Pichia酵母表達系統(tǒng)使用心得及蛋白酶控制

2023年12月4日發(fā)(作者：問答歌兒歌)

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Pichia酵母表達系統(tǒng)使用心得

生物通編者按：甲醇酵母表達系統(tǒng)有不少優(yōu)點，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表達系統(tǒng)最為人熟知，并廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達。雖然說酵母表達操作簡單表達量高，但是在實際操作中，并不是每個外源基因都能順利得到高表達的。不少人在操作中會遇到這樣那樣的問題，生物通編者特地收集了部分用戶在使用EasySelect Pichia Expression System這個被譽為最簡單的畢赤酵母表達的經(jīng)典試劑盒過程中的心得體會。其中Xiang Yang是來自美國喬治城大學(xué)（Georgetown University）Lombardi癌癥中心（Lombardi Cancer Center），部分用戶來自國內(nèi)。

與其他真核表達甲基酵母部分優(yōu)點

系統(tǒng)比較

1.屬于真核表達系統(tǒng)，具有一定的蛋白質(zhì)翻譯后加-

工，有利于真核蛋白的表達優(yōu)點

強效啟動子，外源基因產(chǎn)物表達量高，可以達+++

到每升數(shù)克表達產(chǎn)物的水平

3.酵母培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵等操作接近原核生物，+++

遠較真核系統(tǒng)簡單，非常適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

4.可以誘導(dǎo)表達，也可以分泌表達，便于產(chǎn)物純化。

5.可以甲醇代替IPTG作為誘導(dǎo)物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工業(yè)產(chǎn)物替代葡萄糖作為碳源，生產(chǎn)成本低

+++ +

= +

=

+

+

比較

與原核表達系統(tǒng)+ 表示優(yōu)勝于；- 表示不如；= 表示差不多

EasySelect Pichia Expression System

產(chǎn)品性能：

優(yōu)點——使用簡單，表達量高，His-tag便于純化

缺點——酵母表達蛋白有時會出現(xiàn)蛋白切割問題

全面產(chǎn)品報告及心得體會：

巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種能高效表達重組蛋白的酵母品種，一方面由于其是屬于真核生物，因此表達出來的蛋白可以進行糖基化修飾，另一方面畢赤酵母生長速度快，可以將表達的蛋白分泌到培養(yǎng)基中，方便蛋白純化。

畢赤酵母表達載體pPICZ在多克隆位點（MCR）3'端帶有his-tag和c-myc epitopes，這些tag有利于常規(guī)檢測和純化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表達，并且在表達后α-factor可以自動被切除。在進行克隆的時候，如果你選擇的是EcoRI，那么只需在目標蛋白中增加兩個氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列選用的是Zeocin抗生素作為篩選標記，而誘導(dǎo)表達的載體需要甲醇——甲醇比一般用于大腸桿菌表達誘導(dǎo)使用的IPTG便宜。

第一步——構(gòu)建載體

Xiang Yang：pPICZ系列有許多克隆位點可供選擇，同時也有三種讀碼框以便不用的用戶需要。

紅葉山莊：有關(guān)是選擇pPIC9K還是pPICZ系列？pPIC9K屬于穿梭質(zhì)粒，也可以在原核表達，而pPICZ系列比較容易操作，大腸和畢赤酵母均用 抗Zeocin篩選（PIC9K操作麻煩一點，大腸用amp抗性，而畢赤酵母先用His缺陷篩選陽性克隆，在利用G418篩選多拷貝），而且對于大小合適（30—50KD）的蛋白在產(chǎn)量上是pPIC9K無法比擬的。

leslie：要做畢赤酵母表達實驗，首先當然就要了解這個可愛的酵母了（橢圓形，肥嘟嘟的，十分可愛），她和大腸桿菌長得有較大區(qū)別（大腸桿菌是桿狀的），因此在培養(yǎng)的過程中要區(qū)別這兩種菌體，除了氣味，濃度，顏色以外，也可以取樣到顯微鏡中觀測。大家做畢赤表達的時候應(yīng)該都遇過這種情況吧，表達過程中染菌（我們實驗室曾經(jīng)污染過各種顏色形狀的細菌，那真是一段可怕的經(jīng)歷），如果在不知情的情況下繼續(xù)做下去，那可以就是浪費大把的時間了。

基本熟悉了畢赤酵母，了解了她生長的喜好（多糖偏酸環(huán)境），生長的周期等等情況后，當然更多的精力還是應(yīng)該花在表達的目的蛋白上，我的表達蛋白有些恐怖，有100KD，本來當然應(yīng)該放在大腸桿菌中表達，但是為了分泌表達（其實后來發(fā)現(xiàn)大腸桿菌pET系列分泌表達系列也不錯）和糖基化修飾（主要是這個方面，因為我的蛋白是人源的，表達出來用于酵母雙雜，因此需要有完備的糖基化修飾）。這樣我的DNA片段由于較長，所以在做克隆的時候也要非常小心，需要注意的是：①酶切位點不能出現(xiàn)在目的DNA片段中——如果片段長無法避免，可以采用平末端連接；

②雖然α-factor可以自動切除，但是在設(shè)計表達的時候，如果在N端不能出現(xiàn)任何多余的aa（比如藥物蛋白表達），需要特別留意（說明書上有詳細說明：P13）；

③有三種不同的讀碼框（對于pPICZα系列來說就是對上α-factor序列），在設(shè)計克隆的時候要反復(fù)確定自己的讀碼框是否正確，這可是致命的問題；

④無論pPICZ還是pPICZα都有TGA（終止密碼子），但是pPICZ系列沒有ATG（起始密碼子），有人認為酵母啟動子與外源基因的ATG之間的距離越短對于表達的該基因越有利；

⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入終止密碼子；

⑥Pichia的密碼子與釀酒酵母的相似，有關(guān)基因表達偏好密碼子的問題有人認為沒有必要更換，有人認為一定要換，個人認為以產(chǎn)量為主要目的的可以考慮更換基因密碼子，而如果片段過長就比較麻煩，不過有許多真核保守蛋白其實是和酵母密碼子相似的；

⑦克隆菌株需要有recA，endA，試劑盒帶有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意帶有篩選抗生素Zeocin的培養(yǎng)基要用低鹽培養(yǎng)基（NaCl減半），這主要是因為怕影響到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；

⑧測序引物可以用α-factor信號引物，也可以用5'AOX1引物；

⑨如果需要高量表達，可以考慮做克隆的時候串聯(lián)基因片段進行表達，另外也可以在轉(zhuǎn)化酵母的時候重復(fù)轉(zhuǎn)化。

⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-r-thr這樣的序列，因為這個序列是激活蛋白水解酶的作用底物，會影響表達，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x這樣的序列（x=任何氨基酸），因為這些序列容易受到容酶體的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,r這樣的氨基酸。除此之外許多高A+T含量的基因通常會由于提前終止而不能有效轉(zhuǎn)錄，也需要多加注意。

第二步就是將線性化的DNA轉(zhuǎn)化入Pichia酵母中。

Xiang Yang：EasySelect試劑盒準備了三種菌株：X33，GS115和KM71H。我傾向于選擇X33，因為這個菌株轉(zhuǎn)化率和表達量相對而言較高，如果你有電轉(zhuǎn)儀（electroporator），可以嘗試一下。如果沒有的話，EasySelect也準備了化學(xué)轉(zhuǎn)化試劑——EasyComp Transformation，但是由于轉(zhuǎn)化率的緣故，我建議使用電轉(zhuǎn)儀。

leslie：在得到了正確的序列之后就可以準備轉(zhuǎn)化畢赤酵母了，試劑盒攜帶有的是X-33，GS115和KM71H這三種畢赤酵母（另外常用的還有SMD1168），每種酵母的特點有些不盡相同（Manual上寫的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比較好，如果擔(dān)心轉(zhuǎn)化率的話可以考慮這種酵母菌，而GS115與X33一樣都是屬于MUT＋表現(xiàn)型，也就是說可以在含甲醇的培養(yǎng)基中快速生長，但是據(jù)說會對外源基因表達有影響，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培養(yǎng)基中生長緩慢，但是也有利于翻譯后加工，比如形成二硫鍵，糖基化等等，另外SMD1168則是基因組中的Pep4基因發(fā)生突變，造成蛋白水解酶活性的喪失，可以保護表達產(chǎn)物免受降解，促進表達量的提高。

一般來說，如果是胞內(nèi)表達，應(yīng)盡量用Mut－細胞，這樣得到的蛋白產(chǎn)物中醇氧化酶蛋白量較少而目的蛋白量相對較多(約占Pp總分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰膽堿酯酶B變異鏈的含量占到90%，使下游純化更易進行。而對于分泌蛋白的表達，無論是甲醇利用慢

(Mut-)還是甲醇利用快(Mut+)的細胞都可應(yīng)用，如在人血清白蛋白(HSA)(為分泌型蛋白)的表達中就看不出兩種類型的細胞之間有什么明顯差別。

所以一般手冊都會建議同時在這幾種菌株中進行轉(zhuǎn)化，這主要是因為不同的基因在不同的酵母菌中可能表達量截然不同，因此在最開始的時候建議多用幾種酵母菌實驗。

另外有個保存問題，原始酵母菌一定要保存好，因為酵母在傳代多次后會影響其轉(zhuǎn)化率和表達量，所以一方面分多管分裝保存于-80℃，另一方面如果出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化或者表達的問題，在其它方面都沒有出錯的前提下可以考慮重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。

在準備酵母菌的同時也需要準備質(zhì)粒，由于酵母菌轉(zhuǎn)化對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的要求較高，量也較大（5-10ug），因此許多時候都會用PEG大提質(zhì)粒，或者用大提試劑盒，總而言之要準備好足夠量的質(zhì)粒，并且不要忘記也要同時準備空載體以做對照。在轉(zhuǎn)化前質(zhì)粒需要進行線性化，這主要是為了增加重組率（EasySelect試劑盒表達量高的一個重要原因也就在于其原理

是將目的片段整合到載體上，大大的增加了目的片段的表達）。線性化位點個人認為也會影響到表達量，對于基因片段不大的蛋白可以考慮用幾個線性化位點同時進行轉(zhuǎn)化篩選，但是如果片段大，就有可能供選擇的機會少，而且也有可能遇上沒有合適的線性化位點的情況，這個時候也不是說不能進行表達，但是準備的質(zhì)粒就要增加10倍，另外也可以進行部分酶切（即先進行預(yù)實驗，掐定時間和酶量保證被切開的質(zhì)粒有部分是在線性化位點切開而基因片段保存完好）。

在線性化之后的質(zhì)粒就可以酒精沉淀回收了——中間步驟需要使酶失活，說明書建議是熱失活或者EDTA，個人認為前者比較好，主要是擔(dān)心EDTA對于轉(zhuǎn)化的影響，另外這三種酶失活的溫度都是65℃/20min。沉淀回收之后是離心10分鐘，用80%的酒精洗滌后風(fēng)干，這一步需要多加注意保證風(fēng)干完全，因為有實驗證明殘留的酒精對于轉(zhuǎn)化的影響頗大。

接下來就是酵母轉(zhuǎn)化了，這是令許多人頭疼的一步，也是影響實驗決定表達的關(guān)鍵步驟。轉(zhuǎn)化方法有不少，例如電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，其方法的難易程度和轉(zhuǎn)化率高低呈反向遞減的，也就是說電轉(zhuǎn)最容易，轉(zhuǎn)化率較高（但要求有電轉(zhuǎn)儀），而原生質(zhì)體最麻煩，而且效果不好（比較傳統(tǒng)），因此不建議使用，EasySelect說明書上這么建議，并且也詳細說明了電轉(zhuǎn)，化學(xué)轉(zhuǎn)化（EasyComp和LiCl）方法的過程，可以按部就班。需要注意的是：

