畢赤酵母中人Ⅲ型膠原蛋白α鏈與病毒羥脯氨酸酶的共表達(dá)

2023年12月4日發(fā)(作者：一件讓我后悔的事)

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畢赤酵母中人Ⅲ型膠原蛋白α鏈與病毒羥脯氨酸酶的共表達(dá)

史靜靜;高源;賀婧;馬曉軒

【摘 要】In order to obtain hydroxylated collagen (Hyp-containing

collagen) for satisfying the application,human collagen α1 (Ⅲ) chain in

Pichia pastoris was co-expresd with a viral prolyl 4-hydroxyla L593 in

this two recombinant plasmids pPICZB-L593 and pPIC9K-COL3A1 were constructed and trans formed into GS115 for expressing

quencing results showed that the target genes were

inrted into recombinant vectors -Time quantitative PCR

indicated that they both expresd on mR NA -PAGE and Western

Blot results further proved the successful expression of target proteins by

yproline of collagen was confirmed by amino acid

composition analysis and LC-MS/MS rearch opens up a new

possibility and provides a reference for production of hydroxylated

collagen in Pichia pastoris.%將人Ⅲ型膠原α鏈與一種來源于病毒的4-羥脯氨酸酶在畢赤酵母中共表達(dá),以獲得能滿足應(yīng)用需求的羥基化膠原蛋白.分別構(gòu)建包含酶與膠原基因的重組質(zhì)粒pPICZB-L593和pPIC9K-COL3A1,并將質(zhì)粒均轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中以表達(dá)這兩種蛋白.質(zhì)粒測序結(jié)果表明目的基因成功插入到載體中;實時定量PCR結(jié)果顯示兩種基因均在mRNA水平表達(dá);SDS-PAGE和Western Blot進(jìn)一步證實兩種蛋白在畢赤酵母GS115中的成功表達(dá);氨基酸組成分析和質(zhì)譜結(jié)果證實表達(dá)的膠原中含有羥脯氨酸.獲得羥基化的膠原蛋白.

【期刊名稱】《西北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）》 【年(卷),期】2017(047)002

【總頁數(shù)】6頁(P231-236)

【關(guān)鍵詞】共表達(dá);4-羥脯氨酸酶;人Ⅲ型膠原α鏈;羥基化

【作 者】史靜靜;高源;賀婧;馬曉軒

【作者單位】西北大學(xué)化工學(xué)院,陜西西安710069;西北大學(xué)化工學(xué)院,陜西西安710069;西北大學(xué)化工學(xué)院,陜西西安710069;西北大學(xué)化工學(xué)院,陜西西安710069

【正文語種】中 文

【中圖分類】Q3

膠原作為人體中含量最豐富的蛋白,以其低免疫原性和相容性等特點被人們所青睞。傳統(tǒng)的膠原獲得方式是從動物骨頭及牛皮中提取,這種方式存在一定的安全風(fēng)險[1]。高效、低成本的重組表達(dá)膠原蛋白的方式成為一種趨勢。為了提高重組表達(dá)膠原的熱穩(wěn)定性,需要對其進(jìn)行修飾,其中包括將脯氨酸(Pro)羥基化為羥脯氨酸(Hyp)[2]。在一些真核表達(dá)體系如畢赤酵母中,盡管具有翻譯后修飾的功能,但因缺少羥脯氨酸酶(P4H)而無法實現(xiàn)膠原的羥基化。很多研究證實可以通過膠原與P4H共表達(dá)的方式獲得羥基化的膠原[3]。在人類和其他脊椎動物中，羥脯氨酸酶P4H是一個α2β2異源四聚體[4]。在這個多聚酶復(fù)合物中，59 kDa 的α亞基是催化亞基，擁有催化的活性位點和底物結(jié)合位點[5-6]；55 kDa 的β亞基又稱為二硫鍵異構(gòu)酶PDI，作為P4H的一個亞基，它的功能是維持α亞基以一個有催化活性的，非聚集的結(jié)構(gòu)的狀態(tài)存在[7]。P4H的活性發(fā)揮依賴于一些輔因子如α-酮戊二酸、O2、二價鐵離子等。在反應(yīng)過程中，α-酮戊二酸被氧化發(fā)生脫羧反應(yīng)生成CO2和琥珀酸[8]。

