牛肉膏蛋白胨培養基 接種等

2024年3月6日發(作者：月夜古詩杜甫)

實驗一 培養基的制備

一、目的與要求

（一）學習制備培養基的基本技術。

（二）制備牛肉膏蛋白瓊脂培養基。

二、原理

牛肉膏蛋白培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌培養基，這種培養基中含有一般細菌生長繁殖所需要的最基本的營養物質，可供作繁殖之用，制作固體培養基時須加2%瓊脂，培養細菌時，應用稀酸或稀堿將PH調至中性或微堿性。牛肉膏蛋白培養基的配方：

牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，pH7.4～7.6。

三、材料與儀器

（一）試劑 牛肉膏，蛋白胨、NaCl、瓊脂、1mol/L NaOH、1mol/L HCl。

(二)其他 試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，乳膠管，彈簧夾，紗布，棉花，牛皮紙，線繩，pH試紙，電爐，臺稱。

四、操作步驟

（一）稱量 根據用量按比例依次稱取成分，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。

（二）溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，加熱，ZHU一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。

（三）調PH 用1mol/L NaOH或1mol/L HCl把PH調至所需范圍。

（四）過濾 趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗結果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。

（五）分裝 按實驗要求，可將配制的培養基分裝入試管內或三解瓶內，分裝裝置如實驗圖8所示；分裝時注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾染棉塞引起污染。

1．液體分裝 分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。

2．固體分裝 分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超過管長的1/2。分裝三解瓶，以不超過容積的1/2為宜。

3．半固體分裝 裝置以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。

（六）加棉塞 分裝完畢后，在試管口或三解瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等，以阻止外界微生物進入培養基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

（七）包扎 棉塞頭上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。

（八）保存 滅菌后的培養基放入37℃養箱中培養24小時，以檢驗滅菌的效果，無污染方可使用。

五、實驗報告

（一）結果 說明你配制培養基過程中的情況。

（二）思考題

1．培養基配制時應注意什么問題？為什么？

2．分裝培養基時為什么要使用彈簧夾？

3．培養基配好后，為什么要立即滅菌？

實驗二 消毒與滅菌

一、目的與要求

了解干熱滅菌及高壓蒸汽滅菌的操作方法。

二、原理

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白凝固變性而達到滅菌的目的，細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白凝固越快，反之含水量越小凝固越慢。因此與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160～170℃），時間長（1～2h）。高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放入一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰產生蒸汽，水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于水蒸汽不能溢出而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點升高，得到高于100℃的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

一般培養基用0.1MPa、121.1℃.

15～30min可達到徹底滅菌,滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變.

三、材料與儀器

吸管、培養皿、試管、電熱干燥箱，手提試高壓蒸汽滅鍋，牛肉膏蛋白胨培養基、蒸餾水。

四、操作步驟

（一）干熱滅菌法 適用于空的、干燥的玻璃器皿的滅菌。培養基不適用。

1．將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電熱干燥箱（注意留有一定的間隙），關好箱門。

2．接通電源，打開排氣孔，使箱內濕空氣能逸出，旋動恒溫調節器，保持加熱升溫狀態，至箱內達到100℃時關閉排氣孔。

3．當溫度升到160～170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2h。

4．切斷電源，冷卻至70℃時，打開箱門，取出滅菌物品（未降至70度以前，切勿打開箱門，否則溫度驟降導致玻璃器皿炸裂）。

（二）高壓蒸汽滅菌

1．首先將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角架相平為宜。

2．放回內層鍋，并裝入待滅菌物品（內裝培養基或小的三角瓶），不要裝得太擠，以免妨礙汽流通影響滅菌效果，三角瓶口不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋溫包口的紙而透入棉塞。加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內，再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個棉栓，使螺栓松緊一致，，勿使漏氣。

3．用電爐或其他方法加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣，待冷空氣排盡后，關上排氣閥讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，當鍋內達到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。