（電轉(zhuǎn)過程）

①最好每次都從平板上挑酵母菌，用培養(yǎng)過的酵母放置時間不要超過一個星期；

②擴大培養(yǎng)的濃度一定要控制好，個人認為不需要OD600達到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，這個時候的酵母比較新鮮，轉(zhuǎn)化率比較高；

③整個感受態(tài)制作過程中一定要在冰上操作，離心最好也用冷凍離心機，這是影響轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——為了進一步保證這一點，無菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和電轉(zhuǎn)杯都要預(yù)冷；

④電轉(zhuǎn)儀需要預(yù)熱，所以準備感受態(tài)的時候就可以把電轉(zhuǎn)儀打開了，電轉(zhuǎn)后山梨醇的加入要快，曾有人做實驗證明晚一秒就會降低轉(zhuǎn)化的數(shù)量級，雖然不一定可信，但是我個人也認為這個過程要快，電轉(zhuǎn)后可以看看時間，如果時間過短（比如〈4）就可能說明雜質(zhì)較多，會影響轉(zhuǎn)化率；

⑤轉(zhuǎn)化后溫育是個增加同源重組，增加存活率的過程，需要注意不要感染了大腸桿菌，再加入培養(yǎng)基30℃搖一段時間，可以取部分涂板（不同濃度抗生素），或者也有人將菌短暫離心，棄去上清，剩余全部涂板以保證轉(zhuǎn)化率。

如果沒有電轉(zhuǎn)儀，LiCl轉(zhuǎn)化是一種可供選擇的方法，轉(zhuǎn)化率是102到103cfu/ug。

主要過程為： 取過夜活化培養(yǎng)的菌液按1：1000接種于15ml新鮮的YPD液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至OD600達到0.8-1.0；4℃，4500rpm離心5分鐘，用8ml冰預(yù)冷的無菌水洗滌菌體，傾除洗滌液，用1mL ，4℃，4500rpm離心5分鐘，沉淀用50μl冰預(yù)冷的100mmol/L LiCl懸浮，最后定容至80-90ml。

LiCl轉(zhuǎn)化 取適量單鏈鮭精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上備用，取上述制備好的感受態(tài)細胞12 000rpm，離心15s，吸棄LiCl溶液，按順序依次加入

50%PEG 240ml

1mmol/L LiCl 36 ml

單鏈鮭精DNA 25ml

線性化質(zhì)粒DNA 10 ml (約10mg)

用吸頭反復(fù)吹打，使細胞沉淀與加入的溶液混勻，30℃靜置溫育30min，42℃熱擊20-25min，4500rpm離心10min，吸棄轉(zhuǎn)化液，細胞沉淀加1ml YPD培養(yǎng)基于30℃ 200 rpm培養(yǎng)2-4hr，取轉(zhuǎn)化混合液100ml涂布含100μg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培養(yǎng)2-3天。

第三步——挑克隆篩選

Xiang Yang：在protocol中用了許多篇

幅來指導(dǎo)這一步，包括如何去通過平板篩選，觀測生長速率來確定Mut表現(xiàn)型等。這個過程需要3到5天，而我一般只用用了4個小時進行PCR（AOX引物）篩選。

leslie：完成轉(zhuǎn)化后就是克隆鑒定的過程了，包括高拷貝篩選，PCR鑒定和表型鑒定的過程，其中我做的比較多的是PCR鑒定（因為比較快），具體過程protocol上說的很清楚，其實也很簡單，就是凍融破菌進行菌落PCR，但是其中許多具體細節(jié)問題也挺讓人頭痛的，第一就是破壁的問題，許多人用PCR方法進行鑒定都無法得到結(jié)果，甚至在表達出了以后還是無法得到這張鑒定圖片，主要原因之一就是無法正常釋放酵母基因組，一般通過培養(yǎng)菌然后進行沸水和-20℃冷凍循環(huán)過程裂解細胞在目的蛋白片段比較合適的范圍以內(nèi)是可以得到好的結(jié)果的，但是有時候片段過長，模壁就會阻礙擴增，所以我們實驗室會用蝸牛酶（很便宜的酶來的）來幫助溶菌，我看許多實驗室也會這么做，不過加入的時間不同而已，其次也有奢侈的用試劑盒的。

第二就是是模板量，個人建議模板真的不要加太多了，按照說明書的上的5ul我覺得還是多了，而且建議總體積不用這么大，當然加入模板的量也與自己培養(yǎng)菌的濃度以及用來凍融的菌數(shù)量有關(guān)。其次是假陽性和假陰性結(jié)果，在Mut-和Mut+情況是不一樣的，如果用的是5'AOX引物，KM71H會出現(xiàn)3.6kb的片段，而Mut+則會出現(xiàn)AOX1基因原本長度的片段——大約長2.2kb，因此如果的基因片段長度相似，要注意區(qū)分。建議PCR過程中使用多對引物進行反應(yīng)，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各種對照多了有利于比較——當然前提是你不能暈了頭。

掉了毛的鴕鳥：巴斯德畢赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子的轉(zhuǎn)錄終止子(5’AOX1和3’AOX1),他們被多克隆位點分開,外源基因可在此插入,此外，載體中還包含組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標記（HIS4區(qū)的整合方式為位點特異性單交換引起的基因插入，整合后使組氨酸缺陷型宿主（his4）恢復(fù)野生型.HIS4區(qū)或AOX1區(qū)位點的整合都使轉(zhuǎn)化子具有HIS4基因，因而可利用表型差異進行篩選，酵母GS115具有組氨醇脫氫酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的載體而具有HIS＋表型以篩選轉(zhuǎn)化子.）及3’AOX1區(qū),當整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌感受態(tài)細胞時,他的5’AOX1和3’AOX1能與染色體上的同源基因重組,從而使整個載體和外源基因插入到受體菌染色體上，在加入甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基中,外源基因在5’AOX1啟動子的控制下表達.在載體中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子,轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與抗G418的能力有關(guān),通過篩選抗G418能力強的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子.外源基因是以同源重組的方式插入到酵母菌的染色體中,因此不易丟失，多次傳代后酵母仍能穩(wěn)定表達外源蛋白，具有良好的遺傳穩(wěn)定性.

