程一般增加約40%的體積7L到10L，最終OD值約為最高OD值的80%左右，簡單換算一下，應該知道菌體生物量增加約1/7。其實，這和畢赤酵母代謝甲醇途徑也是一致的，甲醇首先被氧化成甲醛，一部分繼續氧化成甲酸進而生成CO2，產生菌體所需的能量，另一部分可以被菌體同化，進入小分子碳架的合成途徑，提供菌體生長所需的碳源。

15、菌體密度：

菌體是在BMMY中培養的，可以不用BMMY做對照，在600nm處測OD值，培養基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

麥芽浸提液培養酵母（不換液，補料），生長階段結束后，密度可達到10-12，誘導培養結束后，密度可達到18左右。

如果用1體積的BMGY，在生長階段結束后，換液時，加入1/10——1/2體積的BMMY進行誘導培養（即濃縮培養），細胞密度也可達到20以上。

通常，真正的高密度發酵只有在發酵罐里才能實現，OD600可達到40-60及以上。搖瓶很難達到那樣的密度，不過可以采取濃縮培養的方式實現高密度。

搖瓶不能像發酵罐那樣保證通氣量，但可以通過裝量來暫時替代這個指標。

17、菌種保存

用15%甘油做保護劑，-70度長期保存，-20度短期保存使用。不過要注意凍存前一定充分混勻，酵母菌體很容易沉降到EP管底部，保存效果大打折扣。

一般OD2-6的YPD過夜菌吸取300ul菌液到滅菌的ＥＰ管然后加等體積的甘油，混勻，放于－２０度．保存長的話最好放－８０度冰箱。

重組菌株傳代次數太多，確實可能存在菌株退化的現象。這在用動物細胞表達系統如CHO，NS0系統更為明顯，所以一定要保存好最原始的重組菌株，每次從中劃板，挑單克隆表達，盡量減少菌株傳代次數。不行的話再用相同的方法重新轉化篩選高表達菌株。

GS115的鑒定方法

接種GS115于5ml YPD液體培養基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養48 小時，用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點種分離純化，挑選在補充培養基生上生長而在基本培養基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。GS115的his4基因突變了，不能在組胺酸缺陷型培養基上生長，一般的YPD培養基營養豐富，什么都有了，而YNB卻只含基本氮源，GS115應該在上面不長，就是從YPD上挑菌落，在YNB和補充了HIS的平板上對應的點一下，在HIS上長而YNB上不長的是GS115，這樣能挑到純的，以防突變。

酵母知識歸納10

"用is進行胞內表達時，外源蛋白都是儲存在過氧化物酶體里嗎，一點也不會泄漏到胞漿中？

釀酒酵母和其它酵母都是這樣？ 如果我想讓表達的外源蛋白分布在胞漿中，我該怎樣做。 "

自問自答：

用is進行胞內表達時，外源蛋白是在胞漿里而不是在過氧化物酶體里，只有給外源蛋白連上定位于過氧化物酶體里的信號肽才能將蛋白定位于過氧化物酶里

如何判斷何時使用含有硫酸銨的YNB,何時用不含硫酸銨的YNB?我是用PIC9載體在GS115中表達膜蛋白.

說明書沒有看的太明白.見笑了.

謝謝

10×YNB （100ml）

13.4g的YNB（含有硫酸銨）

3.4g YNB（不含硫酸銨） 和 10 g 硫酸銨

看了畢赤酵母表達系統的說明書，還是不明白a因子信號肽＼XhoI的兩個酶切位點以及Kex2裂解位點之間的關系．我想用pPICZaA分泌表達蛋白，打算用XhoI和XbaI兩個酶切位點，說明書里講用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，但這樣會不會破壞信號肽，蛋白還能分泌表達嗎？對表達蛋白的結構有沒有影響？另外，還想請教一下如何確定是否有讀碼框移位？緊急求助，希望各位高手能幫助解答，謝謝．

用XhoI可使蛋白具有天然Ｎ端，不會破壞信號肽，這需要你在以xho1為酶切位點時，在引物上－－－補齊它之后的部分信號肽序列后－－－再直接綴上你的目的基因。而不是直接從XhoI位點就直接加入你的目的基因。你可以從相關文獻上看看其它基因的具體做法。

