植物基因工程考試總結

2024年3月9日發(作者：中國稅務師)

1、名詞解釋部分

GFP：綠色熒光蛋白基因,利用綠色熒光蛋白獨特的發光機制，可將GFP作為蛋白質標簽。

SiRNA：是一種小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAa Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶）加工而成。SiRNA是siRISC的主要成員，激發與之互補的目標mRNA的沉默。

MAR或SAR：指被限制性內切酶消化后仍與核骨架結合的DNA序列，位于染色體的端粒附近，長度一般為30bp-1000bp，通常富含AT，兩個MAR之間的染色質區域可形成大小為5kb-200kb的DNA環，構成獨立的表達結構。MAR通過對染色質結構的直接限制而起作用，使轉基因不能形成穩定的凝聚染色質結構，保證了轉錄的正常進行，使RNA酶聚合酶容易接近這種結構，從而提高了轉基因的表達效率。

BIBAC：雙元細菌人工染色體,使大片段外源DNA穩定整合到宿主細胞基因組中。

LHCP a/b or Cab：光誘導型啟動子,在葉中具有葉綠體依賴的光誘導增強特性,在根中具有組織特異的沉默子功能.

RNA interference (RNAi)：RNA干擾,與靶基因同源的雙鏈RNA誘導的特異轉錄后基因沉默現象，使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達。

Dicer酶：是RNA酶Ⅲ家族的一個成員。Dicer酶參與RNAi反應，廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動物。

RdRP：RNA合成的聚合酶，在RdRP的作用下，進入細胞內的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程，呈指數級的數量擴增。

CAT：氯霉素乙酰轉移酶基因，一種報告基因，是第1個用于檢測細胞內轉錄活性的報告基因。

IPCR：反向PCR，它的目的在于擴增一段已知序列旁側的DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。

RDA：

RT-PCR：逆轉錄PCR,是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

GUS：β-葡萄糖苷酸酶基因,其反應產物可用多種方法檢測出來。因此這個基因被廣泛應用于基因調控的研究中。

SSH：抑制性消減雜交，是一種鑒定、分離組織細胞中選擇性表達基因的技術，其原理是以抑制性多聚酶鏈反應(PCR)反應為基礎的cDNA 消減雜交技術。

DDRT：傳統mRNA差異顯示技術，根據絕大多數真核細胞mRNA 3'端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結構，因此可用含dT的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉錄成cDNA。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量，進行Southernblot或Northernblot或直接測序，從而對差異條帶鑒定分析，以便最終獲得差異表達的目的基因。

RAD：代表性差示分析，充分發揮了PCR以指數形式擴增雙鏈模板，而以線性形式擴增單鏈模板的特性，通過消減和富集，使得目的基因片段得到特異性擴增。

RdRP：RNA為模板指導RNA合成的聚合酶,在RdRP 的作用下，進入細胞內的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應過程，呈指數級的數量擴增。

T-DNA標簽：以T-DNA為標簽，通過農桿菌轉化植物，構建突變體庫，獲得大量具表型的突變體，根據插入片段和插入點的基因組序列和突變性狀進行分離檢測。是一種高通量的分離和克隆植物功能基因的方法。

NPTⅡ：編碼新霉素磷酸轉移酶,能賦予細胞抗卡那霉素的能力，這是核基因轉化中常用的一種篩選標記。

2、簡答部分

1）篩選標記基因與報告基因的比較：

篩選標記基因（Selective Marker genes）：它的基因產物能給予植物細胞產生一種抗選擇壓力，在選擇劑存在時，轉化細胞生長、發育、分化基本不受影響，而沒有轉化的細胞不能正常生長。

報告基因（reporter genes）：是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，其表達產物非常容易被鑒定。把

它的編碼序列和基因表達調節序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產物來標定目的基因的表達調控，篩選得到轉化體。它的基因產物能使植物細胞帶上一種標記，起報告和識別作用。

報告基因，必須具備幾個條件：

(1)已被克隆和全序列已測定；

(2)表達產物在受體細胞中不存在，即無背景，在被轉染的細胞中無相似的內源性表達產物；

(3)其表達產物能進行定量測定。

2）一元載體和二元載體系統的比較：

雙元載體（binary vecter）系統是指由兩個分別含TDNA和Vir區的相容性突變Ti質粒構成的雙質粒系統,又因為其T-DNA與Vir基因在兩個獨立的質粒上，通過反式激活T-DNA轉移,故稱之為反式載體（trans vecter）.