4．停止加熱，待壓力表的壓力降至零位時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。

注意：當壓力不為零時，不能開蓋取物否則由于壓力突然下降，容器內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染而發生污染，甚至灼傷操作者。

5．高壓滅菌鍋上的安全閥，是保障安全使用的重要機構，不得隨意調節。

五、實驗報告

（一）結果 檢杳滅菌是否徹底。

（二）思考題

1．干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么？

2．為什么干熱滅菌所需溫度要比濕熱滅菌高？

3．高壓蒸汽滅菌時，為什么要排盡鍋內的空氣？

實驗三 接種和純化

一、目的與要求

（一）掌握微生物各種接種、分離方法。

（二）掌握無菌操作的基本環節。

（三）完成一定數量的微生物接種任務。

二、原理

在自然界中，各種微生物是在互為依賴的關系下共同生活的。因此，為了取出特定的微生物進行純培養，必須把它們分離出來。將一種微生物移到另一種滅菌的培養基上稱為接種。

分離培養微生物時，要考慮微生物對外界的物理、化學等因素的影響。即選擇該類微生物最適合的培養基和培養條件。在分離、接種、培養過程中，均需嚴格的無菌操作，防止雜菌侵入，所用的器具必須經過滅菌，接種工具無論使用前后都要經過火焰滅菌，且在無菌室或無菌箱中進行。

三、材料與儀器

（一）菌種

大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、青霉菌

（二）緩沖葡萄糖肉湯培養基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯半固體培養基試管垂直；緩沖葡萄糖肉湯固體培養基試管斜面；緩沖葡萄糖肉湯固體培養基平板；察氏培養基試管斜面；察氏培養基平板。