確定是否有讀碼框移位，是要根據畢赤酵母表達系統的說明書pPICZaA的讀碼框，結合你目的基因本身的讀碼框來推導。

點雜交法

挑取單克隆菌落 點與MM板長到菌落明顯肉眼可見，用滅菌的硝酸纖維膜貼上再讓菌落長過夜，取下膜37度烘干，后面加奶粉封閉 一抗 后封閉 加二抗 后顯影 后續同WB步驟一樣。

我發現最近以來，又有很多新手開始做畢赤酵母表達的研究了，大多數都在討論重組，電轉化，篩選等問題，其實我也是才從迷惑中走過來一年的，現在覺得這些并不是最難的問題。

難的是陽性菌得到后，發酵證實產物發酵，表達的問題，純化的問題。

但是這方面的問題和討論確不多，只做構建是不完整的，表達純化，得到一個最終的結論才有意義。

我對發酵問題感覺頭疼，我的目的產物也很少（或者說還沒有確定）， 我開始用的是5ml 的BMMY 在2.5cm口徑的大試管中發酵的，曾做過一種基因工程抗原的表達，這對于用elisa檢測是足夠的，但發酵液直接跑電泳后，用western blot 檢測，很難檢測到，用硫酸胺濃縮10倍后，跑電泳后，用western blot 檢測才能看到。 我還嘗試過用100ml的BMMY 在500ml三角瓶中誘導，結果也不理想。

我現在做的是一種蛋白酶(沒有太多的創新性，因為類似的從產品到文章，都做成了，而且有的產量和效果還不錯) 。實驗室沒有條件上發酵罐，只能用三角瓶搖，但是這樣發酵條件就很不好優化控制，產量也不知道會有多少。

酵母發酵液中有不少其它蛋白酶，所以跟底物作用，必須進行發酵液純化后才能研究酶活，菌早就OK了，就是誘導培養，純化不好，酶切了幾次，沒有明顯的正確作用證明，有幾次用的陰性對照發酵液上清也把底物降解了。耽誤了幾個月也沒有得到滿意的結果。

今天希望的結果終于出來了，用的是新發酵的上清液，也是用5ml 的BMMY 在2.5cm口徑的大試管中發酵的，sds－page電泳顯示，底物被清晰的切割成了需要的條帶了。下面想多做點，純化一些。

我決定嚴格按手冊來做：

1.首先是依據目的蛋白的特性，選擇用MM ，BMM，BMMY 做為誘導培養基。

2.要確定 MUT+ 或MUTs，然后根據不同的條件來誘導發酵，英文操作手冊上關于這兩種表型的發酵策略是很不相同的。

3.通氣一定要好，發酵體積不能超過搖瓶體積的10%，所以我決定用1L三角瓶做。

最近剛開始作Pichia酵母表達一個7ｋＤ的蛋白，遇到一些問題，請各位高手指點。

我想將我的目的蛋白放入pPICZaA，選用了EcoRI和 NotI這兩個酶切位點。這里有兩個問題請教：

１．在Kex2 和Ste13消化后，我的目的蛋白的N端就會多出兩個氨基酸，這多出的兩個氨基酸會否影響我所需蛋白的活性？

２．Parental vector的C端有myc epitope and polyhistidine, 有二十多個氨基酸，會否影響我所需蛋白的活性？因此我想去掉myc epitope ，在我的引物中人為加上六個histidine，這樣我的引物就太長了，會不會有問題。

多謝各位的參與和指點。

多出兩個氨基酸一般不會蛋白的活性，在我的總結里有，大家多看，是個寶庫啊。當然還要看你的蛋白質N斷氨基酸是否是活性關鍵位點。你可以在目的基因上游用XhoI再加上KR，避免Ste13酶切，切的更干凈，個人觀點。

59bp引物都不算太長，但是要看你的目的片斷和所用的聚合酶，如果用Pfu酶，建議你擴增的目的片斷最好在1000bp以內，如果超過1500bp，可以使用重疊延伸PCR擴出全長片斷。

想請教各位高手,我用GS115,pPICAZaA,分泌表達一個小肽,經過SDS-PAGE在相應分子量處出現了目的條帶2.7KD.不過奇怪的是,0時刻的對照也就是未更換培養基的BMGY培養中也出現了該條帶,只是沒有添加甲醇后的顏色深.我在帖子中看到"通常用BMGY和BMMY是要換液的，但也可以不用換液。培養到菌液渾濁后，直接向BMGY里加甲醇誘導就行了。換液不是必要的，適量甘油的存在有時反而會使表達量提高."這樣的話,不知道是否不添加甲醇,目的蛋白也可被表達呢?

