細胞色素C的制備及測定

2023年12月8日發(作者：一個紅蘋果)

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細胞色素C的制備及測定

實驗三吸附法制備細胞色素c粗品

一、 實驗目的

1．學習細胞色素c的理化性質及其生物學功能。

2.掌握細胞色素c的制備原理。

3．掌握制備細胞色素c的操作技術。二、實驗原理

細胞色素c（CYT）是呼吸鏈的重要組成部分。它是一種含有鐵卟啉基團的蛋白質。它位于線粒體呼吸鏈上的細胞色素b和細胞色素aa3之間。細胞色素c在生物氧化過程中被用來轉移電子。

細胞色素c分子中含賴氨酸較高，所以等電點偏堿，為ph10.8，分子量為12000～13000道爾頓。它易溶于水及酸性溶液，且較穩定，不易變性，組織破碎后，用酸性水溶液即能從細胞中浸提出來。細胞色素c分為氧化型和還原型兩種，因為還原型較穩定并易于保存，一般都將細胞色素c制成還原型的，氧化型細胞色素c在408nm、530nm有最大吸收峰，還原型細胞色素c的最大吸收峰為415nm、520nm和550nm，這一特性可用于細胞色素c的含量測定。

由于細胞色素c在心肌組織和酵母中含量豐富，因此常被用作分離和制備材料。以豬心為原料，采用酸溶液萃取、人工沸石吸附、硫酸銨溶液洗脫和三氯乙酸沉淀法制備細胞色素C，并測定其含量。

三、實驗材料

1.實驗設備

絞肉機；電磁攪拌器；電動攪拌器；離心機；72l型分光光度計；燒杯(2000、1000、

500m1）；量筒；移液管；玻璃漏斗和紗布；玻璃棒；透析袋

2.實驗試劑

（1） 1mh2s04溶液；1mnh40h溶液；固體硫酸銨

⑵25％硫酸銨溶液:100m1蒸餾水中含25克硫酸銨，約相當于25℃時40％的飽和度

⑶ 0.2%氯化鈉溶液：稱取0.2g氯化鈉，用蒸餾水溶解，定容至100ml

⑷10%乙酸鋇試劑：稱10克乙酸鋇,溶于100ml蒸餾水中。

（5） 20%三氯乙酸溶液 (6)人造沸石(60～80目)

一

⑺聯二亞硫酸鈉(na2s2o42h2o)

3.實驗操作

（1）細胞色素c的制備

① 材料處理：取新鮮或冷凍豬心，去除脂肪和韌帶，用水沖洗去血跡，將豬心切成小塊，放入絞肉機中研磨。② 提取：

稱取絞碎豬心肌肉500克，放人2000m1燒杯中，加蒸餾水1000ml，在電動攪拌器攪拌下以1mh2s04調ph至4.0(此時溶液呈暗紫色)，在室溫下攪拌提取2小時，在提取過程，使抽提液的ph值保持在4.0左右。在即將提取完畢，停止攪拌之前，以1mnh4oh調ph至6.0，停止攪拌。用八層普通紗布壓擠過濾，收集濾液。濾渣加入750m1蒸餾水，再按上述條件提取1小時，兩次提取液合并。③中和:

用1mnh4oh 2將上述提取液調節至pH 7（此時，一些等電點接近7.2的雜蛋白溶解度較小，并從溶液中沉淀）。靜置30~40分鐘后，過濾，所得濾液可被人工沸石吸附。④

吸附和洗脫：

每組取大約60ml過濾液，用于人造沸石容易吸附細胞色素c，吸附后能被25％的硫酸銨洗脫下來，利用此特性將細胞色素c與其它雜蛋白分開。具體操作如下：

ⅰ. 人工沸石預處理：稱取5g人工沸石，放入500m1燒杯中，加水攪拌，用澆注法除去12秒內不下沉的細顆粒。

ⅱ吸附：將樣品加入至盛人造沸石有小燒杯中，人造沸石吸附物質后逐漸由白色變為紅色，吸附后的溶液呈黃色或微紅色；

三、洗滌：吸附后，倒出溶液，取出紅色人造沸石，放入500m1燒杯中。首先使用自來水，然后輕輕攪拌并用蒸餾水清洗，直到水變清，然后使用50m10沸石，用2%NaCl溶液清洗三次，然后用蒸餾水清洗，直到水變清；

ⅳ洗脫：用25％硫酸銨溶液洗脫，輕輕攪拌，收集含有細胞色素c的紅色洗脫液，經過幾次洗脫后（每次洗脫以蓋過沸石），洗脫液紅色開始消失時，即洗脫完畢。人造沸石可再生使用。⑤鹽析：

為了進一步純化細胞色素c，向上述收集的洗脫液中添加固體硫酸銨（每100m1洗脫液添加20g固體硫酸銨，使硫酸銨溶液的飽和度達到45%），添加時攪拌，放置30分鐘

2 兩小時后，各種蛋白質從溶液中沉淀，而細胞色素C留在溶液中。用濾紙（或離心）去除雜蛋白，得到紅色透明的細胞色素C溶液。⑥ 三氯乙酸沉淀：

向所得透亮溶液加入20％三氯醋酸(2.5m1三氯醋酸／100m1細胞色素c溶液)，攪拌，細胞色素c立即沉淀出來（沉淀出來的細胞色素c屬可逆變性)，立即于3000轉／分鐘離心15分鐘(或8000rpm,5min)，收集沉淀。加入少許蒸餾水，用玻棒攪拌，使沉淀溶解。⑦透析：

將沉淀的細胞色素C溶解于少量蒸餾水中，放入透析袋中，在500m1燒杯中透析脫鹽（用電磁攪拌器攪拌），15分鐘換一次水，然后換3至4次水；檢查透析液SO4是否已去除。檢查方法：取2M1醋酸鋇溶液于試管內，加入2-3滴透析液于試管內。如果有白色沉淀，則表示S04未被去除。相反，這意味著透析已經完成。過濾透析液以獲得細胞色素C產物。（2） 含量測定

所得制品是還原型細胞色素c水溶液，在波長520nm處有最大吸收值，根據這一特性，用721型分光光度計，先作出一條標準細胞色素c濃度和對應的光密度值的標準曲線(圖1)，然后根據測得的待測樣品溶液的光密度值就可以由標準曲線的斜率求出待測樣品的含量。具體操作如下：①標準曲線的繪制：

取1ml標準品（81mg/ml），稀釋至25ml，分別取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，放入五個試管中，每管加入蒸餾水至4ml，加入少量亞硫酸氫鈉作為還原劑，在520nm處測量每管的光密度，以濃度為橫坐標，以光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。② 樣品測定

取1ml樣品，稀釋適當倍數，再加少許聯二亞硫酸鈉(約3－5mg,檢測前加入)，在波長

在520nm處測量光密度。最后，根據標準曲線的斜率計算細胞色素C的含量。

注意事項

1.盡可能去除豬心臟的韌帶、脂肪和血液堆積。

2．使用離心機之前，一定要配平。

3.透析前檢查透析袋。

4．在520nm處測得各管的光密度時，要加少許聯二亞硫酸鈉作還原劑。

三

4.實驗結果

① 請根據下列結果用計算機繪制標準曲線，以獲得方程式和斜率

②測量結果 標準od5思考問題的體積濃度

樣品0.81.00.20.40.60.1750.3330.5080.6730.848

1.本實驗采用酸溶液萃取、人工沸石吸附、硫酸銨溶液洗脫、三氯乙酸沉淀等步驟制備細胞色素并測定其含量的原理是什么？

2.影響細胞色素c得率的因素有哪些？

四

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