1 磷酸鈣生物材料骨誘導性
1. 1 磷酸鈣骨誘導現象發現和確證磷酸鈣(Calcium pho sphate) 為鈣與磷酸根離子形成的化合物, 因晶體結構及鈣磷組成比(Ca?P )不同性能有差異。Ca?P 比小于115 的磷酸鹽很不穩定, 其溶解速率比新骨組織形成高很多, 故它們不適于作骨代材料。臨床最常應用的磷酸鈣是羥基磷灰石(Hydroxyapat ite, HA ) 和磷酸三鈣(T ricalciumpho sphate, TCP)。HA 與組成人體骨骼和牙體硬組織的無機成分相同, 且晶體微觀結構類似。大量的實驗及臨床應用證明, HA 具有優良的生物相容性, 可與骨組織發生化學性結合, 具有骨引導性 (O steoconduct ion) , 即材料植入骨環境中, 骨組織能沿著植入體表面或內部孔隙攀附生長。多數文獻報道HA 無骨誘導性(O steo induct ion) , 即誘導間充質細胞向成骨分化的能力。HA 早在1871 年由RW aroneton 制得, 20 世紀70 年代始用于臨床, 成為最常用的骨替代材料。TCP 分子式Ca3 (PO 4) 2, Ca?P原子比為115, 化學組成與HA 相似, 但不是機體骨組織的礦物成分。TCP 因燒結溫度不同分為A2和B2兩相, 相轉變溫度為1 120～ 1 180℃, 以下為B2TCP,以上為A2TCP。在模擬體液(SBF) 中, A2TCP 比B2TCP 易解, 比HA 更易降解, 在體內易被降解吸收。M erten 和W ilfarg[ 2 ]將B2TCP 和A2TCP 植入微型豬 (Goet t inger m in iatu re p igs, GM P s) 人工脛骨缺損區考察降解性, 結果表明B2TCP 比A2TCP 更易降解, 降解產生的鈣及磷酸根離子被周
圍巨噬細胞吞噬, 也可被周圍新生骨組織利用, 刺激和促進更多新骨生成。對HA ?T CP 雙相陶瓷, TCP 的降解將利于在陶瓷表面再形成類似針狀或片狀的、相對穩定和活化的HA 晶粒, 產生優良的生物學效應[ 3 ]。
磷酸鈣作為最常用的骨代材料, 對其研究較為深入。早在1911 年,W ells 在A ch ives of In ternalM edical 一書中就提到: 鈣鹽對骨發生具有促進作用。但關于磷酸鈣陶瓷的大量研究, 如Aok i、Hench等的工作都集中在HA 的制備及應用領域的拓廣、評價方面, 并一直認為磷酸鈣陶瓷是一類僅具有骨引導性, 而無骨誘導性的生物活性材料。1988 年Heughebeart 等[ 4 ] 研究發現, 沒有添加任何生長因子或活體細胞的磷酸鈣陶瓷植入動物非骨部位后,其表面形成骨樣沉積物。1990 年Yam asak i[ 5 ]報道植入狗皮下的多孔HA , 其中有骨形成。1991 年, 張興棟等[ 6 ]和R ipamon t i[ 7 ]分別報道植入狗2 月和狒狒3、6、9 月非骨部位的多孔HA 中有新骨形成。1992 年, To th 和Klein 均報道了磷酸鈣陶瓷具有骨誘導性。之后, 張興棟研究組在中國國家自然科學基金重大項目和國家重點基礎研究規劃項目(973) 資助下, 對磷酸鈣陶瓷骨誘導現象的確證, 及其機理探討作了大量深入系統的工作[ 8, 9 ] , 并在2000 年5 月[ 10 ]美國夏威夷舉行的第六屆世界生物材料大會上, 主持了生物材料固有骨誘導性的專題討論, 使磷酸鈣陶瓷具有骨誘導性的科學理論在國際上逐漸得到公認,同時為具有骨誘
導性的磷酸鈣生物材料的臨床應用提供充分的依據, 引導該領域的研究方向, 并為研制出擁有自主知識產權的骨誘導性骨修復材料奠定基礎。
1. 2 磷酸鈣骨誘導過程和機制
