牛輪狀病毒研究進(jìn)展

2023年12月27日發(fā)(作者：雞蛋西紅柿湯面)

試驗(yàn)研究 | Experimental rearch牛輪狀病毒研究進(jìn)展劉占悝1，劉澤余2，李智杰1，郭利1（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130000）摘要：牛輪狀病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是引起幼齡牛腹瀉的主要病原體，可通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播。多表現(xiàn)為精神萎靡，食欲不振、腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀，且多數(shù)為隱性感染。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，可引起該病的暴發(fā)與流行，對(duì)牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該文綜述了輪狀病毒的流行情況、腹瀉機(jī)制、檢測(cè)方法、疫苗的研制和藥物研究等方面。關(guān)鍵詞：牛輪狀病毒；流行情況；發(fā)病機(jī)制；檢測(cè)方法；免疫預(yù)防；藥物研發(fā)中圖分類號(hào)：Ｓ８２３　　　　　　文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ｂ　　　　　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９６－３６３７．２０１９．２０．００１0?引言牛輪狀病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是危害牛養(yǎng)殖業(yè)的重要的病原之一，常造成隱性感染。患病牛和隱性感染牛可持續(xù)向體外排毒成為主要的感染源。該病可通過(guò)糞-口途徑傳播[1]，不合格的飼養(yǎng)條件和不規(guī)范的管理制度也是導(dǎo)致該病流行的主要原因之一。BRV主要引起7日齡內(nèi)的犢牛發(fā)病，發(fā)病率為50%～100%，病死率則根據(jù)是否引起產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的混合感染而變化較大。研究表明牛輪狀病毒主要感染空腸和回腸成熟的絨毛上皮細(xì)胞。輪狀病毒除感染牛外，還會(huì)感染其他哺乳動(dòng)物（如豬、羊、貓、狗等）、禽類（如雞、火雞等）及野生動(dòng)物（如鹿等）。2016年Anbalagan S[3]等從幼鹿中分離出一株A型輪狀病毒14-02218-2，此株病毒與牛輪狀病毒有關(guān)。鹿輪狀病毒多引起2～5日齡仔鹿發(fā)病，病程2～3 d呈急性經(jīng)過(guò)。[2]泛關(guān)注。后來(lái)又根據(jù)細(xì)胞的糖蛋白VP7和蛋白酶敏感蛋白