（三）接種環、接種針、接種鉤。鑷子、酒精燈、火柴、酒精棉、試管架、漿糊、標簽紙、恒溫培養箱等。

四、操作方法

（一）接種

1．接種前的準備工作

（1）檢查接種工具。

（2）在欲接種的培養基試管或平板上貼好標簽，標上接咱的菌名、操作者、接種日期等。

（3）將培養基、接種工具和其他用品全部放在實驗臺上擺好，進行環境消毒。

2．接種方法

（1）試管接種方法

①將菌種試管與待接種的試管培養基依次排列，挾于左手的拇指與食指之間，用右手的中指與食指或食指與小指拔出棉塞并挾出。

②置試管口于酒精火焰附近；

③將接種工具垂直插入酒精火焰中燒紅，再橫過火焰三次，然后再放入有菌試管壁內，于無菌的培養基表面待其冷卻。

④用接種工具取少許菌種置于另一支試管中，按一定的接種方式把菌種接種到新的培養基上。

⑤取出接種工具，試管口和棉塞進行火焰滅菌。

⑥重新塞上棉塞。

⑦燒死接種工具上殘留余菌，把試管和接種工具放回原處。

（2）試管菌種接到平板培養基的方法

①左手持平板和試管菌種，右手松動試管試管棉塞，燒接種工具。

②右手小指與四指取下棉塞，取菌，打開平皿。

③將菌種接種到平皿上，立即蓋上平皿。

④酒精燈火焰上燒接種工具滅菌

⑤棉塞過火，重新塞上試管。

（二）分離

分離微生物的方法很多，其目的都是把混雜的微生物分離為單個細胞使其生長繁殖，形成單個菌落，以便得到純菌種。

本實驗以平板劃線法分離。

1．在無菌的條件下，分別取一接種環酵母菌和青霉菌放入盛有無無菌水的試管中，制混合菌液。

2．在近火焰處，左手拿平板稍抬皿蓋，右手持接種環蘸取一環混合液伸入皿內劃線。

（三）培養

1．將接種的細菌培養基放在32～37℃恒溫箱內培養24h后觀察。

2。將接種分離后的酵母菌和霉菌放在25～28℃的恒溫箱內，酵母菌培養48h，霉菌培養72h后觀察。

3．平板培養基置于恒溫箱內倒置培養。

五、實驗報告

（一）結果

將實驗結果填于下表：

實驗表 接種情況

菌名

培養基名稱

生長情況

接種方法

有無污染及原因

實驗表 分離情況記錄表

菌名

（二）思考題

1．為什么從事微生物實驗工作的最基本要求是無菌操作？

2．指出你所分離的平板上單個菌落分屬于哪種微生物類群，并簡述它們的菌落形態特征。

3．大腸桿菌接種于葡萄糖肉湯培養基內培養24小時后，會出現什么情況？

培養基名稱

有無單個菌落 有無污染情況

實驗四 普通光學顯微鏡的構造和使用

一、目的與要求

（一）學習普通光學顯微鏡的結構、各部分功能及使用方法。

（二）學習并掌握油鏡的原理工科使用方法。

二、原理

普通光學顯微鐿由機械裝置和光學系統2大部分構成。在光學系統中，物鐿的性能最為關鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡中配置的幾種物鐿以油鐿的放大倍數最大，與其它物鏡相比，使用較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，以增加照明亮度和提高分辨率。

三、材料與儀器

（一）菌種 金黃色葡萄球菌及枯草桿菌染色玻片標本，啤酒酵母水浸片。

（二）其他 香柏油、二甲苯、顯微鐿、擦鏡紙。

四、操作步驟

（一）顯微鏡的安置 置顯微鏡于平整的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊緣3～4cm，鐿檢時姿勢要端正。

（二）調節光源 安裝在鏡座內的光源燈可通過調節電壓以獲得適當的照明亮度，而使用反光鐿采集自然光或燈光作為照明光源時，應根據光源的強度及所用物鏡的放大倍數選用凹面或平面反光鏡度調節其角度，使視野內的光線均勻，亮度適宜。

（三）低倍鏡觀察 將標本玻片置于載物臺上，用標本夾住，移動推進器使觀察對象處在物鏡的正下方，下降10×物鏡，使其接過標本，用粗調節器（粗調螺旋）慢慢升起鏡筒，出現圖像后再用細調節器（細調螺旋）調節圖像至清晰。通過標本夾推進器慢慢移動玻片，認真觀察標本各部位，找到合適目的物，仔細觀察。

（四）高倍鏡觀察 在低倍鏡下找到合適的觀察目標并將其移至視野中心后轉動物鏡轉換器將高倍鏡移至工作位置，以聚光鏡器光圈及視野進行適當調節后微調細調節器使物象清晰，利用推進器移動標本仔細觀察并記錄。

（五）油鏡觀察 在低倍鏡或高倍鏡下找到要觀察的樣品區域后，用粗調節器將鏡筒升高約2厘米，然后在待觀察區域滴加1—2滴香柏油，將油鏡轉到工作位置，從側面注視，用粗調節器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在鏡油中并幾乎與標本相接，將聚光器升至最高位置并開足光圈，用粗調節器將鏡筒徐徐上升，直至視野中出現物象并用細調節器使其清晰為止。

（六）顯微鏡用后處理

1、上升鏡筒，取下載片。

2、用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯擦去鏡頭上殘留的油跡，然后再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。

3、用擦鏡紙清潔其他物鏡和目鏡，用綢布清潔顯微鏡的金屬部件。

4、將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將物鏡轉成“八字形”再向下旋，同時把聚光鏡降下，以免物鏡與聚光鏡發生碰撞危險。

五、實驗報告

（一）結果 分別繪出在不同物鏡下觀察到的不同的菌種的形態，同時注明放大倍數。

（二）思考題

1．油鏡與普通物鏡在使用方法上有何不同？應特別注意些什么？

2．顯微鏡中調節光線強弱的裝置有哪些？

實驗五 細菌的革蘭氏染色

一、目的要求

了解革蘭氏染色的原理，學習并掌握革蘭氏染色的方法。

二、基本原理

革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫師Gram創立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細菌的形態而且還可將所有細菌區分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現紅色。

