珊瑚羥基磷灰石表面改性的工藝
常加賀 1），李 靖 2），蘇 軍 2），和麗佳 2），陳慶華 3），張文云 2）
（1）長治醫學院附屬和平醫院，山西 長治 046000；2）中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二〇醫院，
云南 昆明 650032；3）昆明理工大學材料與工程學院，云南 昆明 650500）
[ 摘要 ] 目的 探究納米氧化鋅（nmZnO ）在不同條件下改性珊瑚羥基磷灰石（CHA ）的工藝研究。方法 在弱酸環境內，溫度70 ℃條件下，采用硝酸鋅溶膠-凝膠法改性珊瑚羥基磷灰石，通過超聲、旋轉攪拌、干燥、煅燒獲得白色顆粒狀多孔復合材料，應用掃描電子顯微鏡觀察改性后材料表面特征。結果 在不同原料配比條件下，nmZnO 顆粒在CHA 表面的分布及粒徑大小存在差異。熱處理過程中，保溫溫度及保溫時間的改變會導致材料的除碳效果及結構完整性發生變化。結論 利用硝酸鋅溶膠-凝膠法可以對珊瑚羥基磷灰石進行表面改性，納米氧化鋅粒徑小于100納米，納米粒子的團聚問題得以解決。
[ 關鍵詞 ] 珊瑚羥基磷灰石； 氧化鋅； 改性； 抗菌性能
[ 中圖分類號 ] R318.08 [ 文獻標志碼 ] A [ 文章編號 ] 2095 ? 610X （2021）01 ? 0017 ? 06
Process Studies on the Surface Modification of
Coral Hydroxyapatite
CHANG Jia-he 1），LI Jing 2），SU Jun 2），HE Li-jia 2），CHEN Qing-hua 3），ZHANG Wen-yun 2）（1） Heping Hospital Affiliated to Changzhi Medical College ，Changzhi Shanxi 046000; 2） Dept. of Stomatology ，No.920 Hospital of PLA ，Kunming Medical University ，Kunming Yunnan 650032;
3） Faculty of Materials and Engineering ，Kunming University of Science and
Technology ，Kunming Yunnan 650500，China ）
［Abstract ］ Objective To explore the process of modifying coral hydroxyapatite by nmZnO under the different conditions. Methods Coral hydroxyapatite was modified by zinc nitrate sol-gel method at 70 ℃ in weak acid environment. White granular porous composite materials were obtained by ultrasonic，rotary stirring，drying and calcination. The surface characteristics of the modified materials were obrved by scanning electron microscope.Results The results showed that the distribution and size of nmzno particles on the coral hydroxyapatite surface were different under the different raw material ratios. In the process of heat treatment，different holding temperature and holding time would lead to the change of carbon removal effect and structural integrity of m
aterials.Conclusion Coral hydroxyapatite surface can be modified by zinc nitrate sol-gel method. The particle size of nano zinc oxide is less than 100 nanometers. The agglomeration problem of nano-particles is solved.
［Key words ］ Coral hydroxyapatite；Zinc oxide；Modification；Antibacterial property