VP4 的基因型G和P區(qū)別新分離病毒的基因型，目前已經(jīng)有27個(gè)G型和35個(gè)P型[9]。據(jù)報(bào)道，全球的牛輪狀病毒流行優(yōu)勢(shì)株為G10P11，G10P5和G10P1[10]，而在國(guó)內(nèi)則以G6為優(yōu)勢(shì)流行毒株，G10只在部分地區(qū)流行[11]。3?臨床癥狀新生犢牛最易感BRV，多發(fā)生在晚秋、冬季和早春，天氣寒冷或是天氣變化較大的時(shí)間。7日齡內(nèi)的犢牛最易感，此時(shí)病畜表現(xiàn)為精神萎靡、流涎、不愿站立。到8-14日齡時(shí)，表現(xiàn)為嚴(yán)重的水樣腹瀉，尾部沾染黃色的糞便。犢牛因嚴(yán)重的腹瀉導(dǎo)致脫水，眼部凹陷、四肢無(wú)力。通常因機(jī)體抵抗力的減退導(dǎo)致繼發(fā)性的細(xì)菌感染。若不及時(shí)治療，病牛可能在腹瀉后72 h內(nèi)死亡。解剖病死犢牛，可觀察到腸壁變薄，腸內(nèi)容物呈黃色或是紅色，并可能含有脫落的腸粘膜。顯微鏡觀察，表現(xiàn)為腸絨毛萎縮，上皮細(xì)胞脫落。1?病原牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的雙股RNA病毒。1969年Mebus最早在犢牛中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒，之后澳大利亞科學(xué)家也發(fā)現(xiàn)了同類病毒，Thomas Henr Flewett使用電子顯微鏡觀察該病毒后， 根據(jù)其形態(tài)特征建議將其命名為輪狀病毒[5]。各種動(dòng)物和人的輪狀病毒的形態(tài)相同，是一種無(wú)囊膜的病毒。電鏡觀察，BRV為形似車輪的粒子，完整的病毒粒子呈二十面體，直徑約65～75 nm[6]，有短的且外緣光滑。[4]4?致病機(jī)理輪狀病毒的發(fā)病機(jī)制可以大致分為4種：①輪狀病毒感染小腸上皮細(xì)胞后[12]，可以通過(guò)胃腸屏障進(jìn)入血液循環(huán)，隨血液循環(huán)至全身的各個(gè)器官，對(duì)其他的內(nèi)臟器官造成傷害。②輪狀病毒的融合素蛋白VP4在腸道胰酶的作用下水解為對(duì)病毒入侵宿主細(xì)胞早期起重要作用的VP8和VP5。③病毒侵染小腸上皮細(xì)胞后編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白糖基化，細(xì)胞膜對(duì)鈣離子的通透性增加，導(dǎo)致腸道電解質(zhì)的平衡失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。④病毒感染初期，通過(guò)抑制宿主細(xì)胞的凋亡而逃避細(xì)胞免疫的發(fā)生，對(duì)病毒感染早期的增值起到重要的作。2?流行情況隨著對(duì)牛輪狀病毒研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原體之一[7]。為更清晰地了解該病毒，根據(jù)其中層蛋白VP6抗原特異性的差異，人為地將該病毒分為A-G 7個(gè)抗原型。7種抗原型中只有A-C型既能感染人又能感染動(dòng)物，其中A型是引起犢牛腹瀉的最主要原因之一，引起了獸醫(yī)及科研工作者的廣[8]5?實(shí)驗(yàn)室診斷牛輪狀病毒的普遍存在和隱性感染，使對(duì)該病的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)顯得非常必要，對(duì)疾病的預(yù)防控制和臨床診治起到至關(guān)重要的作用。目前檢測(cè)該病的診斷方法有多種，每種診斷方法都有其優(yōu)點(diǎn)和其不足之處。需要根據(jù)實(shí)際的情況進(jìn)行選擇，最好的方法是根據(jù)實(shí)際需要，選擇適宜的多種檢測(cè)方法配合使用，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和說(shuō)服力，為診斷和治療疾病提供更好的治療方案。在生產(chǎn)實(shí)踐中如何提高檢測(cè)的靈敏性和特異性，降低檢測(cè)成本，建立適用于基層牛場(chǎng)的病原檢測(cè)方法是疫病檢測(cè)的主要目標(biāo)。現(xiàn)對(duì)幾種常用檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹。5.1?乳膠凝集反應(yīng)（LAT）乳膠凝集反應(yīng)是以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集基金項(xiàng)目：吉林省科技廳產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目（2NY）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃：畜禽重大疫病防控于高效安全養(yǎng)殖綜合技術(shù)研發(fā)（2016YFD0500907）

作者簡(jiǎn)介：劉占悝（1996-），男，漢族，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)。通信作者：郭利。2019.20·Copyright?博看網(wǎng) . All Rights Rerved.1