(1)在0時刻,對照和表達的在同一位置都出現條帶,不一定是同一個蛋白,有可能宿主菌在這一位置有表達蛋白質

(2)換溶液的目的一個是為了濃縮生長的酵母菌,另一方面也是為了加入甲醇可以更好的誘導.如果更科學的話,不妨兩個方法都做一下比較

(3)一般說來,甲醇在不誘導的時候是不會表達的

(4)可以進一步做Western或Elisa驗證

首先謝謝你回復我的帖子!我能確信該位置條帶是我的目的蛋白,至于換培養基的目的我早已知道,我只是想知道在添加甲純誘導的條件下,目的基因是否有可能被表達,因為我在其它文獻中也曾經看在未開始誘導的0時刻處,也有條帶,只是不很明顯罷了,我想知道各位戰友是否在做實驗過程中出現過同樣的現象.

請教一個比較菜的問題：酵母表態時為什么先要接種YPD培養后再BMGY培養基培養24h然后再接種于BMMY，直接接種于BMMY不可以嗎？

YPD培養基是種子培養基,BMGY培養基是為了使菌體生長,提高生物量的，因為目的蛋白的表達水平與生物量的高低有很大的關系，而當表達目的蛋白時,為了使表達量盡量的高,因此較高起使生物量較為有利,此外表達目的蛋白的時候多數營養用于合成目的蛋白.因此不利于菌體自身的生長.BMMY培養基中是以甲醇為唯一碳源的，在此誘導條件下，可以誘導AOX1啟動,使位于其下游的目的基因開始表達.

關于酵母分泌表達菌株的高產篩選，如果產物具有可westernblot檢測的特性，是最為方便的了(用G418或Zecion也是不錯的辦法)。

去年表達的一個病毒囊膜糖蛋白的實驗就是采用了westernblot的篩選方法，很好。將所有的His＋轉化子，先是點對點（不實用影印法，而是用牙簽單菌落挑的，工作量很大，一定要做好編號）做好原種，鋪有NC膜（用鉛筆劃有格子）的MM（或BMMY等誘導的都可以）板誘導種平板（倒置平板，每天補甲醇，依靠甲醇揮發上升可使NC膜保持一定適度），培養約4天，揭起NC膜，洗去菌落后做westernblot檢測，顯色的有無以及深淺可以基本判斷出陽性菌 及其產量高低（如圖片），對于顯色較深的可以再做搖瓶發酵，用96孔板Elisa法精確判斷產量高低，或SDS電泳檢測。

畢赤酵母表達知識歸納11

husiyi:

你好!象你請教下下,我用的是PPIC9K(ECOR1+NOT1插入我的目的基因,設計自帶有6個HIS標簽)載體,用SAL1線形化后電轉入GS115,當時2天只長出兩個菌,挑了做表達,第3天板上又長出許多菌但比前一天的小,這是假陽性的嗎???沒敢用,仍然用第二天挑的兩個菌做篩選,在2mg/ml的G418都能生長，繼續作表達,跑SDS-PAGE發現跟未誘導的菌體比誘導后的菌體明顯有一個表達帶，大小和我的目的蛋白差不多，誘導后上清（凍干濃縮后）有一個非常弱的帶位置稍大（可能是電泳沒壓下去）．然后我擴大４倍體積又做了一次，效果并不明顯，上清條帶仍較弱（濃縮同前），上柱子后在１５０mM咪唑有個０．４７８的峰，但電泳效果仍不好，不知是上樣濃度大還是什么原因，Ｍarker都擠歪了．純化條帶仍較若（需仔細辨認才行），另外，提酵母基因組做ＰＣＲ和提ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ均沒作出，不知道該怎么辦了，望指點！！

我感覺你可能沒有篩選到陽性菌株，有幾個問題要注意：

1. 電轉化只長兩個菌（MD板？），轉化效率太低，搞不好是假陽性。想辦法優化條件提高轉化效率比較好。這個我想在所有的步驟中最重要的一步。

2. 沒明白你說的PCR是沒作出來還是陰性結果？GS115陰性對照怎樣？用的什么引物？如果你用5'AOX和3'AOX引物能擴增出2.2Kb酵母菌株本身條帶而沒有其他條帶，才說明是陰性結果。用ＭＲＮＡ做ＲＴ－ＰＣＲ鑒定陽性菌株是―舍本逐末‖的做法，我還沒聽說用這個方法鑒定陽性菌株的。