近年來因創傷和不良生活習慣等原因所導致的口腔頜面部骨折、骨腫瘤等疾病越來越多[1?4]，造成嚴重的骨缺損問題，給人們帶來生理功能障礙和精神創傷。目前臨床工作中使用的骨移植材料通常不具備抗菌性能，骨移植術后感染發生率較高，導致植骨術失敗。因此，研制出一種兼具良好生物相容性、成骨活性、長效廣譜抗菌性和不產生耐藥性的多孔骨修復材料非常必要。
[收稿日期] 2020 ? 07 ? 12
[基金項目] 國家自然科學基金資助項目（81260272）
[作者簡介] 常加賀（1994～），男，山西長治人，醫學碩士，住院醫師，主要從事口腔材料學研究工作。[通信作者] 張文云，E-mail ：******************
昆明醫科大學學報 2021，42 （1 ） ：17~22Journal of Kunming Medical University
DOI: 10.12259/j.issn.2095-610X.S2*******
CN 53 ? 1221/R
在抗菌生物材料中，納米氧化鋅由于其原材料資源豐富、價格較低、對環境無毒害，且具有寬禁帶、紫外吸收、抗菌性能優異等特點受到研究者的廣泛關注[5?6]。課題組前期通過溶膠-凝膠法成功制備出羥基磷灰石晶須/納米氧化鋅-納米氧化鈣（HAPw/nmZnO-nmCaO）復合材料[7]。通過相關實驗得出納米粒子表面改性的理想條件，即在弱酸環境下，反應的理想溫度為70 ℃等關鍵改性步驟；同時研究得出HAPw/nmZnO-nmCaO 復合材料具備良好的抗菌及成骨性能。因羥基磷灰石晶須（HAPw）無多孔結構，本實驗擬利用珊瑚羥基磷灰石為原材料，研制出一種兼具多孔、抗菌及成骨性能的珊瑚羥基磷灰石/納米氧化鋅（CHA/nmZnO）復合材料，為后期探究CHA/nmZnO 復合材料的抗菌及成骨性能奠定基礎，為研制新型抗菌人工骨修復材料提供相關理論基礎及實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
珊瑚羥基磷灰石（CHA，昆明理工大學生物工程材料實驗室自制）；磷酸氫二銨（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；硝酸鋅（分析純，國藥集團試劑有限公司）；聚乙二醇-6000（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司）；氨水（分析純，天津市化學試劑廠）；冰乙酸（分析純，重慶化工集團有限公司）。
1.2 儀器與設備
S&B電子天平（FA2004，上海海康電子儀表廠）；超聲波清洗機（CQ250，中船七院七二六所）；磁力攪拌機（CJ78-1，杭州富華儀器公司）；恒溫水浴鍋（B-220，上海亞榮生化儀表廠）：旋轉蒸發儀（RE-52CS，上海亞榮生化儀表廠）；數顯恒流泵（HL-BB，上海瀘西分析儀器廠）；箱式電阻爐（sRJX-1-2，滬南實驗儀器廠）；數顯鼓風干燥箱（101A-1，上海市實驗儀器總廠）。
1.3 實驗方法
1.3.1 制備CHA/nmZnO復合材料 將天然珊瑚清洗消毒及研磨過篩后得到珊瑚顆粒，根據水熱反應原理，利用特殊高溫高壓反應釜制備CHA 顆粒。
將硝酸鋅和聚乙二醇-6000（PEG-6000）經70 ℃水浴條件下溶于0.25 L無水乙醇中，得到澄清液。將CHA顆粒置于0.25 L無水乙醇中，在攪拌條件下，將澄清液通過數顯恒流泵逐滴加入CHA浸泡液中。利用氨水、冰醋酸調節溶液pH至弱酸環境，經70 ℃恒溫水浴反應后進行超聲分散，繼續升溫至溶劑蒸干，隨后放置于干燥箱內完全干燥，將所得材料進行熱處理，得到CHA/nmZnO 復合材料。
1.3.2 實驗分組 以場發射掃描電子顯微鏡檢測結果作為試驗指標，采用全面實驗設計逐步調整原料配比，最終確定CHA表面抗菌改性的原料配比、熱處理溫度、熱處理保溫時間等工藝條件。
將樣品按照原料質量配比比例的不同共分為五組，分別為：CHA、硝酸鋅和PEG-6 000質量比為：4∶2∶1（G1：第1組）、24∶8∶5（G2：第2組）、24∶4∶5（G3：第3組）、48∶4∶5（G4：第4組）、24∶2∶5（G5：第5組）。
根據同步熱分析儀檢測結果，對復合材料進行熱處理，分別設置保溫溫度為560 ℃、580 ℃、600 ℃；保溫時間分別為1 h、3 h、5 h，共9組。
1.4 測試方法
1.4.1 X-射線衍射儀檢測（XRD） 利用X射線衍射儀對被測樣品進行檢測分析，探究樣品改性前后的物相組成變化情況。
1.4.2 掃描電鏡儀檢測（SEM） 利用SEM對CHA/ nmZnO復合材料進行檢測，分析其表面形貌、孔徑大小、納米顆粒粒徑、分布等結構特征。
1.4.3 電子能譜分析（EDX） 在SEM檢測下，運用X射線光電子能譜儀（K-Alpha+，賽默飛世爾科技有限公司）分析指定區域內樣品的元素類別及相對含量。
1.4.4 同步熱分析儀檢測（TGA） 利用熱重分析結果研究該復合材料的分解溫度等特征，探究復合材料熱處理時保溫溫度及保溫時間等關鍵工藝條件。
2 結果
2.1 XRD檢測結果