Experimental rearch | 試驗(yàn)研究試驗(yàn)。其原理是用載體吸附可溶性抗原于其表面，特異性抗體與之結(jié)合后，產(chǎn)生的凝集反應(yīng)。檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是很容易在短時(shí)間內(nèi)完成，不需要昂貴的設(shè)備或熟練的人員，并且試劑具有長(zhǎng)保質(zhì)期。這些因素使得LAT適合作為牛輪狀病毒的快速篩選試驗(yàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室中高效使用，對(duì)臨床的大批量檢測(cè)起到重要的作用。靈敏度和特異性分別為87.85%和73.3%。與ELISA相比，乳膠凝集顯示出100%的敏感性和96.3%的特異性[13]。但是樣品的復(fù)雜性會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.2?酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。該方法同樣無(wú)需高昂的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，靈敏度較乳膠凝集反應(yīng)特異性更高，更加快速靈敏。可以直接檢測(cè)樣品中病毒的大致含量，反應(yīng)牛的感染情況及程度，利于該病毒的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)以及批量檢測(cè)。李云富[14]等建立了BRV抗原雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法，該方法線性好，特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確性好，可用于BRV疫苗生產(chǎn)中間品及終產(chǎn)品的抗原定量檢測(cè)。5.3?聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳是根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產(chǎn)生的不同遷移率將蛋白質(zhì)分離成若干條區(qū)帶的方法，該方法特異性強(qiáng)，還可以鑒別牛輪狀病毒的種群。該方法不需要特殊的設(shè)備及操作簡(jiǎn)單，可同時(shí)用于大量樣品的檢測(cè)。其缺點(diǎn)是輪狀病毒RNA樣品易被降解，導(dǎo)致檢測(cè)的結(jié)果不準(zhǔn)確。Choudhary P[15]（BCV）和牛逆轉(zhuǎn)錄病毒（BToV），其中B型檢測(cè)量為106 copies/mL。王梓[18]等用牛輪狀病毒NCDV株VP6基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，建立了SYBR Green熒光定量的檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)的最低量為15.39 copies/L，且特異性強(qiáng)，靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)牛輪狀病毒早期的快速檢測(cè)。李凡[19]等建立了基于恒溫隔絕PCR （insulated isothermal PCR， iiPCR）

技術(shù)，該技術(shù)主要利用熱對(duì)流原理，通過(guò)加熱容器底部的液體，產(chǎn)生上下液體之間的溫差，形成液體的循環(huán)，并持續(xù)加熱和維持循環(huán)，形成穩(wěn)定的溫度梯度。此時(shí)，通過(guò)容器的設(shè)計(jì)巧妙地控制對(duì)流時(shí)間和散熱速率，可以形成適合PCR的反應(yīng)環(huán)境。反應(yīng)只需要42 min，結(jié)果直接顯示在屏幕上，檢測(cè)限度達(dá)96.6 copies/uL。與傳統(tǒng)PCR儀相比，該技術(shù)縮短了反應(yīng)時(shí)間，儀器輕便易操作，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)程序化病原體檢測(cè)，適合基層快速診斷。6?牛輪狀病毒疫苗疫苗的免疫接種是預(yù)防BRV的主要手段，常見(jiàn)的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗穩(wěn)定性好，易于保存運(yùn)輸，生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，可避免其他外原因子的污染。近年，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，基因工程疫苗也得到快速的發(fā)展，如嵌合疫苗、轉(zhuǎn)基因疫苗和亞單位疫苗等。最初源于新德里一名治愈兒童的體內(nèi)分離的一株減毒的RV[20]。是印度自主研制的RV疫苗，即單價(jià)人-牛重配疫苗[21]。第一代輪狀病毒疫苗是恒河猴人類重組輪狀病毒四價(jià)疫苗，但由于接種疫苗后很容易在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生腸套疊，因此禁止接種。出于這個(gè)原因，科學(xué)家已經(jīng)開(kāi)發(fā)出單價(jià)和重組減毒疫苗、轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗和亞單位疫苗。世界范圍內(nèi)唯一的商品化BRV減毒疫苗（NCDV-lincoln株）已經(jīng)獲得USDA的批文[22]。目前印度血-清研究所與國(guó)家過(guò)敏研究所合作開(kāi)發(fā)了含有輪狀病毒人牛（UK）重組血清型G1、G2、G3、G4和G9的輪狀病毒五價(jià)疫苗（BRV-PV）。疫苗接受了動(dòng)物研究以及成人，幼兒和嬰兒的I期和II期研究。研究證實(shí)該疫苗安全性好，且具有良好的免疫原性[23]。Anil K[24]等在成人中對(duì)該疫苗的安全性和耐受性進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果顯示該疫苗在成人中安全并且耐受性良好。接下來(lái)在嬰幼兒人群中進(jìn)一步測(cè)試疫苗以進(jìn)一步評(píng)估。此外疫苗的研究還面臨巨大的挑戰(zhàn)。首先，疫苗的安全性是最為關(guān)鍵的問(wèn)題。不僅僅是對(duì)被免疫動(dòng)物起到保護(hù)，不發(fā)生腸套疊等安全問(wèn)題。而且還要防止被免疫動(dòng)物對(duì)外排毒所造成的一系列問(wèn)題。其次，疫苗的保護(hù)效果也是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。流行毒株的不同、季節(jié)的變化、區(qū)域的差異以及被免疫動(dòng)物的年齡、體重、的不同，都會(huì)導(dǎo)致疫苗保護(hù)效果產(chǎn)生巨大的差異。等進(jìn)行的乳膠凝集試驗(yàn)顯示25只新生羊羔和4只兒童糞便樣本呈輪狀病毒陽(yáng)性。然而，RNA-PAGE顯示只有9只羊羔糞便樣本呈陽(yáng)性。PAGE檢出率低于LAT可能原因是RNA大量降解造成的。5.4?RT-LAMP反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果不需要借助特殊的設(shè)備而清晰可見(jiàn)，檢測(cè)范圍廣泛。其特異性與靈敏度與PCR相當(dāng)，成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。此方法有望成為新的臨床檢測(cè)的手段。Xie Z[16]等建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）測(cè)定并優(yōu)化BRV的快速檢測(cè)。以BRV的新生小牛腹瀉病毒（NCDV）毒株VP6基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物組。RT-LAMP測(cè)定在63 ℃的水浴中進(jìn)行60

