抗菌脂肽制備羧甲基殼聚糖納米粒穩定混懸液及其抑菌活性

2024年3月12日發(作者：戶籍是籍貫嗎)

抗菌脂肽制備羧甲基殼聚糖納米粒穩定混懸液及其抑菌活性

李振華;孫力軍;王雅玲;王林;徐德峰;劉喚明;張永平;聶芳紅

【摘 要】The gathering problem appeared during the preparation of

carboxymethyl chitosan nanoparticles ( CCN) was solved by antibacterial

lipopeptide, and investigated the effect of it on the inhibitory activity of

carboxymethyl chitosan nanoparticles. The CCN were prepared by

emulsion-disperd with antibacterial lipopeptide ionic crosslinking

method and obrved its stability by tting it still aside, and measured its

viscosity changes by Ubbelohde viscometer, obrved its morphological

change by scanning electron microscope. The effect of different

concentration of nanoparticles on the inhibition against Streptococcus

aureus and E. coli were tested by turbidimetry. It was found that

nanoparticles which were prepared by adding antibacterial lipopeptide

were highly homogeneous and had good stability and low viscosity. It also

significantly enhanced the inhibitory effect on S. aureus and E. coli. The

results indicated that adding antibacterial lipopeptide could not only solve

the gathering phenomenon in the preparation of the CCN but also

improve its antibacterial effect.%利用抗菌脂肽解決羧甲基殼聚糖納米粒制備過

程中出現的團聚問題,并考察其對羧甲基殼聚糖納米粒的抑菌效果影響.通過抗菌脂

肽乳化分散離子交聯法制備羧甲基殼聚糖納米粒,靜置觀察其穩定性,烏氏粘度計測

定其粘度變化,掃描電鏡考察其形態改變,比濁法測定不同濃度納米粒溶液對金黃色

葡萄球菌和大腸埃希菌的抑制作用.實驗發現,加入抗菌脂肽制備的納米粒穩定性好,

粘度降低,形態均一,并能顯著增強對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑制作用.結果

表明,抗菌脂肽的加入能很好的解決納米粒制備過程中出現的團聚現象,而且其抑菌

效果也有很大改善.

【期刊名稱】《微生物學雜志》

【年(卷),期】2013(033)001

【總頁數】4頁(P4-7)