革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料（basic dye）初染液；媒染劑（mordant）；脫色劑（decolorising agent）和復染液（counterstain）。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結晶紫（crystal

violet）。媒染劑的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力，即以某種方式幫助染料固定在細胞上，使不易脫落，碘（iodine）是常用的媒染劑。脫色劑是將被染色的細胞進行脫色，不同類型的細胞脫色反應不同，有的能被脫色，有的則不能，脫色劑常用95％的酒精（ethanol）。復染液也是一種堿性染料，其顏色不同于初染液，復染的目的是使被脫色的細胞染上不同于初染液的顏色，而未被脫色的細胞仍然保持初染的顏色，從而將細胞區分成G+和G-兩大類群，常用的復染液是番紅。

三、器材

大腸桿菌，金黃色葡萄球菌；草酸銨結晶紫，番水水溶液，碘液，95%乙醇，載玻片，顯微鏡等。

四、操作步驟

1．涂片將培養24小時的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃厚），干燥、固定。固定時通過火焰1～2次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。

2．染色

（1）初染加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。

（2）媒染滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。

（3）脫色將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20～30秒鐘，立即用水沖凈酒精。

（4）復染用番紅液染1～2分鐘，水洗。

（5）鏡檢干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。

（6）同法在一載玻片上以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌混合制片，作革蘭氏染色對比。

革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。

五、實驗報告

1．結果

在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌

2．思考題

P30 思考題1、2、4

（1）作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關鍵一步是什么？

（2）當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操作正確，結果可靠？

六、實驗總結

實驗六 酵母菌及子囊孢子的形態觀察

一、目的要求

１、觀察酵母菌的細胞形態及出芽生殖方式。

２、學習并掌握酵母菌子囊孢子的觀察方法。

二、基本原理

酵母菌是多形的、不運動的單細胞微生物，細胞核與細胞質已有明顯的分化，菌體比細菌大。繁殖方式也較復雜，無性繁殖主要是出芽生殖，僅裂殖酵母屬是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通過接合產生子囊孢子。

酵母菌的子囊孢子生成與否及其形狀，是酵母分類上的重要依據。一部分酵母菌只有當它在最適條件下，才能觀察到形成的子囊孢子，不同種屬的酵母菌，形成子囊孢子的條件不同。葡萄糖-醋酸鹽培養基特別有利于釀酒酵母子囊孢子的形成。本實驗用生長在此培養基上的釀酒酵母為材料，進行子囊孢子的觀察。

三、器材

釀酒酵母裝片；釀酒酵母；呂氏堿性美藍染液，石炭酸復紅染液，3％的酸性酒精，孔雀綠芽孢染液，麥芽汁瓊脂斜面培養基，葡萄糖-醋酸鹽培養基等；顯微鏡。

四、操作步驟

一）酵母菌的形態觀察

二）酵母菌子囊孢子的觀察

1．將釀酒酵母先移種到新鮮麥芽汁瓊脂斜面上，25℃培養24小時左右。如此活化二次后，備用。

2．用接種環取活化后的培養物，接種到葡萄糖-醋酸鹽斜面上，25℃培養二周左右。

3．用接種環挑取少許生長在葡萄糖-醋酸鹽培養基上的釀酒酵母于載玻片上，制成涂片，干燥、固定。

4．用兩種方法進行染色。一種方法是加石炭酸復紅染液于固定涂片處，在火焰上加熱5—10分鐘（不能沸騰），用酸性酒精沖洗30—60秒鐘，再用水洗去酒精，加呂氏堿性美藍染液數滴，數秒鐘后用水洗去，水干后置顯微鏡下觀察，結果孢子為赤色，菌體為青色；另一種方法是用孔雀綠芽孢染液進行染色，但無需加熱，干后置油鏡下觀察子囊孢子。

