產淀粉酶菌種的分離
產淀粉酶菌種的分離、篩選、鑒定和產酶條件優化
一．設計背景
淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱，是用于釀酒、食品、醫藥、紡織、飼料等具有商業價值的重要酶類。是最早實現工業化生產，迄今為止用途最廣，產量最大的酶制劑品種。所以開始產淀粉酶菌種的分離、篩選、鑒定和產酶條件優化。
二．目的要求
分離篩選出產淀粉酶菌種，并進行鑒定和產酶條件的優化
三．實驗技術步驟及詳細流程
采集含菌樣品設計配制選擇性培養基分裝滅菌平板涂布分離純化菌種（透明圈法）劃線分離進一步純化產酶菌種（透明圈法）液體培養法復篩產酶菌種，檢測產酶性能目的菌種斜面和甘油保藏目的菌種的染色法顯微觀察目的菌種的常規生理生化鑒定考察紫外線對產酶菌種生
長及產酶性能的誘變效應考察碳源或氮源種類及濃度對產酶菌種生長及產酶性能的影響考察PH對產酶菌種生長及產酶性能的影響
1.采集含菌樣品
根據所選產酶菌種的要求，我們宜在淀粉制品霉變的樣品中分離。故在新校區的花壇中提前一周埋入淀粉制品（距離地表5cm左右），一周后用小鐵勺在新校區的花壇中挖出泥土，放入提前準備好的塑料袋中。
2.培養基的配制
2.1平板篩選培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%,可溶性淀粉2．0％，瓊脂1．5～2．0％，pH自然。121℃滅菌20min。
2.2搖瓶復篩培養基：玉米粉3％，玉米漿3％，CaCl20．13％，Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃滅菌20min。
2.3斜面保存培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂15.0～20.0g，加蒸餾水至1000ml。pH7.0～7.2。
2.4種子培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂15.0～20.0g，加蒸餾水至1000ml。pH7.0～7.2。
2.5產酶液體培養基：玉米粉3％，玉米漿3％，CaCl20．13％，Na2HP04 0．3％，(NH4)2S04 0．4％，pH 6．0。121℃滅菌20min。
3.分裝滅菌
將所需要滅菌的儀器，如培養皿，錐形瓶，試管，移液管滅菌，使用加壓蒸汽滅菌法。一般使溫度升高到121攝氏度，高溫加壓20Mmin。
4.平板涂布分離純化菌種（透明圈法）
稱取土壤樣品1g溶于9mL無菌水中，將水樣品5mL溶于45mL無菌水中，分別用無菌水梯度稀釋至1×107倍，取1×105、1×106、1×107稀釋液涂布于平板篩選培養基表面。
37攝氏度培養72h，用無菌的牙簽挑選單菌落影印2-3皿，同時用簽字筆對各單菌落標號。影印過的培養皿37℃培養72h，取其中一皿噴灑稀碘液記錄有水解圈的單菌落。根據記錄
從剩余2皿中挑取對應有透明圈的單菌落，轉接，經平板劃線法得到純種。接種斜面保存培養基中，培養后于4℃保藏。
5.劃線分離進一步純化產酶菌種（透明圈法）
將初篩得到的菌種涂布于平板篩選培養基表面。依然37攝氏度培養72h，用無菌的牙簽挑選單菌落影印2-3皿，同時用簽字筆對各單菌落標號。影印過的培養皿37℃培養72h，取其中一皿噴灑稀碘液記錄有水解圈的單菌落。挑取有透明圈的單菌落，轉接，經平板劃線法得到純種。通過復篩，劃線分離進一步純化產酶菌種，接種斜面保存培養基中，培養后，于4℃冰箱保藏。
6.液體培養法復篩產酶菌種，檢測產酶性能
6.1 復篩得到的純菌種接種于30／250mL種子培養基，37攝氏度、250r／min 搖床培養過夜。種子液以2％接種量接種于產酶液體培養基50／500mL，相同條件培養72h，發酵液8 000r／min離心10min，取上清液測酶活，每個樣品重復3次，最后結果取平均值。
6.2 酶活測定方法
測定方法：3，5一二硝基水楊酸比色法。
1.標準梯度糖液配制，分別取0.5mg/ml的葡萄糖標準液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 于1~6號試管中，并用蒸餾水補足到1ml。
2.還原糖液的提取，精確稱取樣品1.0g于100ml 小燒杯中，再加入50ml蒸餾水攪勻，用水定容到100ml。
3.過濾，取濾液1ml于7、8號試管中，待用。
4.稱取樣品1.0g，放入100ml小燒杯中。加入10ml 6mol/L的HCl，和15ml 蒸餾水，沸水浴加熱25min. 用膠頭滴管滴2~3滴碘化鉀—碘溶液于培養皿中（可以稍微稀釋），用細玻璃棒蘸少量樣品與之進行反應，若無深藍色物質產生說明總糖已經水解完全，否則繼續沸水浴加熱并每隔5min以相同的方法再次測定，直至完全水解。
5.取出完全水解的樣品，冷卻后滴加2~3滴酚酞，用6mol/L NaOH滴定至中性。
6.用水定容到100ml，過濾，取5ml濾液，再次定容到100ml。
7.取6中第二次定容的液體1ml于9、10號試管中，待用。
1.OD540的測量及標準曲線的制作, 在10支試管中加入0.5ml DNS試劑，混勻，十只試管放入500ml裝有少量水的燒杯中，進行沸水浴加熱5min，再流水冷卻。2、每支試管加入再 4.0ml蒸餾水并搖勻。 3、取液體裝入比色皿中，每個樣品測三次，取其平均值為其OD540，以未加葡萄糖的試管即1號試管內的液體作為參比液。 4、取1~6號試管中的數據，做出OD540~還原糖含量曲線，縱坐標為OD540，橫坐標為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，單位mg。 5、在曲線上讀出7~10號試管的含量值。