動物的P4H 由于復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和低活性限制了其應(yīng)用[9], 植物和病毒的P4H大多為單體多肽, 而且能催化富含脯氨酸的多肽鏈。 然而， 植物的P4H主要以多聚的L-脯氨酸或者類似的序列為底物, 而非類似人膠原中的Gly-X-Y 重復(fù)單元[10]。 有研究報道, 微生物的P4H具有羥基化膠原的能力。 Pozzolini M等成功利用海綿的P4H催化前膠原的羥基化, 羥脯胺酸含量達(dá)到36.3% [11]; Eriksson M等研究發(fā)現(xiàn)來源于藻類病毒PBCV-1的P4H被證實其與動物P4H的α亞基存在序列相似性, 能催化多種底物[12]。

因此,本研究選用微生物的P4H催化前膠原的羥基化。Rutschmann C研究報道了在大腸桿菌中將擬病毒的P4H(L593)與38 kDa 的膠原鏈共表達(dá),獲得羥基化的膠原蛋白,其羥基化率較高[9]。本研究將人Ⅲ型膠原全長α鏈(COL3A1)與L593在畢赤酵母中共表達(dá),探索畢赤酵母中病毒P4H(L593)催化人Ⅲ型膠原全長α鏈的可行性,并對共表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定以及確定脯氨酸羥基化的位點。期待尋找到更簡便、更有利于放大生產(chǎn)的膠原羥基化途徑。

1. 1 材 料

1. 1. 1 菌種及細(xì)胞株 感受態(tài)大腸桿菌DH5α購于天根公司;pPIC9K， pPICZB 質(zhì)粒及GS115購于Invitrogen公司;pUC19-L593 質(zhì)粒由上海生工提供;pBV220-COL3A1質(zhì)粒本實驗室已成功構(gòu)建。

1. 1. 2 主要試劑 膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購于Solarbio公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I，Not I，Kpn I，Sal I，Sac I購于New England Biolabs公司;T4

DNA連接酶和其他DNA操作酶購于TaKaRa公司;RNA提取試劑盒、與實時定量PCR相關(guān)的試劑盒購于TaKaRa公司;與Western Blots分析相關(guān)的試劑均購于天根公司。

1. 2 方 法 1. 2. 1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 為了構(gòu)建pPIC9K-COL3A1和 pPICZB-L593 重組質(zhì)粒,不含N端和C端多肽的人Ⅲ膠原全長α鏈(Gene Bank: BC028178.1)與18-743 擬病毒的P4H L593(NCBI Reference Sequence: NC-014649.1)通過PCR擴(kuò)增。用于擴(kuò)增COL3A1 的引物為5′-CGCGAGAATTCAAGCTCAGTATG-3′(上游引物)和5′-TTAAGCGGCCGCATTTCGTGGT-3′(下游引物)。PCR得到的產(chǎn)物與pPIC9K質(zhì)粒均用EcoR I-Not I 雙酶切再連接得到重組質(zhì)粒pPIC9K-COL3A1。用于擴(kuò)增L593的引物為5′-CCCGGTACCATGAAAACTGTGACT-3′(上游引物)和5′-CAAGCGGCCGCGGAAAATTTTCGTT-3′(下游引物)。類似地,PCR 產(chǎn)物與pPICZB 均用Kpn I 和 Not I 雙酶切再連接得到質(zhì)粒pPICZB-L593。將這兩種質(zhì)粒均轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。重組質(zhì)粒構(gòu)建如圖1所示。

1. 2. 2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 第一步電轉(zhuǎn):利用電轉(zhuǎn)儀ECM 630(BTX,USA)將10 μL Sal

I線性化的重組質(zhì)粒pPIC9K-COL3A1轉(zhuǎn)入100 μL 感受態(tài)酵母細(xì)胞GS115中,電轉(zhuǎn)條件為1.5 kV，50 μF，200 Ω。電轉(zhuǎn)結(jié)束后立即加入1 mL 冰浴的1.0 mol/L山梨醇,在30℃條件下孵育1 h;然后移取50 μL上清液涂于MD 平板(1.34%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))YNB,2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖,4×10-5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生物素),將MD平板上的克隆子分別復(fù)制到含有1.0，2.0 和4.0 mg/mL G418的YPD平板上,29℃條件下培養(yǎng)3天后篩選高拷貝數(shù)的陽性轉(zhuǎn)化株。第二步電轉(zhuǎn):篩選的高拷貝菌株為感受態(tài)細(xì)胞,Sac I 線性化的質(zhì)粒pPICZB-L593 按照之前的方式進(jìn)行電轉(zhuǎn),分別在0.5，1，2

mg/mL博萊霉素的YPDs平板上篩選不同拷貝數(shù)的陽性菌株。

1. 2. 3 蛋白的表達(dá)與實時定量PCR分析 挑取編號為 1#，2#，3#，4# (1# 不含有pPICZB-L593質(zhì)粒)的單克隆菌株于5 mL YPD培養(yǎng)基中,220r/min，30℃培養(yǎng)12 h;取1 mL培養(yǎng)液離心,去除上清,將菌體轉(zhuǎn)移至25 mL BMGY 培養(yǎng)基中,30℃，220r/min培養(yǎng)至細(xì)胞OD600達(dá)到2～8時,收集菌體,將菌體重懸稀釋至OD600