（1）一元載體系統由兩個質粒重組而成，分子量大，需要整合；二元載體不需要整合過程，

（2）Mini T-DNA具有大腸桿菌復制位子，可在大腸桿菌內復制，拷貝數高，10-100倍，本身小，便于操作。

（3）一元載體構建時操作比較困難；二元載體系統操作簡單。

（4）Mini-Ti質粒小，所以進入農桿菌容易，轉化率高。

（5）一元載體構建好后，穩定性好；二元載體穩定性差，易丟失。

（6）二元載體系統工作效率高，轉化效率高。

3）基因圖譜與物理圖譜的比較：

基因圖譜（genetic map）：用以表示基因在一個DNA分子(染色體或質粒)上相對位置、連鎖關系或物理組成(序列)的圖示。

物理圖譜：是把Ti質粒，用限制性內切酶處理以后，經瓊脂糖凝膠電泳作片段分離，就能得出有20多條大小不同的DNA酶切片段。然后這些片段進行比較分析、測定順序，再排列成完整的物理圖，也即不同酶切片段的相對位置。物理圖譜是制作Ti質粒基因圖的基礎。

4）順式作用元件與反式作用因子：

順式作用元件：是指與結構基因串聯的特定DNA序列，是轉錄因子的結合位點，它們通過與轉錄因子結合而調控基因轉錄的精確起始和轉錄效率。主要組成：啟動子，增強子，沉默子

反式作用因子：指由不同的染色體上基因編碼的、直接或間接識別或結合各種順式作用元件并參與調控基因轉錄效率的結合蛋白。也稱為轉錄因子。反式作用因子有兩個重要的功能結構域:DNA結合結構域和轉錄活化結構域,它們是其發揮轉錄調控功能的必需結構。

順式作用元件（cis-actingelement）存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，它們的作用是參與基因表達的調控，本身不編碼任何蛋白質，僅僅提供一個作用位點，要與反式作用因子相互作用而起作用。轉錄因子的作用機制有3種：轉錄因子結合RNA聚合酶II形成起始復合物，并與啟動子的TATA框元件結合啟動轉錄過程；轉錄因子可以使DNA形成環狀，將遠處的順式作用元件拉到起始部位；多個轉錄因子的組合效應決定了轉錄起始的速率。

5）啟動子：確保轉錄精確而有效地起始的DNA序列，主要包括：TATA box –25~-35 （負責轉錄起始的精確性），CAAT box和 GC box –80~-110 ( 控制轉錄起始頻率）

增強子：增強基因啟動子工作效率的順式作用序列，能夠在相對于啟動子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都發揮作用。其功能是通過結合特定的轉錄因子或影響DNA的構象而實現的。增強子作用的三個特點：1.它與啟動子的相對位置和取向無關，具有遠程效應

2.需要特定的蛋白質因子的參與3.有些（如SV40的增強子)能在幾乎所有類型細胞中發揮

作用，而大多數具有相對的組織特異性

增強子和啟動子均為表達調控的瞬時作用元件，啟動子是轉錄起始位點上游與RNA聚合酶結合的一段DNA序列，增強子是通過啟動子來增加轉錄的，他的位置不固定可以在啟動子下游或上游。

6）酵母雙雜交系統：是將待研究的兩種蛋白質的基因分別克隆到酵母表達質粒的轉錄激活因子(如GAL4等)的DNA結合結構域基因和GAL4激活結構域基因，構建成融合表達載體，從表達產物分析兩種蛋白質

相互作用的系統。

Ac-Ds雙系統法：該方法利用Ds轉座子在Ac轉座子的編碼的轉位酶作用下插入到某個基因中導致其功能失活，得到穩定的形態變異植株后，用IPCR方法擴增與Ds相鄰的植物DNA片段并用之擴增相應的基因。

酵母雙雜交系統可以根據興趣蛋白的基因序列即可篩選與其作用的目的蛋白，也可以直接獲得目的蛋白的基因序列，從而可以初步判斷目的蛋白的結構和功能。還可以檢測兩種蛋白質的瞬時作用。Ac-Ds系統則可以根據表型的突變來尋找相應的目的基因，不需要知道目標基因結構信息。

