二氫嘧啶脫氫酶活性及5-氟尿嘧啶活性代謝產物測定及其臨床應用

2024年3月31日發(作者：楚雨蕁經典臺詞)

二氫嘧啶脫氫酶活性及5-氟尿嘧啶活性代謝產物測定及其臨床應用

█山東大學齊魯醫院臨床藥理研究所 李平利 張蕊 郭瑞臣

5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前體藥物卡培他濱臨床常用于乳腺癌、結直腸癌及

頭頸癌等多種腫瘤的治療。5-FU進入機體后，80%以上經肝臟二氫嘧啶脫氫酶

（DPD）代謝并轉化為氟代β-丙氨酸（FBAL），FBAL的代謝產物為氟乙酸

（Fluoroacetate）和氟代檸檬酸（F-citrate），是引起5-FU心臟及神經毒性

的主要活性物質。部分未經DPD代謝的5-FU在體內轉化為具有生物活性的FUTP

和FdUTP，通過干擾腫瘤細胞RNA或DNA的生物合成發揮抗腫瘤作用，或轉化為

FdUMP，與胸苷酸合成酶（TS）、5，10-亞甲基四氫葉酸（CH2THF）形成穩定的

三聯復合物，抑制TS正常功能，干擾DNA合成，發揮DNA介導的細胞毒性作用

（如圖所示）。DPD基因（DPYD）存在多態性，不同個體間DPD活性差異較大，

甚至部分或完全缺失。DPD部分或完全缺失個體，5-FU常規劑量可導致清除率降

低，發生5-FU相關毒性，如粘膜炎、粒細胞減少癥、神經性病變，甚至死亡。

而DPD高表達個體，則造成5-FU耐受，常規劑量難以達到理想治療效果。由于

DPYD基因存在多個突變位點，或可能存在未知位點，或某些位點功能活性的研

究尚不完全，導致已知DPYD基因突變與DPD表型缺乏一致性。因此，DPD活性

測定對于5-FU個體化治療更具重要意義。其他參與5-FU體內生物轉化的尿苷磷

酸化酶、乳清酸磷酸核糖轉移酶、胸苷磷酸化酶等的基因型及活性不同個體間也

不完全相同，使產生活性代謝產物FUTP、FdUTP、FdUMP的量存在差異。而FUTP、

FdUTP及FdUMP是殺傷腫瘤細胞的直接作用形式，故測定其細胞內濃度可更直接

地揭示或預測5-FU的療效或毒副作用。因此，直接或間接測定DPD活性及5-FU

活性代謝產物水平有助于制訂、調整、修飾5-FU的給藥方案，提高療效，降低

毒副作用，并進一步評價常規5-FU濃度測定的優勢和局限性，明確5-FU發揮藥

效或產生毒副作用的機制。

1. DPD活性測定

DPD活性測定包括表型測定（Phenotype）、基因型測定（Genotype）、蛋

白表達及mRNA水平測定。

1.1 DPD表型測定

表型指在環境影響下基因型所發生的機體的物理表現和可見性狀，不同表型

藥物代謝酶的催化代謝活性大小, 可通過測定其底物的代謝率斷定。底物可以是

外源性探針藥物，如異煙肼、氨苯砜、咖啡因等可用于測定N-乙酰基轉移酶表

型測定，非治療目的，一次性服用；也可以是治療藥物，如5-氟尿嘧啶，以原

形與代謝物比值表示相關酶活性的強弱。

DPD分布于人體多個組織、器官，但主要存在于肝臟，參與80%以上5-FU

的肝臟代謝。測定血漿或尿液二氫尿嘧啶（UH2）、尿嘧啶（U）、二氫胸腺嘧啶

（THY2）、胸腺嘧啶（THY）、二氫氟尿嘧啶（5-FUH2）、氟尿嘧啶（5-FU）濃

度，計算UH2/U、THY2/THY、5-FUH2/5-FU值可間接反映DPD活性。

Ben Fredj等采用高效液相色譜-紫外方法測定9例接受5-FU/亞葉酸鈣化療

的晚期結直腸癌患者血漿UH2與U峰面積，計算所得UH2/U值范圍為0.07～3.12。

該比值與相應5-FU血漿半衰期呈負指數相關，與患者5-FU毒性相關。Serdar

等采用LC-MS/MS測定45例接受5-FU治療患者PBMCs中5-FUH2和5-FU濃度，

計算得5-FUH2/5-FU值為21.9±3.72，2例DPD缺失患者分別為1.26和1.61，

