細胞色素C的制備和測定實驗原理及步驟

2023年12月8日發(作者：社區志愿服務活動內容)

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實驗2 細胞色素C的制備和測定

目的要求

（1）通過細胞色素C的制備，了解制備蛋白質制品的一般原理和步驟。

（2）掌握制備細胞色素C的操作技術及含量測定方法。

原理

細胞色素是包括多種能夠傳遞電子的含鐵蛋白質總稱。它廣泛存在于各種動物、植物組織和微生物中。細胞色素是呼吸鏈中極重要的電子傳遞體，細胞色素C（Cytochrome C）只是細胞色素的一種。它主要存在于線粒體中，需氧最多的組織如心肌及酵母細胞中，細胞色素C含量豐富。

細胞色素C為含鐵卟啉的結合蛋白質，分子量約為1300，蛋白質部分由104個左右的氨基酸殘基組成。它溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可自酸性水中提取，制品可分為氧化型和還原型兩種，前者水溶液呈深紅色，后者水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱、酸、堿都比較穩定，但高濃度三氯乙酸和乙酸可使之變性，引起某些失活。

本實驗以新鮮豬心為材料，經過酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫和三氯乙酸沉淀等步驟制備細胞色素C，并測定其含量。

試劑和器材

一、材料

豬心。

二、試劑

2mol/L H2SO4溶液，1mol/L NH4OH（氨水）溶液，0.2%NaCl溶液，25%（NH4）2SO4溶液（100ml溶液中含25g（NH4）約為25℃時40%的飽和度），BaCl2試劑（稱BaCl212g2SO4，溶于100ml蒸餾水中），20%三氯乙酸（TCA）溶液，人造沸石（Na2O·Al2O3·xSiO2·yH2O）；白色顆粒，不溶于水，溶于酸。選用60—80目，聯二亞硫酸鈉（dithionite，Na2S2O4·2H2O）。

三、器材

絞肉機，電磁攪拌器，電動攪拌器，離心機。72型分光光度計，玻璃柱（2.5×30cm），500ml下口瓶，燒杯（2，000ml，1，000ml，500ml，400ml，200ml各一個），量筒，移液管，玻璃漏半，玻璃攪棒，透析紙，紗布。

操作方法

一、材料處理

新鮮或冰凍豬心，除盡脂肪、血管和韌帶，洗盡積血，切成小塊，放入絞肉機中絞碎。

二、提取

稱取心肌碎肉50g，放入100ml燒杯中，加蒸餾水100ml。用電動攪拌器攪拌，加入2mol/L H2SO4，調pH至4.0（此時溶液呈暗紫色），在室溫下攪拌提取1h。用1mol/LNH4OH調pH至6.0，停止攪拌。用數層紗布壓擠過濾，收集濾液，濾渣加入75ml蒸餾水，按上述條件重復提取1h，兩次提取液合并（為減少學時，可只提取一次，也可改過濾為離心，離心條件為3500rpm，10min。）。

三、中和

用1mol/L NH4OH將上述提取液調pH至7.2，靜置適當時間后離心（3500rpm，10min），所得紅色濾液通過人造沸石柱吸附。

四、吸附

人造沸石容易吸附細胞色素C，吸附后能被25%硫酸銨溶液洗脫下來，利用此特性將細

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