【關鍵詞】抗菌脂肽;羧甲基殼聚糖;納米粒;穩定;抑菌

【作 者】李振華;孫力軍;王雅玲;王林;徐德峰;劉喚明;張永平;聶芳紅

【作者單位】廣東省水產品加工與安全重點實驗室廣東海洋大學食品科技學院,廣

東湛江524088

【正文語種】中 文

【中圖分類】Q539

殼聚糖是一種天然多糖中唯一的陽離子堿性氨基多糖，具有抑菌活性，安全、無毒，

可生物降解，與機體之間具有良好的生物相容性［1-2］，在食品保健、生物醫藥、

生物材料等工業上有著廣泛的應用［3］。由于殼聚糖只溶于酸性溶液，大大地限

制了應用范圍。通過改性后的羧甲基殼聚糖(CMCS)可以明顯得到改善，但仍然存

在粘性大、整體分散性差等缺點，影響了其活性載體的有效性能的充分發揮。有研

究者試圖將其制備成納米級粒子來解決上述問題，取得了一定進展。目前，殼聚糖

納米粒的制備多采用離子交聯法，常用的離子交聯劑是三聚磷酸鈉，利用殼聚糖的

分子鏈上的氨基陽離子與三聚磷酸鹽的陰離子通過靜電作用發生分子間或分子內交

聯反應，從而制備出殼聚糖納米粒。但殼聚糖本身具有一定粘度，制備出的納米粒

之間又會聚集在一起，使制備出的納米粒發生團聚［4］。因此，要獲得粒徑小且

分散性好的顆粒，必須選擇恰當的分散體系，而分散體系中乳化劑的選擇起著最關

鍵的作用。納豆菌抗菌脂肽(Bacillusnatto antimicrobialpeptide，BNAP)是一類

由傳統發酵食品納豆生產菌種納豆芽胞桿菌產生的抗菌脂肽，它是一種很好的表面

活性劑，且安全無毒［5］。因此，能否將其用于解決CMCS納米粒制備過程中出

現的團聚問題，制備穩定的CMCS納米?；鞈乙?，值得進一步探索。本研究擬采

用離子交聯法將納豆菌抗菌脂肽以表面活性劑的形式乳化分散羧甲基殼聚糖，形成

均勻微囊后以三聚磷酸鈉交聯，制得抗菌脂肽羧甲基殼聚糖納米?；鞈殷w系，考察

其均一性、穩定性和抗菌性能，旨在解決CMCS納米?；鞈乙旱姆€定性問題和提

高其抗菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26003)，廣東微生物菌種保藏中心;大腸埃希

菌(AS1.487)，實驗室保藏菌種，經中國科學院微生物研究所鑒定。

1.1.2 原料 羧甲基殼聚糖(脫乙酰度≥90%)，購自浙江澳興生物科技有限公司;納豆

菌抗菌脂肽(實驗室自制)。

1.1.3 主要儀器及試劑 掃描電鏡，荷蘭PHILIPS公司;E22-H01-1C型磁力攪拌器，

上海創賽科學儀器有限公司;高速冷凍離心機3-18K，德國Sigma公司;Thermo

Multiskan MK3酶標儀;烏氏粘度計(0.6～0.7 mm);恒溫裝置。三聚磷酸鈉(TPP，

分析純)，購自廈門仁馳化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗菌脂肽羧甲基殼聚糖(BNAP-CMCS)納米粒的制備 用電子天平稱取80 mg

的CMCS，溶于40 mL蒸餾水中，加至錐形瓶中振蕩搖勻，緩慢加入10 mg/mL

的BNAP溶液8 mL，室溫下不斷攪拌30 min。再逐滴加入2.5 mg/mL的TPP

溶液6 mL，繼續攪拌30 min，對照組不加BNAP。將制得的膠體溶液進行冷凍

干燥。

1.2.2 穩定性觀察 將制成的納米粒配成0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%的溶液，

室溫下靜置1周，觀察其穩定性。

1.2.3 粘度的測定 將制備好的納米粒配置成0.1%的溶液，取25 mL于烏氏粘度計

中，置于恒溫水槽中恒溫10 min后，測定流出時間t，由此得出相對于同體積時

溶劑(流出出時間t0)的相對粘度η=t/t0，比較BNAP加入前后溶液相對粘度的變

化。

1.2.4 抑菌活性測定 向96孔板各孔中加入BNAP-CMCS納米粒溶液，加入營養

肉湯培養基二倍稀釋，使納米粒最終濃度分別為0.156、0.313、0.625、1.25、

2.50、5.00、10.00 mg/mL，無菌條件下向各樣品中加入20 μL制備好的金黃色

葡萄球菌與大腸埃希菌的菌懸液(107cfu/mL)，培養24 h后，取出96孔板，于

630 nm下測定培養液的吸光值，以空白培養基對照。

1.2.5 納米顆粒形態掃描電鏡觀察 將制備好的BNAP-CMCS納米粒子用超純水離

心洗滌3次后，超聲分散在超純水中，再滴到銅網上，室溫下干燥后，觀察制備

出的納米粒的形態［6］。

2 結果與分析

2.1 BNAP-CMCS納米粒的制備

經掃描電鏡觀察(圖1)，制備出的納米顆粒粒徑在50～100 nm之間，BNAP的加

入與否對粒徑大小變化不明顯，但對粒子的形態規則影響較大。CMCS制成納米

粒后會發生聚集，加入BNAP后制備出的納米顆粒分散性好。因為CMCS本身具

有粘性，當制備成納米粒后，由于顆粒之間的靜電作用和分子間作用力的影響又會

發生團聚，而BNAP本身亦是一種乳化劑和穩定劑，它能防止CMCS納米粒之間

的團聚，因此制備出的納米粒均一、分散性好。

圖1 納米粒掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron microscope images of

nanoparticlesa:CMCS納米粒(20 000×);b:BNAP-CMCS納米粒(20 000×)