說明DPD活性缺失可使5-FU的清除率嚴重降低。

Van Kuilenburg AB等以放射性[4-14C]THY為底物，采用反相高效液相色譜

方法檢測THY及其降解產物THY2濃度，以每毫克蛋白每小時代謝生成的THY2

nmol數表示DPD活性。結果顯示，2例5-FU治療出現嚴重毒性反應的癌癥患者

PBMCs DPD活性分別為3.2nmol·mg-1·h-1和4.2nmol·mg-1·h-1，低于健康

志愿者平均DPD活性水平。其中1例患者治療后康復期DPD活性恢復到正常水平

（8.6nmol·mg-1·h-1）。進一步研究顯示，44例接受5-FU/亞葉酸鈣化療患者

PBMCs中DPD活性在4.2～16.0nmol·mg-1·h-1范圍內呈高斯分布，較低DPD

活性與中性粒細胞減少癥顯著相關，但與胃腸道反應、流感樣癥狀、手足綜合征

等毒副反應無相關性。

Büchel等采用LC-MS/MS方法測定10例結直腸癌患者接受5-FU治療前內源

性血漿U、UH2及接受5-FU治療2h后外源性5-FU、5-FUH2濃度。結果顯示，U

和UH2濃度范圍分別為（0.07～2.6）和（0.81～1.77）μM，UH2/U值為3.7～

15.4；5-FU和5-FUH2濃度范圍為（1.4～6.7）和（9.1～25.8）μM。由于DPD

可能存在飽和狀態，接受5-FU治療后，即體內有5-FU存在時，U和UH2濃度高

于接受5-FU治療前，即體內不存在5-FU時。Sistonen等認為，多數個體，接

受5-FU治療前的UH2/U值為DPD非飽和狀態時的活性，不能準確反映DPD活性

變化，而5-FU治療期間所得UH2/U值更準確。因此，接受5-FU治療前給予一定

量DPD底物（如U），所得UH2/U值可更準確評估DPD活性，并準確預測5-FU

相關性毒性。

另外，由于5-FU可被DPD代謝為FBAL，FBAL水平也可一定程度上反映DPD

活性。有報道采用RP-HPLC法測定體外細胞內經DPD分解的5-FU代謝物FBAL

濃度，或采用LC-MS/MS法測定職業暴露于5-FU人員尿液FBAL濃度，可用于監

測、評價醫護人員暴露于5-FU的風險，也可用于DPD活性測定。

采用探針藥物間接測定DPD活性，包括其他藥物代謝酶，快速、簡便，易于

推廣，但探針藥物須代謝機制清楚，代謝途徑單一；排除其他疾病、年齡因素影

響；原形和代謝物濃度測定方法應靈敏專一。

1.2 DPYD基因型測定

已知DPYD基因存在30多種單核苷酸多態性及缺失突變，包括DPYD*2A、

DPYD*13等，可造成DPD活性降低或缺乏。不同的基因位點突變對DPD活性影響

不同，因此，明確DPYD基因型與活性之間的相關性可用于指導5-FU劑量方案調

整。

DPYD*2A突變導致第14位外顯子缺失，造成DPD活性降低甚至喪失。一項

Meta分析結果表明，DPYD*2A突變與5-FU相關毒性反應（≥3級）密切相關（OR

5.42，P<0.001），須將5-FU或卡培他濱初始給藥劑量降至標準劑量的50%，以

降低DPYD*2A突變攜帶者發生嚴重毒性反應的風險。Henricks等認為，DPYD*2A

純合突變個體，不建議給予5-FU類藥物。雜合突變個體DPD活性降低50%，

c.2846A>T純合突變個體降低50%，雜合突變個體降低25%，可采用熒光原位雜

交、基因測序等技術分析DPYD基因多態性，根據患者基因型預測DPD活性及DPD

代謝5-FU的能力，高效、簡便，可用于5-FU的個體化治療。但由于體內處置過

程的復雜性和未知基因突變位點存在的可能性，以及已發現突變位點與酶活相關

性有待證實，通過基因型預測酶活性尚有一定局限性。

1.3 DPD蛋白及mRNA水平測定

DPD mRNA水平與DPD活性密切相關，腫瘤組織或細胞DPD活性可預測5-FU

