抑菌實(shí)驗(yàn)步驟

2024年3月6日發(fā)(作者：好習(xí)慣)

抑菌實(shí)驗(yàn)：待測(cè)菌金色葡萄球菌；枯草芽孢桿菌；大腸桿菌；綠膿桿菌

菌種活化：菌種，進(jìn)行活化，可以劃線，也可以涂布，

劃線：直接用接種環(huán)在酒精燈上燒過之后，等之冷卻，蘸取進(jìn)行劃線！

涂布：用槍頭吸取100ul的菌液涂布既可！本實(shí)驗(yàn)采用涂布法

1.金色葡萄球菌最佳生長(zhǎng)條件(過夜培養(yǎng)一般為12h)

2. 枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件（過夜培養(yǎng)）

3.綠膿桿菌最佳培養(yǎng)條件（14-17h）

培養(yǎng)基

MH（A）培養(yǎng)基( Mueller-Hinton Agar)成分：牛肉浸粉（牛肉膏） 5g；酪蛋白水解物 17.5g；淀粉 1.5g；瓊脂 12.5g

MH液體培養(yǎng)基配制方法：稱取本品36.5克，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘備用。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，瓊脂15g，NaCl 5 g，雙蒸水1000mL，pH 7.2-7.5，121℃滅菌20min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：不加瓊脂，其他同牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

菌懸液的配制

將冰箱保存的大腸桿菌移接到牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取少許菌體與裝有無菌生理鹽水的試管中，震蕩均勻，制成菌懸液。具體為用接種環(huán)挑取一環(huán)（本實(shí)驗(yàn)是吸取100uL菌懸液）于5 mL的無菌生理鹽水中，每10倍稀釋一次地逐級(jí)稀釋，取（10-8、10-9、10-10 、10-11）的濃度100μL做涂布實(shí)驗(yàn)，每個(gè)梯度平行三組，加100μL藥品溶劑（二甲基亞砜）的空白對(duì)照3個(gè)平板，完全不加任何樣品即只是LB培養(yǎng)基的完全空白對(duì)照1個(gè)平板，調(diào)整菌懸液濃度，用平板菌落法測(cè)定其菌液濃度，使其含菌體數(shù)為103 cfu/mL，即為供試菌懸液。

抑菌作用初步篩選

將滅菌固體培養(yǎng)基加熱至熔化，待冷卻至50℃時(shí)，每20ml培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中。待平板自然晾干后，分別移取0.1ml待測(cè)藥品，0.1 mL供試菌懸液，均勻涂布于加藥平板上，每個(gè)處理3次重復(fù)。(涂布30min后再倒置)另設(shè)置對(duì)照組，涂菌，以等量無菌水（溶解藥品物質(zhì)）代替藥液。上述操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。將做好的細(xì)菌平板在37℃恒溫培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù)，按照下式計(jì)算抑菌率。

抑菌率?對(duì)照菌落數(shù)?處理菌落數(shù)?100%

對(duì)照菌落數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為：平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SDE）。

菌種活化：37℃培養(yǎng)；約24H

挑取兩環(huán)于50ml 液體培養(yǎng)基上活化：先恒溫150r/min震蕩12h,再靜置培養(yǎng)8-12h。達(dá)到穩(wěn)定期后，4度保藏，備用。

生理鹽水：8.5gNaCl加入到1000ml 蒸餾水中，121度高壓蒸汽滅菌15-20min即可。