第四步——表達

Xiang Yang：將你的克隆在YPD培養(yǎng)基中培育到OD600值達到6.0，就可以離心收菌。用表達培養(yǎng)基（比如BMMY）重懸沉淀，在30oC培育過夜。

leslie：篩選鑒定出自己的重組子可以說什么都不能證明，還是要看這一步的酵母表達，有許多人在酵母表達上花費了大量的時間——不同于大腸桿菌的兩天出結(jié)果，一次畢赤酵母的表達就需要起碼一周的時間，篩選了上百上千的克隆，但是仍然是竹籃打水一場空，我個人建議如果在篩選完3批以上就可以放棄這一批轉(zhuǎn)化的酵母菌，另外調(diào)整進行重新轉(zhuǎn)化。

另外剛開始的時候可以用小量表達，可以用5ml：生長慢型，生長快型，陰性對照（空質(zhì)粒），陽性對照（可以是曾經(jīng)表達成功的重組子）和沒有進行轉(zhuǎn)化的酵母菌的單克隆，BMGY中培養(yǎng)到OD值2-6，離心收菌（如果怕污染或者麻煩，可以放置酵母菌一段時間，一半為20-30分鐘，讓菌沉淀下來，小心傾倒去上清培養(yǎng)基獲得菌），轉(zhuǎn)入BMMY中誘導(dǎo)表達，這些步驟都需要在超凈工作臺里進行，如果要區(qū)分是否染菌，可以取一些到顯微鏡下觀察，或者聞氣味（酸甜的是酵母），觀顏色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表達，有可能會在沒有達到4天的時間培養(yǎng)基就，所以可以適當補充一些，以及在搖床里放置盛有無菌水的深口瓶，來保持搖床里濕度。

誘導(dǎo)物甲醇注意要在超凈臺中打開，可以分裝到滅過菌的瓶子中——當然甲醇是不能滅菌的，而且也要注意在用酒精燈過甲醇瓶口的時候要小心，如果真的引起爆炸那可就損失大了。另外如果覺得每天添加甲醇麻煩，也有人用一次性注射器透過紗布添加甲醇，這個方法可能會造成染菌，慎選。說到紗布就想到了通氣性問題，酵母在無氧和有氧的情況下都可以存活，但是在甲醇誘導(dǎo)的情況下畢赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧氣量對于這一基因的表達影響重大，但是由于害怕感染大腸桿菌，紗布裹的也不能太少，最好專辟出一個搖床進行三十度酵母表達，這樣可以考慮將紗布減少到3—5層，同時需要注意的是搖瓶內(nèi)菌液體積不要超過10-30%。

每天取樣出來進行SDS-PAGE電泳鑒定，能這樣最好，不過每天做膠跑膠染色真的很麻煩，可以匯集一批同時跑，不過樣品一定要煮過凍存，而且每次取樣不要反復(fù)凍融，最好分裝保存——因為蛋白經(jīng)煮沸變性會不穩(wěn)定，容易降解。另外為了防止蛋白在分泌出來的過程就降解了（特別是小分子蛋白），也可以通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值抑制蛋白水解酶的活性（這一方面說明書講解得詳細），還可以加入酪蛋白氨基酸等保護物質(zhì)，競爭性抑制蛋白水解酶的活性來防止表達產(chǎn)物降解。

如果使用的是分泌型培養(yǎng)基，按道理收集培養(yǎng)基上清就可以進行下一步分析了，但是由于培養(yǎng)基中的蛋白濃度PAGE膠一般是檢測不出來的——除非你的表達蛋白量非常大。所以需要進行濃縮，方法有TCA法，硫酸氨鹽析，PEG沉淀，透析，超濾等等，當然最簡單的就是煮沸蒸發(fā)水分濃縮了。另外跑膠的時候同時對照酵母胞內(nèi)蛋白，以防沒有分泌出來。SDS-PAGE的配置參見分子克隆，注意你的蛋白大小與膠的濃度的對應(yīng)性，如果小到20kD以下，可以考慮用tricine膠，不過是個需要全盤重新準備的過程，要考慮清楚。如果選用

的載體是帶有信號肽的，雖說是分泌表達好純化，但實際上畢赤酵母本身還是有本底表達的，而且有時候會造成假陽性，所以最后表達過程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具體的細節(jié)可見Western Blotting前傳：想成為高手嗎？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白沒有合適抗體（如果是利用從大腸表達出來的蛋白做出的抗體也有可能與用真核系統(tǒng)表達出來的蛋白無法發(fā)生免疫作用），可以選用anti-myc或者anti-his的，前提當然是你的蛋白沒有提前終止。

其它在表達中可能出現(xiàn)的情況包括表達量低，沒有分泌表達（針對pPICZa系列），頭兩天蛋白量較大，無法重復(fù)，表達出來的蛋白偏大等等，需要分各個方面分析原因，比如蛋白明明加上了信號肽，但是就是無法分泌出來，這可能是蛋白結(jié)構(gòu)在通過細胞膜的時候受到了阻礙，可能需要重新轉(zhuǎn)化，更換線性化位點或者更換菌株；如果蛋白表達第一天較高，但是之后越來越少，這很有可能是蛋白降解了或者產(chǎn)生了競爭表達；畢赤酵母無法重復(fù)的問題比較嚴重，許多情況下在第一次獲得了高量表達之后就再怎么也重復(fù)不了這個結(jié)果，遇到這種情況真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索條件還能怎么樣呢？而表達出來的蛋白分子量偏大則是個正常現(xiàn)象，除了糖基化以外還有其它原因，比如二聚體，這些需要進行WB或進一步實驗驗證。