的治療效應和毒性效應。因此，也可采用免疫組化或逆轉錄聚合酶鏈反應

（RT-PCR）方法測定腫瘤組織DPD蛋白表達，預測DPD活性。Kim等測定184名

胃切除術并替吉奧（S-1）輔助化療的胃癌患者腫瘤組織DPD蛋白表達及mRNA

水平，單變量或多變量分析表明，腫瘤組織DPD蛋白表達量或mRNA水平較低患

者，5年無病生存期（DFS）差，更易發生非血液學毒性（≥3級）反應。但腫瘤

組織DPD mRNA高表達患者，對以5-FU為基礎的化療方案則產生較差的治療效果。

提示，DPD不僅影響5-FU及含5-FU藥物治療方案的治療效應和毒性作用，還影

響決定療效的活性產物生成。

2. 5-FU活性代謝產物測定

由于細胞內活性代謝物含量較低，細胞轉運蛋白外排作用的程度難以確定，

代謝物與內源性核苷酸結構高度類似存在干擾，較難準確測定。但FUTP、FdUTP、

FdUMP確為5-FU細胞內發揮抗腫瘤作用的活性物質，細胞內水平直接反映到達

作用部位的量，對于指導5-FU劑量方案調整，闡述耐受機制，有不可替代的作

用。因此，應建立準確、可行、實用的體內FUTP、FdUTP、FdUMP水平測定方法。

Carli等采用固相提取法，對極性化合物有較長保留時間的AtlantisC18色

譜柱，流動相為甲酸銨（5mM，pH4）/甲醇/水（5/5/90，v/v），等離子梯度洗

脫，三重四級桿質譜檢測器定量測定MCF-7細胞內5-FdUMP（ng/μg蛋白）。結

果顯示，5-FU孵育后30min內，細胞內5-FdUMP的量呈線性增加。操作簡便，

可用于生物樣本5-FdUMP檢測。

Derisn等建立了UPLC-MS/MS方法測定接受5-FU治療患者PBMCs中FUTP、

FdUTP、FdUMP含量。采集患者16ml外周血，提取白細胞，甲醇裂解后取上清液

進樣。3例口服卡培他濱及5例接受FOLFOX6化療方案治療的癌癥患者PBMCs中

FUTP、FdUTP、FdUMP測定結果顯示，卡培他濱給藥后0～8h內，測得FUTP最低

濃度為1.84nM，但未測出FdUTP和FdUMP。同樣，靜脈注射5-FU患者，測得FUTP

最低濃度為178nM，FdUMP最低濃度為3.39nM，但未測出FdUTP。提示該方法特

異、靈敏，但需進一步優化，或擴大樣本，提高研究方法的適用性，以實現對生

物樣本FUTP、FdUMP和FdUTP的定量檢測以及臨床實用價值的評價。

3.展望

DPD酶在5-FU化療過程中發揮著重要的作用，掌握其生理病理特點、作用

規律和影響因素有助于提高5-FU的療效，降低其毒副作用。雖然DPYD基因多態

性檢測已被推薦用于預測5-FU類化療藥物的毒性及敏感性，5-FU濃度測定也被

常規用于治療藥物監測，但作為補充，DPD酶活性測定可更全面反映由未知基因

突變或非基因因素造成的DPD活性改變，并作為制定、調整、修飾5-FU治療方

案的依據，提高5-FU治療的有效性和安全性。

此外，盡管DPD活性研究已較為深入，但由于研究者的角度不同，如樣本來

源，體內體外研究，采用的方法不同，如色譜法、光譜法、免疫法等，或樣本量

的局限性，導致DPD活性缺乏統一的界值，即低于界值患者更大可能出現高風險

毒性反應，從而需要規范設計、采用先進技術、進行更大樣本量的研究，以確定

DPD活性界值。

5-FU活性代謝產物FUTP、FdUTP、FdUMP可直接反映其發揮療效、產生毒副

作用及耐受的機制，有助于進一步揭示5-FU代謝動力學特征，有助于5-FU的個

體化治療，有助于驗證、評價5-FU常規治療監測的可靠性及可行性，因此，排

除內源性核苷酸的干擾，建立靈敏、可靠、實用、可行的細胞內ng甚至pg水平

FUTP、FdUTP、FdUMP活性代謝物定量測定方法，可最大限度地指導5-FU的臨床

合理使用。