通過XRD檢測得出樣品相關數據，利用Jade 6.5軟件分析被測材料的元素組成成分，通過Origin 8.0對分析結果進行繪制圖形，得到樣品XRD圖譜見圖1。
由XRD檢測圖譜可以得出：復合材料主要由碳酸鈣構成。氫氧化鈣特征峰可能由于復合材料經過熱處理后，部分碳酸鈣變性形成氧化鈣，與
18昆明醫科大學學報第 42 卷
空氣中的水分發生化學反應所致。同時樣品存在HAP 特征峰，表明天然珊瑚經過水熱反應后，表面珊瑚碳酸鹽成分轉化為羥基磷灰石。樣品中還存在ZnO 特征峰，證明利用溶膠-凝膠法對CHA 進行表面改性后得到的復合材料中含有ZnO 成分。
2.2 SEM 檢測結果
各組材料的SEM 檢測結果見圖2，根據SEM 檢測結果可知，G4（第四組）中復合材料表面的nmZnO 顆粒分布均勻，粒徑理想，材料的多孔結構未被破壞，納米顆粒熔附的情況較理想。
2.3 EDX 檢測結果
對照組與G3-G5組的EDX 檢測結果見圖3，EDX 測試結果表明CHA/nmZnO 復合材料是由Zn、Ca、O、P、C 五種元素構成，結果證實復合材料表面的納米顆粒為nmZnO 顆粒。Pt 元素的出現可能由于材料表面進行噴鉑處理后所致。2.4 TGA 檢測結果
CHA 顆粒樣品在空氣氣氛內以10 ℃/min 的升溫速率升溫至900 ℃后，得到測試樣品的熱失重曲線（TG 曲線）、差示掃描量熱曲線（DSC 曲線）和熱失重微分曲線（DTG 曲線）見圖4。
由TG 曲線可得出，CHA 顆粒在632.15 ℃時開始產生重量變化，樣品在780.26 ℃時失重最明顯，807.65 ℃時完成失重反應過程，總失重率為40.22%，DTG 曲線結果與TG 曲線結果一致。由此得出復合材料的熱處理溫度應控制在632.15 ℃以下進行。
2.5 CHA/nmZnO 熱處理后結果
將混合凝膠材料進行熱處理實驗，設置電阻爐工作程序為：升溫速率2 ℃/min，按照實驗設計設置保溫溫度及保溫時間，熱處理后大體觀察材料表面顏色、質地情況見表1。
根據實驗結果可知：隨著保溫溫度及保溫時間的增加，除碳效果越理想，但材料的強度越差，最終導致材料的多孔結構被破壞。CHA/nmZnO 復合材料的最優熱處理條件為：升溫速率以2 ℃/min 升溫至5
80 ℃，保溫時間為5 h 時，材料的除碳效果及機械強度均較為理想，原有結構未發生破壞。
3 討論
在傳統的感染性骨缺損治療中，通常采用清創術結合抗生素來進行治療，但由于創傷部位血
CaCO 3HAP Ca(OH)2ZnO
10008006004002000
20
40
6080
2θ (degree)
圖 1 CHA/nmZnO 復合材料的XRD 圖譜Fig. 1 XRD patterns of the CHA/nmZnO
G0
G1
2 μm
G2
G3
G4
G5
圖 2 G0-G5組SEM 圖片Fig. 2 SEM images of G0-G5 group
G0：未經改性的CHA，SEM 圖片（×20 000）；G1：SEM 圖片（×10 000）；G2：SEM 圖片（×20 000）；G3：SEM 圖片（×30 000）；G4：SEM 圖片（×30 000）；G5：SEM 圖片（×40 000）。
第 1 期
常加賀， 等．珊瑚羥基磷灰石表面改性的工藝
19
供條件差，口服或靜脈注射抗生素等方式在感染部位難以維持有效的抗菌濃度[8]，愈后效果往往不佳。目前，常見的抗菌性骨修復材料是將抗生
素加載于人工骨材料上，從而具備抗菌效果[9?10]，但近幾年超級細菌的報道也愈發頻繁[11]，因此限制了該材料的發展。耐藥菌株的形成有諸多原
Cursor=
Vert=574Window .005?40.955=17 999 cnt
Cursor=
Vert=446Window .005?40.955=19 398 cnt
5101520 keV
Cursor=
Vert=239Window .005?40.955=13 329 cnt
5101520 keV
5101520 keV
Cursor=
Vert=807Window .005?40.955=37 281 cnt
5101520 keV
A
C B
D
圖 3 EDX 分析結果Fig. 3 EDX analysis results
A：G0組（CHA 對照組）EDX 測試結果；B：G3組EDX 測試結果；C：G4組EDX 測試結果；D：G5組EDX 測試結果。
m g
m w
m g ·m i n ?1
89765
TG curve
Sample name: CHA, 10.09.2019 04:26:05Sample weight: 8.9601 mg
Method:25.0..900 °C , 10 K/min, Air 50 ml/min Sample holder: alumina 70 ul
Step ?1.89 % ?0.17 mg
Step ?38.32 %
?3.43 mg Residue 59.78 %
5.36 mg
DTG curve
DSC curve 0
?10?20
?30?0.20?0.4