min，并且擴(kuò)增產(chǎn)物直接或在紫外光下可見(jiàn)。該BRV的RT-LAMP測(cè)定方法可特異性地檢測(cè)到3.32 copies的A型BRV，與其他牛病原體沒(méi)有交叉反應(yīng)。但是該方法易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果，導(dǎo)致檢測(cè)準(zhǔn)確性的降低。5.5?PCR用于BRV檢測(cè)的是RT-PCR技術(shù)，此外，還有實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)、多重PCR技術(shù)。實(shí)時(shí)PCR作為診斷工具的應(yīng)用已被廣泛接受，因?yàn)樗峁┝丝焖佟⒍亢涂煽康臏y(cè)量，檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.5 copies/reaction[1]。多重PCR可用于多種病原的同時(shí)檢測(cè)，提高效率，節(jié)省檢測(cè)的時(shí)間。Fukuda M[17]等建立了檢測(cè)牛輪狀病毒A-C型、牛冠狀病毒7?藥物研發(fā)牛輪狀病毒在全球的廣泛流行及其居高不下的患病率，使治療牛輪狀病毒藥物的研發(fā)勢(shì)在必行。根據(jù)該病的發(fā)病原因和造成的癥狀來(lái)研制治療該病的藥物。例如在調(diào)節(jié)電解質(zhì)平衡、抑制病毒的復(fù)制、調(diào)節(jié)微生物的平衡、提高感染動(dòng)物免疫力、保護(hù)腸道黏膜以及中醫(yī)的調(diào)理等方面進(jìn)行藥物的研發(fā)。一方面，通過(guò)阻斷該病發(fā)生過(guò)程中的各2

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試驗(yàn)研究 | Experimental rearch個(gè)階段來(lái)阻止該病的發(fā)生，另一個(gè)方面，通過(guò)提高動(dòng)物自身抵抗病毒的能力達(dá)到對(duì)該病的預(yù)防。如病毒需要通過(guò)內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，該途徑將病毒顆粒遞送至稱為早期內(nèi)體（EEs）的囊泡細(xì)胞器。一些病毒從EEs到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，其他病毒進(jìn)入細(xì)胞更深處。Díaz-Salinas MA等證明大多數(shù)BRV株必須流向LE，該機(jī)制顯示由甘露糖-6-磷酸受體介導(dǎo)的從高爾基復(fù)合體到LE的內(nèi)溶酶體蛋白酶的運(yùn)輸對(duì)于病毒退出囊泡隔室是必需的，并且可有效地啟動(dòng)病毒復(fù)制，這種病毒的入侵機(jī)制與病毒蛋白VP4有關(guān)[25]。[11] 陳軍，楊彪，謝金鑫．牛輪狀病毒的流行情況及預(yù)防措施[J]．養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2011（2）： 195．[12] Dhama K，R S Chauhan，M Mahendran，et al．Rotavirus

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