為1.0并轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)蛋白表達(dá);每隔24 h取樣并向BMMY培養(yǎng)液中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲醇及0.5 mmol 的L-抗壞血酸,1 mmol的

FeSO4·7H2O。

為了實時檢測基因在mRNA水平的表達(dá),利用TRNzol 試劑盒從各個菌株中提取RNA,并用Thermo Scientific Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR 反應(yīng)在CFX96 實時定量PCR檢測系統(tǒng)中的96孔板中(Bio-Rad)進(jìn)行,每個孔中加入7.5 μL Maxima SYBR Green qPCR Master Mix，0.5 μL 引物，1.2 μL cDNA(稀釋過的)和5.8 μL去離子水。熱循環(huán)過程為:95℃ 10

s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,循環(huán)40 圈后 95℃ 10 s,65℃ 30 s結(jié)束。溶解曲線分析按照CFX96系統(tǒng)生成的程序進(jìn)行,獲得CT值后用2-ΔΔCT 法(參照文獻(xiàn)[13])計算基因的相對表達(dá)水平,在酵母中穩(wěn)定表達(dá)的 His3 基因作為計算時的內(nèi)參比基因。

1. 2. 4 SDS-PAGE與Western-Blot分析 以分離膠濃度為12%(體積分?jǐn)?shù))的SDS-PAGE檢測樣品,SDS-PAGE膠上的蛋白分子量大小通過對比Marker(PageRulerTM Unstained Protein Ladder,Thermo Scientific)確定。蛋白純度由Quantity One software分析。將SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)到PVDF膜上,封閉過夜后加入His抗體, 37℃孵育5 h;用PBST洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育2 h,洗膜后進(jìn)行顯色反應(yīng)(注意避光)。

1.2.5 氨基酸組成分析 按照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測定》方法測定,所用儀器為日本日立公司生產(chǎn)的L-8900型氨基酸自動分析儀。樣品處理過程:稱取樣品200 mg于消化管中,加入10 mL 6 mol/L鹽酸(優(yōu)級純),超聲2 min,氮氣吹掃2 min,封口,稱取消化管重量m1;將消化管置于110℃烘箱22 h,冷卻后取出,稱重得m2,若m2小于m1,則用6 mol/L鹽酸補(bǔ)差重。混勻后,用0.45 μm無機(jī)濾膜過濾,取濾液200 μL于小試管中,氮氣60℃吹干,加入5 mL 0.02 mol/L鹽酸復(fù)溶,溶液再用0.45 μm無機(jī)濾膜過濾即可。

1. 2. 6 LC-MS/MS質(zhì)譜檢測 將 SDS-PAGE膠上110 kDa 的蛋白條帶切下并送至北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜檢測。

2. 1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

圖2A和圖2B分別對應(yīng)重組質(zhì)粒pPICZB-L593與pPIC9K-COL3A1的質(zhì)粒大提后的瓊脂糖凝膠電泳圖。pPICZB-L593的理論大小約為4.0 kb,圖中的電泳條帶與DNA Marker IV對比發(fā)現(xiàn)符合其理論值。COL3A1的基因大小約為3069 bp,插入到pPIC9K上后重組質(zhì)粒大小約為12.3 kb。圖2B中的電泳條帶遠(yuǎn)大于7000

bp,是pPIC9K-COL3A1重組質(zhì)粒條帶。以上結(jié)果表明兩種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2. 2 實時定量PCR分析

實時定量PCR結(jié)果可以反映目的基因在mRNA水平的表達(dá)。來自于4種菌株的L593與COL3A1基因的平均CT 值列于表1中。CT 值與酵母基因組中整合的DNA拷貝數(shù)有關(guān),拷貝數(shù)越高,CT 值越低[14]。在以2-ΔΔCT計算時,將不含P4H的1 # 菌株基因表達(dá)量設(shè)定為1。表1的數(shù)據(jù)顯示這4種菌株均能夠表達(dá)外源蛋白,而且隨著基因拷貝數(shù)的增加,2#，3#，4#菌株中L593蛋白的表達(dá)量依次增加,這是由于多拷貝的重組子有助于提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。同時,這4種菌中COL3A1的表達(dá)水平差異不大,這可能是由于它們含有接近的COL3A1基因拷貝數(shù)。