1.菌落觀察

①取啤酒酵母、假酵母菌以三點點植法接種于麥芽汁平板培養基上，置于28～30℃下培養3天，形成菌落。

②觀察菌落表面、高度、邊緣、質地和顏色等方面的特點。

2.觀察出芽生殖

①在載玻片上滴1滴蒸餾水，挑取少量啤酒酵母放入蒸餾水中，蓋好蓋玻片，制成臨時裝片（注意不要產生氣泡）。

②觀察菌體細胞的大小與出芽方式。

五、實驗報告

1、結果：

（1）繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態特征。

（2）繪圖說明你所觀察到的酵母菌子囊孢子的形態特征。

2、思考題

六、實驗總結

實驗七 酵母菌的形態觀察及死活細胞的鑒定

一、實驗目的

1.觀察酵母菌的形態特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌與細菌形態特征的區別。

2.學習鑒別死活細胞的實驗方法。

二、實驗原理

酵母菌是單細胞的真核微生物，菌體比細菌大而且不運動。酵母菌的繁殖方式分為無性繁殖和有性繁殖兩種，以無性繁殖為主。芽殖是酵母菌普遍的無性繁殖方式，少數為裂殖；有性繁殖是產生子囊和子囊孢子。本實驗是通過美藍染液水浸片和水一碘液水浸片來觀察酵母的形態和芽殖方式。

美藍是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍色，還原型無色。用美藍對酵母活細胞染色時，由于細胞的新陳代謝作用，細胞內具有較強的還原能力，能使美藍由藍色的氧化型變為無色的還原型，而對代謝作用微弱或死細胞，無此還原能力或還原能力極弱，而被美藍染成藍色或淡藍色。因此，不僅用此法可觀察酵母細胞形態，也可用來鑒別酵母菌的死細胞和活細胞。

三、試劑與器材

1.材料 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或卡爾酵母(Saccharomyces

calsbergensis)培養2天左右的麥芽汁(或豆芽汁)液體培養物。

2.試劑 0.05％和O.1％呂氏堿性美藍染色液、革蘭氏染色用的碘液。

3.器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、接種環、灑精燈等。

四、實驗內容

1.美藍浸片觀察 酵母培養→制片→染色→鏡檢→30分鐘后再鏡檢

2.水-碘浸片觀察

五、關鍵步驟及注意事項

1.染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液溢出或出現大量氣泡。

2.用鑷子取一塊蓋玻片，先將一側與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下，使其蓋在菌液

上，蓋玻片不宜平著放下，避免氣泡產生。

六、思考題

1.呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死細胞數量有何影響?試分析其原因。

2.在顯微鏡下，酵母菌有哪些突出的特征區別于一般細菌?

實驗八 微生物細胞大小測定和微生物的數量測定

一、微生物的顯微直接計數法

（一）實驗目的

掌握顯微鏡下直接計數的技能。

二、實驗原理

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。

顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof

Hausr）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。

血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數區（圖21-1），計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。

計數區邊長為1mm，則計數區的面積為l mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。

已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3

所以：1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即系數K=4×106 。

因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個小格中細胞平均數（N）×系數（K）×菌液稀釋倍數（d）

三、實驗器材

1．活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養液。

2．器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

四、實驗方法

1．視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋到10-2），以每小格的菌數可數為度。

2．取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。4．靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。

5．計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央l個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。

6．對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2—3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。

7．測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內保存。

五、實驗作業 將實驗結果填入下表中：

計數次數 每個大方格菌數

1

第一次

第二次

二、微生物細胞大小的測定

（一）實驗目的了解目鏡測微尺和鏡臺測微尺的構造和使用原理，掌握微生物細胞大小的測定方法。

（二）實驗原理

2

3

4

5

稀 釋

倍 數

試管斜面中的平均值

總菌數

微生物細胞的大小是微生物重要的形態特征之一，由于菌體很小，只能在顯微鏡下來測量。用于測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。

目鏡測微尺（圖20-1）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10

mm長度刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上(此處正好與物鏡放大的中間像重疊)來測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。

鏡臺測微尺（圖20-2）是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長l0μm（即0.0lmm），是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將鏡臺測微尺放在載物臺上，

圖 20-1目鏡測微尺

由于鏡臺測微尺與細胞標本是處于同一位置，都要經過物鏡和目鏡的兩次放大成象進入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數就是細胞的真實大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數下測量微生物大小。