2.2 穩定性測定

實驗發現，BNAP與CMCS制成的納米粒溶液在各濃度下均能穩定存在，不會發

生相分離現象。因為CMCS在溶液中發生解離，使大分子鏈帶負電荷，而BNAP

是一種陰離子表面活性劑，因此，溶液體系能穩定存在。

2.3 粘度的測定

經計算，CMCS相對于水的相對粘度為1.69，CMCS納米粒相對于水的相對粘度

為1.21，加入BNAP制備的納米粒相對于水的相對粘度為1.12。說明通過離子交

聯法制備出的CMCS納米粒較未制納米粒之前粘度降低，因此能制備出一定規則

的納米顆粒，但仍有部分聚集。而加入BNAP制備的納米粒其粘度更小，因為

BNAP是一種表面活性劑，加入BNAP使羧甲基殼聚糖溶液的表面能定向排列，

從而使其表面張力顯著下降，因此使溶液和表面粘度降低。

2.4 抑菌活性測定

由圖2、3可以看出，BNAP-CMCS納米粒對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的生

長均具有很好的抑制作用。對于金黃色葡萄球菌，隨著納米粒濃度的增加，到達5

mg/mL時，菌懸液的OD值明顯下降，說明BNAP-CMCS納米粒對于金黃色葡

萄球菌的最小抑菌濃度為5 mg/mL。對于大腸埃希菌，它的抑制能力也是隨著納

米粒濃度的增加而增強，最小抑菌濃度為10 mg/mL。另外，從圖2、3還可以看

出，加入BNAP制備出的納米粒較未加前的抑菌活性有明顯提高，因為加入

BNAP后體系的分散性得到很大改善，提高了CMCS的擴散能力，從而使其抑菌

性能增強。

圖2 不同納米粒濃度對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.2 Effect of different

nanoparticles concentration on the activity of

圖3 不同納米粒濃度對大腸埃希菌生長的影響Fig.3 Effect of different

nanoparticles concentration on the activity of

3 討論

離子凝膠法制備CMCS納米粒簡單易行，所使用的交聯劑三聚磷酸鈉安全、無毒，

無需使用有機溶劑，但是制備出的納米粒同樣會發生團聚現象，這也是當今納米技

術領域內的一個普遍關心、急待解決的問題。造成納米顆粒團聚的原因很多，歸納

起來主要有以下幾個方面:①顆粒細化到納米級以后，其表面積累了大量的正、負

電荷，納米顆粒的形狀極不規則，這樣就造成表面電荷的聚集，使納米粒子極不穩

定;②納米顆粒的表面積大，表面能高，處于能量不穩定狀態，很容易發生聚集而

達到穩定狀態;③納米顆粒之間的距離極短，相互間的范德華引力遠大于自身的重

力，因此往往相互吸引而發生團聚;④納米顆粒之間表面氫鍵、化學鍵的作用導致

納米粒子之間的相互吸附而發生團聚。目前，對納米顆粒分散性及團聚控制的研究

取得了一定的進展，何強芳［7］研究了乳化劑對殼聚糖微球的影響，實驗發現，

加入一定濃度的乳化劑制得的微球球形規整，分散性好，團聚問題較未加之前有很

大改善，但在后處理過程中，乳化劑的去除比較困難。

本研究采用高生物相容性的微生物表面活性劑BNAP作為分散劑，利用其在固液

界面上的吸附作用，形成一層分子膜阻礙顆粒之間相互接觸，同時它還可以降低表

面張力，因此，制備出的納米粒分散性好。而且BNAP的加入使CMCS納米粒的

抑菌性能有很大提高。加入BNAP制備出的納米粒不僅能解決納米粒制備過程中

出現的團聚問題，還具有很高的抑菌活性，因此，可作為納米抑菌的優質生物材料，

具有廣闊的發展潛力。

參考文獻:

【相關文獻】

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chitosan［J］.Bioresource Technol，2008，99(8):2806-2814.

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［3］Eldin MSM，Soliman EA，Hashem AI，et cterial activity of chitosan

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［4］林愛華，劉奕明，平其能.殼聚糖納米粒表面游離氨基與納米粒特性研究［J］.藥學學報，

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［5］孫力軍，王雅玲，陳宏.芽孢桿菌抗菌肽應用于水產品安全控制研究展望［J］.食品與發酵工

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［6］陳曉華.納米材料的合成、表征及其在生物傳感器中的應用［D］.華南理工大學碩士學位論文，

2010.

［7］何強芳.乳化劑對殼聚糖微球形成的影響［J］.廣東教育學報，2005，25(3):67-70.