結合U rist 關于骨誘導發生的三個條件: (1) 有骨誘導因子; (2) 存在骨形成的前體細胞, 即誘導因子作用的靶細胞; (3) 適當的成骨環境; 并在大量前期研究的基礎上, 張興棟對磷酸鈣(Ca2P) 陶瓷誘導骨發生過程及機制提出假說。大量實驗[ 11, 12 ] 觀察到: ①材料植入區血凝塊形成, ②血管長入及肉芽組織形成, ③多形性細胞聚集, ④成骨細胞分化及骨形成。骨誘導機制可能為: ①材料對骨生長因子的吸附, 提高局部濃度, 誘導間充質細胞向骨前體細胞的分化, ②材料提供骨形成的支架及空間, ③材料降解為骨成熟提供所需的Ca、P 離子。材料植入機體后,與體液中的各種物質相互識別, 吸附水、離子、蛋白等生物分子, 發生系列的物理化學、生物學反應, 并形成一個特殊的“生物修飾表面”及局部微環境, 對細胞外基質、各種細胞因子、離子等生物分子的質、量進行再分配和重組, 它們包含了生物材料的全部信息, 并介導材料與細胞的作用。Ca2P 陶瓷誘導骨發生過程: Ca2P 植入機體非骨部位, 吸附內源性骨生長因子, 如BM P s 等, 誘使間充質細胞向材料內趨化、遷移——骨生長因子
作用于間充質細胞相應受體—— 經細胞信號轉導系統, 引起級聯放大效應——相關基因表達, 間充質細胞骨向分化為骨母細胞——分泌骨細胞間特異性的粘連分子(骨粘連素等) ——骨母細胞將具有類似自然骨特定化學組成和三維多孔結構的Ca2P 陶瓷錯位識別為自然骨, 停泊、黏附于其內表面——骨母細胞自分泌BM P 等生長因子, 引起自身及相應細胞分化、增殖、成熟為骨。骨誘導過程及機制的提出有一定的理論基礎, 隨后的研究也對各過程進行了一些確證。內源性BM P s存在, 骨骼、腎臟、肺等器官正常狀態下均具有分泌BM P s 的功能, 在血液中BM P s 的含量為數ng?m l,一般對間充質細胞不產生效應, 只有在一定的部位BM P s 達到一定濃度時, 才引起間充質細胞的骨向分化。鄒萍等[ 13 ]經體外實驗認為HA ?T CP 可強有力吸附BM P。Q u 等[ 14 ]通過免疫組織化學方法發現, 靠近Ca2P 陶瓷的細胞基質中有BM P22 和BM P24 的聚集, 說明磷酸鈣陶瓷對BM P 的吸附在骨誘導發生中發揮重要作用。骨誘導發生后, 推測是自分泌BM P促進新骨的繼續發生, 但此研究尚在進行中。W ang等[ 15 ]采用不同組成的HA ?TCP 雙相陶瓷與成骨細胞培養, 考察與骨改建相關Rank 基因的表達, 說明不同理化性能磷酸鈣陶瓷通過信號轉導途徑對骨形成和改建產生不同的效應。
磷酸鈣陶瓷骨誘導現象確證的研究從形態學向分子生物學水平深入, 大量研究已從光鏡(LM )
水平, 也有通過透射電鏡(TEM ) 從形態學上確證磷酸鈣陶瓷具有骨誘導性[ 16 ]。借助于現代分子生物學技術, 有研究[ 14 ] 對骨特征蛋白如é 型膠原(Co llagentypeé ) 、BM P、骨涎蛋白(O steo sialop ro tein) 等表征, 更早期地確證骨誘導的發生。
關于磷酸鈣陶瓷誘導成骨的形式, 多數研究報道為膜內成骨; Bao 等[ 17 ]觀察到材料內長入組織的形態、成分與材料的骨誘導活性相關; 骨誘導活性好的, 細胞直接骨向分化; 骨誘導活性差的, 則先形成纖維組織, 并見炎細胞浸潤, 再膜內或纖維化生形式成骨。外加BM P 或成骨細胞的成骨過程為軟骨化骨[ 18, 19 ]。有資料稱骨形成過程中, 血供不足則形成軟骨, 而血供充分則直接成骨。
1. 3 磷酸鈣陶瓷骨誘導相關因素的研究
1. 3. 1 材料學因素 用于骨誘導性研究的材料包括HA、A2TCP、B2TCP、A2TCP?HA、B2TCP?HA、(A+ B) 2TCP?HA 等磷酸鈣陶瓷, 以及磷酸鈣骨水泥、T iO 2 陶瓷和高分子材料PEO?P ET。這些材料均為多孔的, 磷酸鈣陶瓷燒結溫度1 100℃～ 1 250℃, 由濕合成Ca、P 粉料經H2O 2 發泡燒結而成。研究表明,化學組成、材料結晶度等對骨誘導性影響顯著。磷酸鈣陶瓷骨誘導性順序由高到低為: HA?B2TCP >HA?A2TCP> H
A > B2TCP> A2TCP。物理形貌如材料的孔隙率、孔徑、孔隙分布及其是否貫通等以及機械性能, 對骨誘導性影響也很大。Yuan 等[ 9, 20 ]選擇不同體系的磷酸鈣陶瓷進行動物實驗, 認為具有相互貫通的大孔, 并在大孔上有豐富的數微米至數十微米的微孔的陶瓷骨誘導性好。同時, 植入體內后,易于在孔壁表面形成類骨磷灰石(Bone likeapat ite, BLA ) , 或預先在動態SBF 中形成BLA 的磷