7）基因組文庫：用限制性內切酶切割細胞的整個基因組DNA，可以得到大量的基因組DNA片段并與合適的載體重組后導入宿主細胞進行克隆。這些存在于所有重組體內的基因組DNA片段的集合，即基因組文庫，它包含了該生物的所有基因。

CDNA文庫：以mRNA為模板，經反轉錄酶催化，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體常用噬菌體或質粒載體連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。

cDNA文庫具有組織細胞特異性，cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得到細胞特異表達的基因。對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組文庫所含的是帶有內含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。

3、論述題：

1、植物原生質體轉化系統的方法，優缺點和局限性。

2、外源基因在轉基因植物細胞內的表達調控

3、根據功能蛋白分離目的基因的技術路線

步驟：

一、分離純化功能蛋白

1首先從組織或細胞中把蛋白質溶解出來,與雜蛋白分離后根據蛋白質的分子量大小、溶解度、電荷、吸附性質、對配體分子的生物學親和力等進一步分離純化。方法有透析、密度梯度離心、凝膠過濾、等電點沉淀、鹽溶鹽析、等電聚焦電泳（IEF）、SDS—PAGF、離子交換層析、吸附層析、親和層析等。

二、氨基酸序列分析

策略為：1測定多肽鏈的數目

2多肽鏈、或亞基的拆分

3肽鏈氨基酸組分測定

4多肽鏈的部分斷裂（Ｅｄｍａｎ化學降解法、酶裂解法）和肽段的分離

5肽段氨基酸序列測定（Ｅｄｍａｎ化學降解法、酶解法、質譜法、氨基酸自動測序儀測序法）

6肽段在多肽中次序的決定

一般用兩種以上方法斷裂多肽，做成兩套或幾套肽段，這兩套或幾套肽段的切口是彼此錯位的

7二硫鍵位置的確定

三、基因分離

方法有：

１根據已知氨基酸序列設計簡并性ＰＣＲ引物從植物基因組中克隆出目的基因２根據氨基酸序列設計寡聚核苷酸探針篩選基因組或ｃＤＮＡ文庫

３免疫學法篩選表達文庫

ａ根據已純化蛋白制備相應的抗體

ｂ構建表達型基因文庫或ｃＤＮＡ文庫

ｃ利用抗體篩選表達文庫找出陽性克隆

4、根據mRNA分離目的基因

1 mRNA differential display PCR （ DDRT PCR ）：mRNA 差式顯示

原理：通過反轉錄與PCR擴增mRNA中特定的一小部分。用DNA序列分析膠同步分離顯示擴增產物以進行比較。首先以3端錨定引物（5-TMN- 其中T為10-20個，M為Ａ／Ｃ／Ｇ，Ｎ為Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）進行逆轉錄，之后以單鏈cDNA為模板進行PCR，3端引物即為上述錨定引物，5端引物為10-13bt的隨機引物，5端引物較短，特異性較低，能以相對較高的機率與cDNA 5端結合，從而保證每一對引物都能擴增出適當數量的DNA片段（約50-150條）。通過12個3端引物和25個5端引物的不同組合，可在95%的情況下分析15000個不同的基因，基本包括單個細胞所能表達的全部基因數。在細胞A中特異表達的基因，若引物合適就可能在A的PCR產物中出現而不在B的PCR產物中出現。用DNA變性測序膠分離擴增產物，X光片曝光后即可檢測到差別條帶，回收分析差別條帶后即可以該片段做探針篩選全長cDNA 或DNA文庫得到全長目的基因。

2 cDNA reprentational difference analysis cDNA ＲＤＡ

ｃＤＮＡ代表群差別分析

原理：將減法雜交和PCR擴增相結合，通過引物序列的選擇使得只有特異存在于檢測組中的序列能夠被指數擴增，從而達到對其進行富集的目的。

RDA是近幾年發展起來的一種對基因水平上的差異進行分離基因的方法。現在該法和DD－PCR法已成為分子生物學中進行基因差別分析的兩個重要的方法。與差示雜交和cDNA文庫突變體補償等傳統方法相比，它們具有簡便迅速的優點。