第五步——發(fā)酵和產(chǎn)物純化

Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），經(jīng)過簡單的純化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一個大小為45kDa，可以通過二硫鍵形成反向平行二聚體（antiparallel homodimer）的糖蛋白，經(jīng)過純化，我通過一個細胞增殖實驗（cell proliferation

assay）檢測了其活性，結(jié)果表明表達出來的蛋白在體外有完全的活性。并且我也在體外利用受體分析了蛋白結(jié)合活性，與對照（通過大腸桿菌和Bacular細胞未帶tag的蛋白）相比，his-tag有一點副作用。

伊可麗：由于在搖瓶培養(yǎng)中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發(fā)酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養(yǎng)中，培養(yǎng)液的pH值無法控制，培養(yǎng)物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發(fā)酵罐培養(yǎng)條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養(yǎng)條件，使其產(chǎn)物的表達量與預(yù)期的發(fā)酵罐培養(yǎng)結(jié)果相近。

總而言之，EasySelect系統(tǒng)是一個便于操作的酵母表達系統(tǒng)，我已經(jīng)使用這一系統(tǒng)表達過15個類似物了，每一個我都獲得了超過1mg/1升培養(yǎng)液的純化蛋白。（生物通：亞歷）

.2 巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解機理及其控制策略

1.2.1 巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解機理

在 外源蛋白的表達過程中，宿主菌畢赤酵母的胞內(nèi)和胞外均有一定量的蛋白酶的表達，因此，不論是胞內(nèi)表達亦或是分泌表達，大多數(shù)外源蛋白均面臨著被降解的問 題，這也是影響表達量的一個重要因素，同時，還增加了純化目的蛋白的難度。近年來，蛋白酶的研究是is表達系統(tǒng)一個重點和熱點。越來越多 的蛋白酶的遺傳背景和生理生化性質(zhì)得到深入的研究[52; 53]。is能根據(jù)細胞生長環(huán)境（碳源的改變以及細胞或細胞器的脅迫）來調(diào)整自身酶系，以合成與降解不同的蛋白和細胞器，液泡是蛋白質(zhì)降 解最主要的場所[54]，另一降解場所是細胞基質(zhì)蛋白酶體中。但是，對于外源蛋白來說，其降解常在表達和分離純化的第一步，主要是由培養(yǎng)基中胞外蛋白酶， 細胞外膜結(jié)合蛋白酶（cell-bound proteas）[55]和細胞自噬或裂解釋放的胞內(nèi)蛋白酶降解的[5]。胞內(nèi)蛋白酶主要涉及降解蛋白質(zhì)前體產(chǎn)生活性蛋白；切除轉(zhuǎn)運出膜后的蛋白質(zhì)信 號肽；使調(diào)控蛋白失活；降解變異或不需要的蛋白質(zhì)；提供營養(yǎng)，前體和能量。胞外蛋白酶分泌較少，主要降解部分蛋白質(zhì)提供氨基酸和多肽等營養(yǎng)[22]。

根 據(jù)蛋白酶的分泌和作用地點，is的胞內(nèi)蛋白酶可以分為三種類別，即液泡蛋白酶（vacuolar proteas），細胞基質(zhì)蛋白酶體（the cytosolic proteosome）以及分泌途徑的蛋白酶（proteas located along the cretory pathway）[52; 56]。

表1.2 畢赤酵母液泡蛋白酶和分泌途徑蛋白酶[57]

Table 1.2 Proteas of Pichia pastoris vacuole and cretory pathway[57]

Enzyme Type Gene Zymogen form

Vacuole PrA Aspartic PEP4 Yes

PrB Serine PRB1 Yes

CpY Serine PRC1 Yes

CpS Metallo-( Zn2+) CPS1 Unknown

ApI Metallo-( Zn2+) LAP4 Yes

ApCo Metallo-(Co2+) DAP2 No

DPAP-B Serine SEC11 Unknown

Secretory pathway signal peptida Kex2 protea Serine KEX2 Yes

Kex1 carboxypeptida Serine KEX1 No

DPAP-A Serine STE13 Unknown,predict no

Yeast aspartyl protea ш Aspartic YAP3 Unknown,predict yes

巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解機理及其控制策略

酵母液泡位于基質(zhì)中，一方面是維持胞內(nèi)pH和鹽離子平衡，儲藏鹽離子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特異性的水解酶，較寬底物范圍的內(nèi)生和異源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至細胞器的一個重要場所，大約80％的蛋白在液泡中降解[57]。

在is生長和表達外源蛋白過程中，由于碳源從葡萄糖或甘油到甲醇的改變，甲醇代謝酶系 （AOX,FAD,DHAS等）和過氧化氫體逐步積累，同時，相應(yīng)的蛋白酶也產(chǎn)生了。由于細胞器脅迫的影響，過氧化氫體一部分在基質(zhì)中自噬降解，大部分過 氧化氫體轉(zhuǎn)運到液泡中得到降解[58]。

is 中位于與細胞膜結(jié)合的胞內(nèi)蛋白酶類可分為蛋白質(zhì)水解酶（內(nèi)切酶）和多肽外切酶，由蛋白酶，羧肽酶，氨肽酶類組成[53]。所有的蛋白酶都是由其蛋白酶前體 經(jīng)過酶切活化而成，按照其作用活性位點又分為4類，絲氨酸類蛋白酶、金屬蛋白酶、半胱氨酸類蛋白酶和天冬氨酸類蛋白酶。絲氨酸類蛋白酶最適pH值比較高， 又叫堿性蛋白酶，而天冬

