細胞色素C的制備及其測定及思考題答案

2023年12月8日發(作者：兩百字作文)

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細胞色素C的制備及其測定及思考題答案

一、實驗原理 1、通過細胞色素C的制備，了解制備蛋白質制品的一般原理和步驟；

2、掌握制備細胞色素C的操作技術及其含量的測定方法。

二、實驗原理：

細胞色素C的特點與實驗原理

分子量 12000～13000，蛋白質部分含104個氨基酸殘基

可溶性 易溶于水和酸性溶液，可在酸性水中提取

形態 氧化型（深紅色）、還原型（桃紅色），氧化型較穩定

穩定性 對熱、酸、堿都較穩定，三氯乙酸和乙酸可使其失活

光吸收 氧化型：408nm、530nm；還原型：415nm、520nm、550nm，光吸收法測其含量

來源 心肌組織、酵母

三、實驗器材、材料及試劑：

1、器材：搗碎機、離心機、磁力攪拌器、可見分光光度計、玻璃層析柱（2.5cm×30cm）、透析袋、紗布、廣泛PH試紙、精密PH試紙、燒杯（2000、1000、500mL）、量筒、移液管、玻璃漏斗、玻璃棒等；

2、材料：（1）新鮮豬心、（2）人造沸石（60～80目）、（3）0.25mol/L NaOH和1mol/L NaCl混合液、（4）0.2% NaCl，12%BaCl2，20%TCA，2mol/L H2SO4、（5）0.06mol/L磷酸氫二鈉、0.4mol/L氯化鈉、（6）1%BaCl2

三、實驗步驟：

1、細胞色素C的制備：

操作簡要 詳細操作

取50g心肌肉糜放入500mL燒杯中，加100mL水，磁力攪拌器攪拌，（1）提取

2mol/L H2SO4調PH到4.0（溶液暗紫色），室溫攪拌2小時。用1mol/L 在酸性條件下溶解細NH4OH調PH至6.0，停止攪拌。用四層紗布擠壓過濾，取濾液，濾渣胞色素C

稱重，于冰箱保存

（2）中和

用1mol/L NH4OH 調PH到7.2，靜置10min，過濾，濾液通過人造沸析出等電點在7.2的石柱進行吸附 溶解度小的蛋白

原理目的 （3）吸附與洗脫

用25%硫酸銨洗脫

將細胞色素C與雜蛋白分開

使沸石顆粒均勻

人造沸石預處取60g，放入500mL燒杯中，加水攪拌，用傾瀉法除去12秒內不沉理 的過細顆粒，重復6次

玻璃柱(2.5×30cm)，柱下端連接一乳膠管，用夾子夾住，柱中加入使沸石能夠均勻地裝裝柱 蒸餾水至2／3體積，保持柱垂直，然后將已處理好的人造沸石帶水到柱中，避免柱內出現裝填人柱，注意一次裝完

打開夾子，流出液的速度為1.0ml／分鐘放水(柱內沸石面上應保留上樣 一薄層水)，將提取液裝入下口瓶，通過人造沸石柱進行吸附。柱內人造沸石由白色變為紅色，流出液應為黃色或微紅色

氣泡

使沸石能夠吸附細胞色素C

吸附完畢，往柱中緩慢加入蒸餾水，再100m1 0.2％NaCl，再用蒸餾先把柱中的雜質洗脫，水洗至水清，流速控制在3mL/min，用25％硫酸銨溶液洗脫，流速大去除雜志，然后弱酸性洗脫

約2ml/分鐘，收集含有細胞色素C的紅色洗脫液，當洗脫液紅色開環境下把細胞色素C始消失時，即洗脫完畢

按45%硫酸銨濃度計算洗脫液中需加入的硫酸銨的量，稱固體硫酸（4）鹽析 銨，研成粉,小量多次加入，邊加邊攪拌，靜置30分鐘，3000r/min離心10min，收集上清，量體積

（5）三氯醋酸沉淀

洗脫

進一步提純細胞色素C

邊加20％三氯醋酸邊攪拌，細胞色素C立即沉淀出來（可逆變性)，在可逆的情況下沉淀立即于3000轉／分鐘離心15分鐘，收集沉淀。加入少許蒸餾水，用細胞色素C，進一步對玻棒攪拌，使沉淀溶解