（三）、實驗器材

1．活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)斜面菌種、枯草桿菌(Baccillus subtilis)染色標本片。

2．器材：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、蓋玻片、載玻片、滴管、雙層瓶、擦鏡紙。

（四）、實驗方法

1．目鏡測微尺的校正 把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野

中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重疊，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度(圖20-3)，計數兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數和鏡臺測微尺的格數。因為鏡臺測微尺的刻度每格長l0μm，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的長度。

例如目鏡測微尺5小格正好與鏡臺測微尺5小格重疊，已知鏡臺測微尺每小格為l0μm，則目鏡測微尺上每小格長度為=5×10μm/5＝10μm

用同法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。

由于不同顯微鏡及附件的放大倍數不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進行，而且只能在特定的情況下重復使用，當更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。

2．細胞大小的測定

(1)將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液（10-2）

(2)取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。

(3)移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計到小數點后一位數）。測出的格數乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標本片上測定10—20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。而且一般是用對數生長期的菌體進行測定。

（4）同法用油鏡測定枯草桿菌染色標本的長和寬。

（五）、實驗作業：

將實驗結果填入下列表格

表20-1 目鏡測微目尺校正結果

物鏡 目尺格數 臺尺格數 目尺校正值（μm）

10×

40×

100×

表20-2 酵母菌大小測定記錄 （格）

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值

長

寬

表20-3 枯草桿菌大小測定記錄 （格）

細胞數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值

長

寬

結果計算 長μm＝平均格數×校正值

寬μm＝平均格數×校正值

大小表示：寬μm×長μm

六、實驗總結

實驗九 土壤中微生物分離純化培養

一、實驗目的

掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固體培養基和液體培養基中的生長特征；進一步熟練和掌握微生物無菌操作技術；掌握微生物培養方法。

二、實驗原理

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋涂布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法 稀釋涂布平板法步驟：倒平板－制備土壤污水稀釋液－涂布－培養－挑菌落；平板劃線法步驟：倒平板－標記培養基名稱－劃線。

三、試劑與器材

1.器材 盛9m1無菌水的試管、盛90m1無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環、酒精燈、無菌培養皿、顯微鏡、血細胞計數板等。

2.試劑 牛肉膏蛋白胨培養基，高氏1號培養基，查氏培養基

四、實驗內容

1.土壤稀釋液的制備

2.微生物分離純化：稀釋涂平板法，平皿劃線分離法，微生物培養技術

五、關鍵步驟及注意事項

1.掌握含菌培養基的配制，嚴格控制溫度。

2.平板劃線應防止染菌，同時應注意劃線深度及密度。

六、思考題

1.如何確定平板上某單個菌落是否為純培養?請寫出實驗的主要步驟。

2.如果要分離得到極端嗜鹽細菌，在什么地方取樣品為宜?并說明理由。

實驗十 淀粉酶產生菌的篩選

一、實驗目的

1）設計淀粉酶產生菌檢出方案。

2）學習淀粉酶產生菌的篩選方法。

二、實驗用品

菌種：

黑曲霉（Pr3）；枯草桿菌(7658)；

卡爾絲酵母(2604)

其它：

察氏培養基；無菌培養皿；碘液

三、實驗原理

淀粉酶產生菌向胞外產生淀粉酶，使淀粉分解成麥芽糖。

利用淀粉遇碘變藍的特性進行檢測

四、實驗方法

? 1）配制察氏培養基

? 2）制作平板

? 3）在三個不同區域接入三種菌，進行培養

? 4）菌長好后，加入碘液，進行觀察

五、實驗結果

菌種 黑曲霉

（Pr3）

透明圈

（有無、大小）

??㏒??? ??㏒???琰 ??㏒???琰琰茞??ü 茞??ü 茞??ü

枯草桿菌(7658) 卡爾絲酵母(2604)

六、思考題

1.說明透明圈產生的原因。

2.如何判斷產淀粉能力的強弱？