氨酸類蛋白酶需要低的pH范圍，又叫酸性蛋白酶[22]。主要的液泡內(nèi)蛋白酶有以下幾種：蛋白酶 A（proteinaA，PrA），蛋白酶B（proteina B，PrB），羧肽酶Y（carboxypeptidas

Y，CpY），羧肽酶S（carboxypeptidas S，CpS），氨肽酶I （aminopeptidas I，ApI），氨肽酶Co（aminopeptida Co，ApCo）， 二肽氨肽酶B（Dipeptidyl aminopeptida B，DPAP-B）。蛋白酶A，分子量約42kDa，是天冬氨酸類蛋白酶，由基因PEP4表達[59]，其前體能自身催化而形成成熟的蛋白酶，并催化羧肽 酶Y前體和蛋白酶B前體形成羧肽酶Y和蛋白酶B；蛋白酶B，分子量約32kDa，絲氨酸類蛋白酶，由基因PRB1表達[60]，對基因PRB1克隆和測序 發(fā)現(xiàn)是一個很大閱讀框，編碼一個最少69 kDa的前提[60]，其前體有50％的自身催化成蛋白酶B，另一部分由蛋白酶A催化；蛋白酶A和蛋白酶B是液泡中最基本的蛋白酶，是其他蛋白質(zhì)水解酶的 激活劑。羧肽酶Y，是絲氨酸類蛋白酶，由基因 PRCl編碼, 其生物合成，液泡內(nèi)分揀和CPY的加工成熟目前研究很清楚[61-63]。PRCl基因編碼的羧肽酶Y前體包含一個N-端信號肽，一個含90個氨基酸的前 肽和一個含421個氨基酸的酶活區(qū)域[64]。羧肽酶Y前體經(jīng)過高爾基體后切除糖鏈得到一個69kDa的中間體，然后在液泡中切除前肽形成61 kDa成熟的羧肽酶Y。羧肽酶Y前體（67kDa）沒有生物活性，必須在蛋白酶B作用下或蛋白酶A與蛋白酶B共同作用才能形成成熟的羧肽酶Y。羧肽酶S， 是一個由基因CPSI編碼，依賴于金屬離子的羧肽酶，分子量73～77kDa[56].，其合成與膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)。 氨肽酶I，由基因LAP4編碼，是一個含有12個亞基分子量為640 kDa的金屬多肽[65]，氨肽酶Co是一個分子量為100kDa 的Co2+金屬多肽[66],其機理目前不清楚。二肽氨肽酶B，由基因DAP2 編碼的膜接合液泡蛋白酶，在傳遞到液泡前沒有蛋白酶活性[56; 67]。

酵母液泡中的各種蛋白酶量會隨著 發(fā)酵過程中營養(yǎng)條件的改變發(fā)生變化，如發(fā)酵過程中的饑餓脅迫、碳源改變、熱和pH變化及有毒有害產(chǎn)物的形成等。分泌到胞外的重組蛋白降解有可能是由于蛋白 酶的過表達而部分分泌到胞外所致和高密度培養(yǎng)時細胞自溶造成膜破裂而釋放出蛋白酶兩種因素引起。在Sinha的研究中發(fā)現(xiàn)當P. pastoris從甘油生長階段轉(zhuǎn)為以甲醇為碳源誘導(dǎo)表達階段時，培養(yǎng)基中的各種蛋白酶量明顯增加，遠高于一直以甘油作為碳源的實驗對照組[68]。

基質(zhì)蛋白酶體，又稱蛋白體，多蛋白酶復(fù)合體，多催化功能蛋白酶，存在于真核細胞內(nèi)，主要完成蛋白酶水解途徑的中間過程，其中 20S的蛋白酶體，位于所有真核生物的細胞核和細胞間質(zhì)中，是一個分子量為700 kDa 圓柱形顆粒，由14個不同的亞基折疊纏繞而成。26S

蛋白酶體是一個巨型蛋白酶復(fù)合物，分子量高達1700 kDa，主要降解依賴 ATP的泛醌類蛋白質(zhì)，它是由2個19S 蛋白酶體連接到20S 蛋白酶體兩端構(gòu)成[69]，它們主要負責(zé)短周期的蛋白質(zhì)的分揀和快速降解，包括某些對細胞有害的蛋白質(zhì)。液泡和蛋白酶體降解的互作是調(diào)節(jié)細胞過程的一個重 要方式，特別是對細胞脅迫的響應(yīng)方面[53; 70]。

分泌途徑的蛋白酶主要分布在高爾基體和細胞質(zhì)膜上，其功能是去處去除蛋白酶前體上的多肽[52]，主要的蛋白酶有信號肽 （Signal peptida），Kex2蛋白酶（Kex2 Endoproteas ），Kexl 羧肽酶（Kexl carboxypeptida）二肽氨肽酶A（ Dipeptidyl Aminopeptida A，

DPAP-A），酵母天冬酰胺蛋白酶III （Yeast Aspartyl Protea III，Yap3 Protea)。信號肽是一個最少包含4個亞基的完整的膜蛋白[56]。Kex2蛋白酶，由基因KEX2編碼，其功能是切除COOH-端的Lys- Arg or Arg-Arg 鍵殘基 [71]。Kexl 羧肽酶，由基因KEXl 編碼，是一個特異性的絲氨酸類蛋白酶，二肽氨肽酶A，由基因STE13編碼的膜蛋白，酵母天冬酰胺蛋白酶III，其功能是在Kex2蛋白酶的作用下，切除 受體COOH-端α因子前體[72]。