將細胞色素C裝入透析袋，用2mL蒸餾水洗滌離心管，一并轉入透析袋，在500m1燒杯，電磁攪拌器攪拌，15分鐘換水—次，換水3～4其純化

（6）透析

次后；檢查透析外液SO42-是否已被除凈（方法：取2m1 BaCl2溶液分離和濃縮細胞色素于試管中，滴加2至3滴透析外液至試管中，若出現白色沉淀，表示C

SO42-未除凈，反之，說明透析完全）將透析液過濾，即得細胞色素C制品

2.細胞色素C含量的測定：

根據還原型細胞色素C水溶液在波長520nm處有最大光吸收這一特性，作出細胞色素C濃度和光吸收值標準曲線，然后根據所測定的光吸收值，由標準曲線的斜率來求得所測樣品的含量。具體操作如下：

(1)標準曲線的繪制

配制細胞色素C標準母液（3.24mg/mL）。按下表配制標準樣品的濃度梯度，再在各管中加入3mL的水，混勻，以0號管做空白對照，在520nm波長處測得各管的光吸收值（A520nm），如圖：

管號

CytC母液

（3.24mg/mL）(mL)

蒸餾水（mL）

CytC濃度（mg/mL）

光吸收值（A520nm）

0

0

1.00

0

1

0.05

0.95

0.162

2

0.10

0.90

0.324

0.063

3

0.20

0.80

0.648

0.101

4

0.30

0.70

0.972

0.172

5

0.40

0.60

1.296

0.212 0.000 0.025 （2）樣品測定

取純化后的細胞色素C液1mL加水3mL，混勻，測A520nm。如果光吸收值不在標準曲線范圍內（0～0.30），應用水稀釋適當倍數后，重復上步 的操作，然后換算。

五、結果計算：

實驗中測得的細胞色素C的光吸收值為：

A520nm=0.266

按照老師的計算公式(y=0.1675x)：

樣品濃度=1.588mg/mL

我得到的吸光度與濃度換算公式(y=0.166x+0.0014)：

樣品濃度=1.594mg/mL

原因：可能是所用軟件運用不同的算法造成的誤差。

細胞色素C的含量=細胞色素C的濃度×稀釋倍數×終體積

=0.266×1×5.40=1.44mg

六、思考題:

1、制備細胞色素C通常選取什么動物組織？為什么？

答：采取動物的心臟或著酵母；因為細胞色素C是呼吸鏈中極重要的電子載體，主要存在于線粒體中，動物的心臟需氧量較大，因此細胞色素C含量也較大。

2、本實驗采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫，三氯醋酸沉淀等步驟制備細胞色素及含量測定，各是根據什么原理?

答：酸溶液提取：細胞色素C易溶于水和酸性溶液；

人造沸石吸附：物理吸附，沸石的多孔結構能夠吸附溶解的細胞色素C；

硫酸銨洗脫：（未有明確答案，待詢問老師）

三氯乙酸沉淀：低濃度的三氯乙酸可使細胞色素C產生可逆變性沉淀，通過離心可將其分離，加入清水后又可復性。

3、試以細胞色素C的制備為例，總結蛋白質制備的步驟和方法。

答：步驟：從組織中初步提取→分離純化→檢測

提?。航M織研磨、細胞破碎等；

分離純化：層析、過濾、離心、洗脫、沉淀等；

檢測：吸光光度法、電泳。

4、在本次實驗中如何確定稱取一定量的沸石上柱？

答：根據玻璃柱的直徑大小以及2/3長度，計算出所需沸石的體積，再根據沸石的密度，即可算出所需沸石的重量，用天平稱取即可。

六、實驗注意事項及遇到的問題

（1）注意事項：

1）提取、中和步驟要注意調節PH。吸附、洗脫步驟應嚴格控制流速；

2）鹽析時，硫酸銨應多次少量加入，邊加邊攪拌；

3）逐滴加入硫酸銨，搖勻，盡快離心，長時間會導致細胞色素C永久變性。

（2）問題：

1）在調節PH時很難調節到所需PH，在試驗中曾經加入大量酸后沒有見精確PH試紙顯示相應的PH，用普通PH試紙則顯示過酸，當加入堿后，也沒有顯示出相應的PH，在本次實驗中，我們組調節的PH沒有達到預期的效果，沒有精確到要求，且導致肉糜的顏色較黯淡。

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