1.計算.取7，8號試管含量的平均值作為還原糖含量值，取9，10號試管含量的平均值作為總糖的含量值。
2.還原糖含量%=還原糖毫克數×樣品稀釋倍數（100）樣品毫克數（1000 ）×100% 總糖含量%= 水解后還原糖毫克數×樣品稀釋倍數（2000）×0.9 樣品毫克數（1000 ）×100%
酶活力定義：在40攝氏度、pH 6．0，1min從可溶性淀粉中釋放出lumol還原糖所需的酶量。
7.目的菌種
將篩選出的菌種接種到我們的斜面培養基或者用甘油保存。
斜面保存培養基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，瓊脂15.0～20.0g，加蒸餾水至1000ml。pH7.0～7.2。
菌種甘油保存方法： 1. 將要保存菌種接種于LB液體培養至對數生長期（肉眼見培養體系內渾濁即可）， 2 .將甘油稀釋至濃度為50%（等體積蒸餾水加等體積甘油，甘油需要慢慢吸），3 .將甘油、2 ml離心管、槍頭等試驗用品于121℃滅菌20min , 4 .無菌條件下將菌液與50%濃度甘油1:1等體積混合于離心管中，甘油終濃度為25%, 5 .于-20℃冰箱內保存。
8.目的菌種的染色法顯微觀察
（1）取目的菌種進行涂片、干燥、固定。涂片不宜過厚。
（2）初染，滴加結晶紫以剛覆蓋為宜，染色1~2min，水洗。
（3）媒染，用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1min，水洗。
（4）脫色，用濾紙吸去殘水，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色，立即水洗。脫色時間一般約20~30s。
（5）復染，用0.5%番紅溶液復染約2min，水洗。革蘭氏陽性菌仍呈紫色，革蘭氏陰性菌則呈現紅色。
（6）鏡檢，用油鏡觀察。
9.目的菌種的常規生理生化鑒定
9.1糖發酵實驗
（1）取四支倒置了徳漢氏小管的試管，向其中分別加入無菌乳糖培養基、無菌葡萄糖培養基、無菌蔗糖培養基、無菌麥芽糖培養基。
（2）用記號筆在各試管外壁上分別做標記，以區分各培養基，并在培養基中加入指示劑（溴甲酚紫）。
（3）在四支試管中接種目的菌種，將接種后的試管放置于37℃的溫箱中培養24h—48h。
（4）觀察各試管中顏色變化以及徳漢氏小管中有無氣泡。
9.2甲基紅試驗（MR試驗）
（1）菌種接種于葡萄糖蛋白胨水培養基中，置37℃培養48-72h。
（2）配置甲基紅試劑（甲基紅0.02g，95%酒精60mL，蒸餾水40mL），20mg甲基紅溶于60 mL95%乙醇中，然后加入40mL蒸餾水。
（3）取出后加甲基紅試劑3-5滴，立即觀察結果。如果培養液呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。
9.3接觸酶試驗
取潔凈載玻片1張，用接種環挑取細菌，加3%H2O21滴，立即觀察結果。
9.4硫化氫產生試驗
（1）取SIM培養基（胰胨 20g、多價胨 6g、硫酸鐵銨 2g、硫代硫酸鈉 0.2g、瓊脂 3.5g）30g,加熱溶解1000ml蒸餾水中,分裝試管，121℃高壓滅菌15分鐘備用。
（2）將目的菌種穿刺接種至培養基中。將所有試管置于37℃下培養24-48小時。
（3）檢視所有SIM培養基，觀察接種線有無黑色產生，將記錄結果，判斷目的菌是否具有產生硫化氫之能力。再觀察微生物是否沿接種線向四周擴散，并判斷其是否具運動性。
10.紫外線對特定產酶菌種生長及產酶性能的誘變效應
（1）菌種活化將目的菌接種到固體斜面培養基上，放入培養箱中于37℃培養24h，即得活化菌株。
（2）菌懸液制備取活化后的菌種2環接種于盛有100ml無菌水的三角瓶中，加入無菌玻璃珠，并置搖床上振蕩20min，配成106-108個/mL的菌懸液。
（3）紫外線誘變及篩選各取5mL菌懸液移入18個無菌培養皿中，置于距30W紫外燈30cm 處的磁力攪拌器上照射1min，然后打開皿蓋并開啟磁力攪拌器，分別照射0s(對照用)、50s、60s、70s、80s、90s、100s、110s、120s(各做 2 組)。在暗光條件下，分別取經紫外線誘變的菌懸液0.1mL涂布于18個固體鑒別培養基上，倒置于37℃恒溫培養箱中避光培養 36h，計算致死率。噴灑碘液后，挑選單菌落變色圈直徑與菌落直徑比值 H /C≥2. 0的菌
株，進行搖瓶發酵實驗，測定其產酶能力。
11.碳源或氮源種類及濃度對產酶菌種生長及產酶性能的影響
11.1最佳碳源的確定
在500mL三角瓶中各裝50 mL基礎發酵培養基，其中的碳源分別為可溶性淀粉、玉米粉、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖；設3個重復。接入種子液2 mL，37℃，180r/min培養4d，測定粗酶液酶活。
11.2最佳氮源的確定
在500mL三角瓶中各裝50 mL基礎發酵培養基，氮源分別為牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米漿、大豆粉、硫酸銨、蛋白胨10 g/L＋酵母粉5 g/L、牛肉膏10 g/L＋蛋白胨5 g/L；設 3 個重復，接入種子液2 mL，37℃，180r/min培養4d，測定粗酶液酶活。