在 發(fā)酵過程中，由于高密度細胞的影響以及部分細胞的裂解，液泡中的蛋白酶常釋放到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致目的蛋白的降解。在發(fā)酵的過程中，隨著外源蛋白在培養(yǎng)基中的 濃度不斷提高，蛋白水解酶濃度也隨著升高，對外源蛋白產(chǎn)生降解作用。因此，防止蛋白水解酶的水解作用，提高外源蛋白的穩(wěn)定性，減少外源蛋白的損失，也就相 對地提高了外源蛋白的產(chǎn)量。

1.2.2 巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的降解控制策略

蛋白酶降解是酵母表達系統(tǒng)的共有一個缺陷，降解不僅能引起目的蛋白的產(chǎn)率下降，降解形成的片斷還能造成分離純化極大困難，特 別是與目的蛋白分子量大小相差很小的降解產(chǎn)物，由于它們的理化性質(zhì)接近，常規(guī)的分離方法很難將它們分離開來，導(dǎo)致產(chǎn)品收率大大下降，產(chǎn)品純度低，蛋白的比 活性降低。幾乎所有在酵母中表達的重組蛋白都或多或少地存在表達蛋白降解問題，只是程度不同而已。而表達蛋白發(fā)生降解的不同程度往往是由于發(fā)酵培養(yǎng)條件和 發(fā)酵控制方式不同所致。盡管降解程度有所不同，但引起蛋白降解的直接原因是酵母細胞自身存在的各種蛋白酶。

蛋 白質(zhì)的降解常引起目的蛋白產(chǎn)率的減少，生物活性的降低，并在分離純化過程中降解產(chǎn)物由于類似的物化或親和性質(zhì)而造成產(chǎn)物污染[5]。P. pastoris表達外源蛋白時的蛋白降解控制策略日益受到重視。為避免蛋白酶的降解，不同的策略得到應(yīng)用，如2使用蛋白酶缺陷菌

株（protea deficient strains）, 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行修飾（modification of the protein structure）,

添加蛋白酶抑制劑（addition of protea inhibitors）,改變培養(yǎng)基pH（ changing the pH of the

culture medium）以及添加在培養(yǎng)基中補加，如酪蛋白水解物（Casamino acids）、蛋白胨（yeast

peptone）等一些富含氨基酸和多肽的組分。歸納起來可以分為三種水平策略：培養(yǎng)水平(cultivation-level strategies)，細胞水平( cellular-level strategies )和蛋白質(zhì)水平策略(protein-level strategies)[5]。

1.2.2.1 培養(yǎng)水平策略

提 高分泌蛋白的穩(wěn)定性可通過改變培養(yǎng)基的pH來加以改善。P. pastoris的pH適應(yīng)范圍比較廣，可以在pH 2.8~7的范圍內(nèi)生長。不同的蛋白酶有不同的最佳pH作用范圍，選擇適當?shù)陌l(fā)酵pH可以不影響細胞的生長，但可降低蛋白酶活性，減少目的蛋白的降解。 P. pastoris在pH 3.0條件下發(fā)酵重組水蛭素比pH 5.0下的降解少[73]。pH 6.0 最適人表皮生長因子[20]和白蛋白[74]的表達，在pH 3.0 最適人胰島素樣生長因子、CD4蛋白的V1亞基表達，而咖啡豆半乳糖苷酶在pH4~5不降解，pH高或低均降解，pH 3.0最嚴重[5; 20; 75]。

低溫能影響目的蛋白的產(chǎn)量，主要是由于溫度較高時，重組蛋白不穩(wěn)定，以及死細胞釋放的蛋白酶的活性增強[76]。Li 等[77]實驗說明將培養(yǎng)溫度從30℃降低到23℃時,畢赤酵母表達鯡魚抗凍蛋白從5.3mg/L上升到18.0mg/L, 同時也發(fā)現(xiàn)活細胞率（cell viability）增加。Hong

et al.通過降低發(fā)酵溫度(從30℃降到 20℃)使表達的lacca活性增強[78]。Jahic et al.[79]應(yīng)用溫度限制流加發(fā)酵技術(shù)（a temperature-limited fed-batch technique，TLFB)獲得了更高濃度的融合蛋白，同時細胞死亡率和蛋白酶活性都降低。

通 過添加特異性蛋白酶抑制劑也可減少目的蛋白的降解[80]。Shi et al [81]利用畢赤酵母表達抗Mamestra configurata rpin單鏈抗體(scFv)時候，鑒定到存在三種蛋白酶類，即天冬氨酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及絲氨酸型蛋白酶。通過添加絲氨酸蛋白酶抑制劑， 發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液總蛋白酶活性下降53%，添加天冬氨酸蛋白酶抑制劑，總蛋白酶活性下降30%。不過，大規(guī)模表達外源蛋白時添加特異性蛋白酶抑制劑使生產(chǎn)成本大 幅度上升[81]。另外，盡管特異性蛋白酶抑制劑可提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性，但必須注意的問題是蛋白酶抑制劑與培養(yǎng)基的結(jié)合能顯著改變部分蛋白組成。例如加入 5mM EDTA到畢赤酵母發(fā)酵液培養(yǎng)時會引起一

個分子量近50 kDa的蛋白分子在發(fā)酵液中的積累，該蛋白序列與siae 和Candida

albilabs的exo-B-1,3-glucana序列很接近[5]。

在 培養(yǎng)基中補加一些富含氨基酸和多肽的組分，如酪蛋白水解物（Casamino acids）、蛋白胨（yeast peptone）、胃蛋白酶水解物等，為蛋白水解酶提供過量的底物，以減少目的蛋白的降解[75]。加入Casamino acid或YP到培養(yǎng)基中，進一步提高產(chǎn)物的穩(wěn)定性。把培養(yǎng)基中的pH從5.2增加到6.0，則可顯著提高分泌的rHSA產(chǎn)量，再加入YP又可提高其表達 的產(chǎn)量[82]。通過添加1% Casamino acids，mou epidermal growth factor (mEGF)表達量顯著提高[30]。對于是加入Casamino acid 還是加入YP，通常認為最好加入Casamino acid，因為YP的肽組成會影響產(chǎn)物的分析和提取。直接添加氨基酸也能有效防止目的蛋白被降解。Won-A Choi等[50]認為0.3M L-Arg和L-Lys能夠有效地防止目的蛋白被胞內(nèi)蛋白酶酶解。