3 ｃＤＮＡ substraction cDNA 差別選擇

將對照材料的mRNA 逆轉錄成單鏈cDNA后與實驗材料的mRNA 進行雜交，去除雜交雙鏈，回收單鏈mRNA,即為試驗材料中特異表達的基因

SSH：是差減雜交與PCR結合的簡單、快速分離差異基因的方法。運用雜交動力學原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時產生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使不同

豐度的單鏈DNA得到均衡；抑制PCR則利用鏈內退火優于鏈間退火的優點，使非目的基因片段兩端反向重復序列在退火時產生類似發卡的互補結構, 無法作為模板與引物配

對，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴增，從而使目的基因得到富集、分離。

cDNA文庫差別選擇：改技術需要兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達，制備兩種不同的mRNA的提取物，其一是含有目的基因的mRNA類型的總MRNA群體，另一個是不含有目的基因mRNA的總mRNA群體，用這兩種總mRNA為探針，對有目的基因的細胞mRNA構建的克隆庫進行篩選，當使用存在目的基因的mRNA作探針時，所有包含重組體的菌落都呈陽性反應，在x光片下呈黑色斑點，而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其余的都呈陽性反應，在x光片下呈黑色斑點，比較這兩種底片并對照原平板，便可挑選出目的基因的菌落。

5、 關于基因沉默：

答：（1）轉基因沉默現象（transgene silencing）。

是指利用遺傳轉化方法導入并穩定整合進受體細胞中的完整的外源基因在當代轉化體或在其后代中表達受到抑制的現象。

（2）轉基因沉默是由DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA 分子之間的相互作用而引起的；

根據其作用機制和水平不同可分為三種：位置效應、轉錄水平的基因沉默TGS和轉錄后水平的基因沉默PTGS；

a:位置效應：插入位點的微環境影響了外源基因啟動子的活性從而導致基因沉默；

b:轉錄水平：具有重復序列的核酸序列相互作用使得啟動子甲基化或導入基因的異染色質化，導致DNA水平的基因沉默；

c:轉錄后水平：即RNA水平的基因調控。有三種作用方式：①與具有同源序列的特異的靶mRNA結合導致其降解②與特定的靶mRNA的非編碼序列結合導致其翻譯阻斷；③引起受體細胞的防御系統導致非特異性的降解

重復序列是基因沉默的普遍誘因，甲基化是基因沉默的直接原因

（3）克服基因沉默的策略：

a:轉基因密碼子優化及轉化載體的合理修飾.;

b: 在有性生殖后代中篩選單拷貝轉基因個體

c: 選擇合適轉化方法

d: 利用MAR或SAR

e: 去甲基化試劑5-氮胞苷的使用

(4)下面是RNAi導致基因沉默的過程：

a:siRNA的構建：包括化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNa III 類降解，siRNA表達載體構建，PCR制備siRNA表達框；

b:導入，磷酸鈣共沉淀法，陽離子脂質體，電擊法，顯微注射法等；

c:發揮作用：①雙鏈RNA進入細胞后，Dicer酶的作用下被裂解成siRNA；②RdRP的作用下自身擴增③SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，在蛋白質的作用下與靶mRNA結合，導致其降解，或以其為模板RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈，形成的雙鏈RNA在Dicer酶作用下產生大量的siRNA④新形成的siRNA加強了基因沉默的效果。

6、 原核基因在真核細胞中表達要進行的修飾：

答：因為原核基因和真核基因在組成及表達上存在一些差異（此處可擴充），所以要使其在真核細胞中表達要進行一些修飾：

（1）采用植物基因的表達調控體系；

（2）優先使用植物偏愛的密碼子.

（3）改變基因的GC 含量（36~45%），使之與植物基因

GC含量一致.

（4）. 注意XCG/XCC和XTA/XTT的比值。對植物而言，該比值低好。Thr, Pro, Ala和Ser密碼子第三位避免用G。

（5）翻譯起始區第4個核苷酸用G，以符合ATG GC的要求。.

（6）去除隱含的poly（A）信號。.

（7）去除隱含的RNA聚合酶II終止序列。CAN1~9AGTNNAA.

（8）清除發夾環結構。CUUCGG

（9）消除隱含的內含子剪切序列AAG GTAAGT等