3. 沒確定目的蛋白有表達之前最好不要做純化，不然浪費時間。要是純化后看不到你的目的蛋白，分析原因比較麻煩，很難確定是本來就沒有表達，還是表達量太低沒有掛柱。

4. 單純的表達上清電泳不是鑒定目的蛋白表達的好方法，除非你的蛋白表達量超高（100mg/L？)。酵母實際上可以分泌一堆蛋白到表達上清，可以找找前面的帖子，TCA濃縮后的上清可以看到很多條帶。另外你的對照也不對，不能拿誘導后的菌體和跟未誘導的菌體比，應該用GS115菌株或者GS115轉化了pPIC9K空載體和你的陽性菌株在同樣的條件下表達，如果在相應的位置GS115沒條帶而陽性菌株有條帶才有可能是真正的表達條帶。

5. 既然你的目的蛋白加了Histag，最好用抗histag的抗體，用Western,Dot blot或ELISA鑒定表達上清。如果有自制的或公司的抗你的蛋白的單抗或者多抗也可以。個人推薦用Qiagen的抗histag單抗，雖然貴點，但性價比超好！好像4000塊左右，0.5ml，可以1：1000－1：5000稀釋。買好的抗體比浪費時間和其他試劑強。上清ELISA靈敏度在1mg/L左右，Western靈敏度更高。

6. 上柱子后在１５０mM咪唑有個０．４７８的峰，但電泳效果仍不好，這個峰很可能是酵母雜蛋白或者培養基中一些掛柱的小分子的峰。如果表達上清直接掛柱更明顯，透析后會好一些，你可以拿點GS115空菌株表達上清試試，估計也有一個峰。

胡哥，感謝您提供的載體和菌株，我已將重組載體轉到GS115中，菌落PCR得到目的條帶，挑單菌落BMGY培養24(OD600=12)小時后，離心收集菌體，加BMMY洗滌后，用BMMY調OD600=1，誘導4天，每天加甲醇至0.5%并取樣，但做SDS-PAGE電泳沒有看到目的蛋白。我又重新做，這次用BMMY調OD600=30，誘導4天，每天加甲醇至0.5%并取樣，仍然SDS-PAGE電泳沒有看到目的蛋白，能幫我分析一下原因嗎。

我又取誘導后的菌體涂在載玻片上，做免疫酶反應，在鏡下只看到個別的酵母染色，不知是何原因。請指點。

還是同樣的問題，表達上清直接電泳根本就不是鑒定蛋白表達的好方法，除非蛋白表達量很高。通常電泳都跑的比較模糊，看不清特異條帶。如果是1mg/L表達量，電泳最多上50ul，也就是0.05ug，基本上超過了考染的檢測極限。如果大于10mg/L電泳才勉強能看到條帶。很不幸，大部分的重組蛋白在普通搖瓶條件根本達不到這個表達量。很多文獻講的高表達都是指發酵條件，并且優化了表達條件的。試試TCA將0.5-1.0ml表達上清濃縮成20ul跑電泳，看能不能檢測到目的條帶。

你說的酵母免疫酶反應，我沒用過。你確定這種方法對畢赤酵母適用？不過你的表達條件有些問題。GS115轉化子一般都是Mut+，用BMMY調OD600到30已經是很高的菌體密度了，再誘導4天，表達量不會有太多提高的，估計大部分菌株還沒來得及表達目的蛋白都擠死了，空間太小，營養不足，養氣太少，代謝廢物積累的太快。

另外注意誘導表達的問題，不能超過30度，雖然酵母32度都不死，好像有時候目的蛋白表達對溫度很敏感，尤其是高溫，我一般都設定27－28度。

您試過每天添加甲醇到2%嗎?

試過，表達量第1-2天差不多，第3天后降得厲害，估計是因為甲醇累積得毒性。不過不同蛋白可能不一樣。

husiyi:

您好！我用TCA濃縮的上清跑了電泳，條帶太多了。看不清楚哪條是表達的，做的WESTERN條帶位置在30幾KD，而我的片段1257KB,按理說是48KD,同樣濃縮的空9K上清沒有條帶出現。這樣算是表達嗎？我是做的融合表達，分別用了兩個抗體做，都是這樣。搞不明白了！

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