酸鈣陶瓷具有良好骨誘導性[ 21 ]。所以經特殊處理的T iO 2 陶瓷和高分子材料PEO ?P ET 也具有骨誘導性。BLA 層是晶體結構不完善的碳酸化磷灰石, 在表面穩定的材料上不易形成, 該結構層對骨生長因子的吸附, 間充質細胞的趨化、誘導, 骨組織細胞的黏附均起重要作用。研究表明作為骨誘導性材料, 應具有高度活性的內表面和界面, 以利細胞的黏附、停
泊, 骨誘導發生; 同時應具有相對穩定的多孔支架結構, 保證材料內骨組織的發育成熟過程中, 材料不發生塌陷。為優化選擇骨誘導性材料, 對影響骨誘導性的材料學因素仍在繼續研究中。
1. 3. 2 動物種屬 用于骨誘導性研究的動物包括大鼠、兔、山羊、狗、豬、猴、狒狒等, 同樣的磷酸鈣陶瓷在不同種屬動物中骨誘導性不同, 一些研究認為骨誘導現象易在靈長類、
家豬和犬齒類動物中發生,這可能同觀察時期長短及評價標準相關, 也可能與材料在不同動物體內物質交換、降解吸收情況不同有關, 但缺乏實驗依據。Bao 等[ 17 ]將HA、A2TCP?HA
和B2TCP?HA 三種磷酸鈣陶瓷植入大鼠、兔和狗三種動物肌內, 經統計學分析, 進一步確證磷酸鈣陶瓷骨誘導性具有材料因素和動物種屬依賴性。
1. 3. 3 骨誘導相關間充質細胞的來源 不加任何生長因子或細胞的磷酸鈣陶瓷植入動物非骨部位, 1周后材料內就觀察到骨樣細胞, 1 月后形成骨小梁, 3 月形成成熟骨。經光鏡、透射電鏡觀察到[ 16 ] , 在Ca2P 陶瓷大孔壁周環繞著毛細血管和間充質細胞, 提示誘導成骨的間充質細胞來源可能為長入材料孔隙內的毛細血管周皮細胞(pericyte)。但所來源間充質
細胞可能不只一種, 有研究經免疫組織化學推測來源于骨髓基質干細胞[ 22 ]。關于骨誘導相關間充質細胞的來源目前仍不甚確切。
1. 4 骨誘導性Ca-P 生物材料應用研究自1965 年U rist 發現骨生長因子BM P 以來, 各
國均投入大量的人力、財力對其制備和應用進行研究, 但自今仍無十分可行的方法能有效地
利用和控制BM P 的骨誘導性, 故沒有一個國家批準其正式進入臨床應用。根據ISO 1099321 對40?60 的TCP?HA進行生物學評價, 表明其具有良好的骨誘導性及生物相容性, 即通過材料自身組成和結構的優化可賦予其優良的骨誘導性, 因此避免了為獲取骨誘導性
材料而加入外源性生長因子可能引起的細胞無限增殖或惡變。20 世紀90 年代末, 張興棟[ 22 ]在骨誘導性Ca2P 陶瓷材料學特征及生物學機理研究較為成熟的基礎上, 結合組織工程發展的現狀, 提出體內組織工程的概念。包崇云等[ 23 ] 將體內骨組織工程描述為: 體內骨組織工程是應用不外加生長因子或細胞而固有骨誘導性的生物材料, 直接植入骨缺損區再生新骨, 或在不影響機體功能非骨部位的自身組織內, 構建形成含有活體組織細胞的骨替代物植入骨缺損區誘導骨再生。它與經典組織工程方法構建骨移植物不同在于: (1) 沒有使用經體外培養的細胞。 (2) 直接在機體自身環境內非病變區形成含有活體細胞的骨移植物。(3) 可構建足夠大的骨修復體, 組織長入骨誘導性Ca2P 陶瓷內部范圍是孔徑的10倍。(4) 可形成帶血管蒂的組織工程化骨移植物, 與顯微外科技術結合, 修復缺損骨。
通過體外與成骨細胞復合培養表明, 具有骨誘導性的HA ?T CP 較純HA、生物玻璃或鈦合金更能促進細胞分化、增殖和生長。體內較長時期的實驗觀察表明HA ?TCP 誘導所形成骨與
自然骨形態和結構無差異。骨誘導性HA ?T CP 直接或經過體內組織工程化骨后, 再輔與一定的骨固定技術可用于負重骨缺損修復[ 24 ]。張聰等[ 25 ]將骨誘導性HA ?T CP 用
于臨床病例骨缺損治療, 獲得良好的形態恢復和功能重建, X 片復查發現HA ?T CP 在體內有一定的降解。
2 展 望