2. 3 SDS-PAGE及Western-Blot 分析結(jié)果

不同菌株培養(yǎng)72 h后提取的胞內(nèi)蛋白的電泳結(jié)果如圖3所示。從圖3可觀察到COL3A1的表觀分子量大約為110 kDa,由2#，3#，4#菌株表達(dá)的L593 蛋白約是27 kDa,與Western Blot(WB)的結(jié)果相符合。同時，隨著基因拷貝數(shù)的增加L593蛋白的表達(dá)量也在增加(這與實時定量PCR分析結(jié)果一致),且4#菌株中蛋白的降解明顯低于2#和3#菌株(目標(biāo)條帶下方大部分為其降解產(chǎn)物),這可能是由于高的羥基化率可以減弱蛋白肽鏈的降解。

2. 4 氨基酸組成分析 將來源于4#菌株的COL3A1蛋白水解并進(jìn)行氨基酸組成分析,根據(jù)保留時間的不同可以分別檢測出羥脯氨酸與脯氨酸。圖4表示由4#菌株表達(dá)的COL3A1的氨基酸分析圖。從圖4及表2中可以看到Hyp 的保留時間是4.927min (箭頭所指), 而脯氨酸是9.087min。按照Hyp與Pro峰高的比值計算出本研究表達(dá)的COL3A1羥基化率為35%。結(jié)果表明通過將膠原與擬病毒的P4H(L593)共表達(dá)可以獲得羥基化的膠原,這也證明L593在酵母中也能以可溶的、有活性的狀態(tài)存在。這種羥基化的實現(xiàn)可能是由于L593的催化部位與動物P4H的α亞基的活性部位具有相似性。

2. 5 LC-MS/MS質(zhì)譜分析

通過對比UniProt(P02461,COL3A1)數(shù)據(jù)庫,63%的序列覆蓋率(圖未示出)證實該蛋白為COL3A1蛋白,而且質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)一步證實了Hyp的存在。表3中列出了兩條序列相同、分別來自于未羥基化的COL3A1(A肽鏈)和本研究表達(dá)的羥基化的COL3A1(B肽鏈),這兩條肽鏈的分子量分別2055.094632 Da和2087.082612 Da。

由于在分子量上羥脯氨酸正好比脯氨酸大16 Da[15],而這兩條肽鏈剛好相差32

Da,這說明 B肽鏈的兩個脯氨酸位點被羥基化。在表3分子量發(fā)生變化的位點已被灰體標(biāo)出,從表中可以看到GSPGAQGP*P*GAPGPLGIAGITGAR序列中y16和y17號的脯氨酸發(fā)生羥基化,并且與人源的P4H不同的是,L593對G-X-Y 重復(fù)三聯(lián)體中的X或Y位置的脯氨酸沒有偏好性。

本研究成功將來源于擬病毒的羥脯氨酸酶 L593與人Ⅲ型膠原全長α鏈基因在畢赤酵母中共表達(dá)。實時定量PCR分析結(jié)果顯示兩種基因均在mRNA 水平表達(dá);SDS-PAGE 和 Western Blot 結(jié)果進(jìn)一步證實兩種蛋白在畢赤酵母GS115中的成功表達(dá);氨基酸組成分析和LC-MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果表明共表達(dá)的膠原中含有羥脯氨酸,膠原蛋白成功被羥基化,并且羥基化率達(dá)到35%。

一般地,理論上動物的P4H為膠原羥基化最適的酶,但它的形成比較復(fù)雜,活性易受外界環(huán)境的影響,不適合應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)羥基化的重組膠原。而病毒的P4H結(jié)構(gòu)簡單、活性穩(wěn)定,并且與動物P4H存在序列相似性,其可以成為一種較理想的選擇。本研究證實了人Ⅲ膠原全長α鏈與病毒的P4H在畢赤酵母中共表達(dá)可以實現(xiàn)膠原蛋白的羥基化。這為膠原蛋白的羥基化提供了新的途徑方法,也為羥基化重組膠原的放大生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。后續(xù)工作還可以通過基因優(yōu)化、啟動子優(yōu)化以及培養(yǎng)條件優(yōu)化進(jìn)一步提高膠原的羥基化率以接近人源P4H的羥基化水平。

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