發(fā)酵時控制一定的比生長速率，或利用連續(xù)培養(yǎng)的發(fā)酵方式。細胞比生長速率同樣可影響目的蛋白的降解。通過控制誘導(dǎo)相比生長速率為0.02–0.047h?1，即相應(yīng)的甲醇濃度為3.09 g/L時候, 畢赤酵母表達水蛭素的降解可控制到最小程度[83]。

1.2.2.2 細胞水平策略

產(chǎn) 物的穩(wěn)定性也可通過改造畢赤酵母表達宿主的蛋白酶缺陷型菌株來提高。如SMD1168(his4,pep4)、SMD1165(his4,prb1)和 SMD1163(his4,pep4,prb1)[84]。這些菌株在編碼蛋白酶A(pep4)和/或蛋白酶B(PRB1)的基因中都有斷裂，從而不能表 達這些蛋白酶，并且影響其他蛋白酶的加工與成熟[34]。這些蛋白酶缺失的菌株在insulin-like growth factor-I、ghilanten和lacca的表達中被證明是有效的[37; 85]。這主要是因為使用蛋白酶缺陷型菌株后重組蛋白的降解減少所致。不過也有很多構(gòu)建的蛋白酶缺陷型菌株表達重組蛋白效率不高，所以使用蛋白酶缺陷型的 策略要慎重考慮。另外，這些菌株活性差，生長慢且難轉(zhuǎn)化，Cereghino 和Cregg推薦只有在其他方法不能奏效時才考慮使用[84]。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)水平策略

通 過將外源蛋白和蛋白水解酶抑制劑共同表達來抑制蛋白酶活性，減少目的蛋白降解，這種策略特別對蛋白酶降解敏感的重組蛋白有效?？蓪⒛康牡鞍着c一種在畢赤酵 母中穩(wěn)定的蛋白伴侶融合表達，通過改變目的蛋白的性質(zhì)來提高穩(wěn)定性[86];也可嘗試將目的蛋白連上一

個過氧化物酶體靶向信號(peroxisomal targetingsignal, PTS)，使其被分揀轉(zhuǎn)運入過氧化物酶體貯存起來，免受蛋白酶降解，還可減少對宿主細胞的毒害作用。

總 之，為了最大限度減少蛋白質(zhì)的降解，通過將以上策略進行優(yōu)化，使用以上一種或者幾種培養(yǎng)策略可以高效的獲得目的蛋白。高效控制目的蛋白的降解還需要權(quán)衡多 方面的優(yōu)化策略，甚至包括調(diào)節(jié)溶解氧、氨、添加維生素，脂肪酸等來降低蛋白酶的活性[74; 82; 87; 88]。其目的是不僅要得到目的蛋白最大產(chǎn)率或產(chǎn)量，同時也應(yīng)獲得目的蛋白天然生物活性形式[81]。

出師表

兩漢：諸葛亮

先帝創(chuàng)業(yè)未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此誠危急存亡之秋也。然侍衛(wèi)之臣不懈于內(nèi)，忠志之士忘身于外者，蓋追先帝之殊遇，欲報之于陛下也。誠宜開張圣聽，以光先帝遺德，恢弘志士之氣，不宜妄自菲薄，引喻失義，以塞忠諫之路也。

宮中府中，俱為一體；陟罰臧否，不宜異同。若有作奸犯科及為忠善者，宜付有司論其刑賞，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使內(nèi)外異法也。

侍中、侍郎郭攸之、費祎、董允等，此皆良實，志慮忠純，是以先帝簡拔以遺陛下：愚以為宮中之事，事無大小，悉以咨之，然后施行，必能裨補闕漏，有所廣益。

將軍向?qū)櫍孕惺缇?，曉暢軍事，試用于昔日，先帝稱之曰“能”，是以眾議舉寵為督：愚以為營中之事，悉以咨之，必能使行陣和睦，優(yōu)劣得所。

親賢臣，遠小人，此先漢所以興隆也；親小人，遠賢臣，此后漢所以傾頹也。先帝在時，每與臣論此事，未嘗不嘆息痛恨于桓、靈也。侍中、尚書、長史、參軍，此悉貞良死節(jié)之臣，愿陛下親之、信之，則漢室之隆，可計日而待也。

臣本布衣，躬耕于南陽，茍全性命于亂世，不求聞達于諸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顧臣于草廬之中，咨臣以當世之事，由是感激，遂許先帝以驅(qū)馳。后值傾覆，受任于敗軍之際，奉命于危難之間，爾來二十有一年矣。

先帝知臣謹慎，故臨崩寄臣以大事也。受命以來，夙夜憂嘆，恐托付不效，以傷先帝之明；故五月渡瀘，深入不毛。今南方已定，兵甲已足，當獎率三軍，北定中原，庶竭駑鈍，攘除奸兇，興復(fù)漢室，還于舊都。此臣所以報先帝而忠陛下之職分也。至于斟酌損益，進盡忠言，則攸之、祎、允之任也。

愿陛下托臣以討賊興復(fù)之效，不效，則治臣之罪，以告先帝之靈。若無興德之言，則責(zé)攸之、祎、允等之慢，以彰其咎；陛下亦宜自謀，以咨諏善道，察納雅言，深追先帝遺詔。臣不勝受恩感激。

今當遠離，臨表涕零，不知所言。

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