Integral Normalized Ont Peak Endt
Integral Normalized Ont Peak Endt
?124 mJ ?17.19 Jg 298.70 °C 308.69 °C 329.08 °C
?26.20e+03 mJ ?2923.75 Jg 632.15 °C 780.26 °C 807.65 °C
50100150200250300350400
450
500
550
600
650
700
750
800
8500
5101520253035
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85°C min
50100150
200
250
300350
400
450500
550600
650
700
750
800
8500
5
10
15
20253035
40455055
60
65
70
75
80
85°C min
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
510152025303540455055606570758085°C min
CHA
圖 4 CHA 復合材料TGA 檢測結果Fig. 4 TGA analysis results of the CHA
表 1 復合材料熱處理后情況
Tab. 1 Changes of composites after heat treatment
保溫溫度（℃）保溫1 h
保溫3 h
保溫5 h
560色黑，原結構未破壞色灰黑，原結構未破壞色灰白，原結構未破壞580色灰，原結構未破壞色灰白，原結構未破壞色白，原結構未破壞600
色灰白，原結構未破壞
色白黃，原結構未破壞
色白，原結構破壞
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昆明醫科大學學報
第 42 卷
因[12]：如臨床工作中濫用抗生素及聯合用藥不當[13]、細菌自身突變、細菌分泌的蛋白質形成生物膜、耐藥質粒的影響及細菌的外排作用等[14]。相比于抗生素，無機抑菌劑的優勢更為明顯，無機抑菌劑安全性高，抗菌作用廣譜且持久，不產生耐藥性。無機抗菌劑一般為光催化型半導體抗菌材料與抗菌活性金屬及其氧化物[15]，前者因光催化條件限制其應用范圍，所以后者得到研究者廣泛的關注。其中，納米氧化鋅的原材料來源豐富、價格較低、對生態環境無毒害，其較強的量子尺寸效應、寬禁帶、紫外吸收、抗菌性能優異等特點，在抗菌材料領域備受關注。
珊瑚羥基磷灰石是天然珊瑚經過“水熱反應”，將表面碳酸鈣置換為羥基磷灰石[16]的復合材料，該材料不僅具備羥基磷灰石良好的生物相容性及骨引導性，同時也提升了天然珊瑚的機械強度并保留了珊瑚原有的多孔結構，有利于新生骨組織的生長。有大量文獻表明珊瑚羥基磷灰石有助于骨和軟組織的長
入及珊瑚內骨重建[17?18]，其降解速率也可通過調整“水熱反應”條件，改變羥基磷灰石轉化率實現人為控制[19]。珊瑚羥基磷灰石相比于其他骨移植材料有諸多優勢。較自體骨移植而言，利用珊瑚羥基磷灰石材料進行骨缺損修復時無需從健康部位取骨，避免開辟第二術區，減少術區出現感染、出血等術后并發癥，減輕患者痛苦，同時降低了手術過程中存在的潛在風險，增加植骨手術的成功率。較同種異體骨移植而言，CHA人工骨材料有效的避免了機體產生排異反應和潛在的疫病傳播等風險。較人工合成羥基磷灰石而言，羥基磷灰石不具備多孔結構，無法為新生骨組織、血管提供理想的三維生長空間，從而不利于骨組織的生長，并且存在抗力性能不足、機械強度較差等問題。近年來CHA人工骨在口腔頜面部骨缺損的治療中得到廣泛應用[20]。
本實驗的關鍵步驟結論與課題組前期結果一致[21]，制備所得的CHA/nmZnO復合人工骨材料，是將具有多孔結構、生物相容性較好的珊瑚羥基磷灰石與納米級無機金屬氧化物結合的新型抗菌生物材料，使CHA人工骨材料具有抗菌效果。有研究表明納米氧化鋅具有持久且廣譜的抗菌性能[22]，是無機抗菌材料中研究的熱點。同時CHA人工骨材料在降解的過程中釋放的鈣離子有利于成骨細胞的生長增殖[23?24]；CHA降解產物中的磷酸根離子不僅有利于生物礦化，而且是成骨細胞分化蛋白生成與基因表達的一種信號分子[25]。課題組下一步將針對CHA/nmZnO復合材料的抗菌及成骨性能進行相關實驗探究。
通過利用溶膠-凝膠法對珊瑚骨羥基磷灰石進行表面改性的各項實驗條件，可以得出以下結論：（1）
利用溶膠-凝膠法可以對CHA顆粒進行表面改性，掃描電子顯微鏡下能觀察到均勻分布的球狀納米ZnO顆粒；（2）利用溶膠-凝膠法對CHA顆粒改性的最佳條件為：調節pH值至弱酸條件下，反應溫度70 ℃，CHA、硝酸鋅和PEG-6 000質量比為48∶4∶5；（3）材料熱處理的理想工藝條件是以2 ℃/min勻速升溫條件下，設置保溫溫度為580 ℃，保溫時間5 h。
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