畢赤酵母表達操作手冊(精譯版)

2023年12月4日發(作者：縛心)

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畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒

畢赤酵母多拷貝表達載體試劑盒

用于在含多拷貝基因的畢赤酵母菌中表達并分離重組蛋白

綜述：

基本特征：

作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達系統的許多優點：如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。不僅如此，操作時與及釀酒酵母同樣簡單。它比桿狀病毒或哺乳動物組織培養等其它真核表達系統更快捷、簡單、廉價，且表達水平更高。同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優點，且它的外源蛋白表達水平是后者的十倍以至百倍。這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達系統。

與釀酒酵母相似技術：

許多技術可以通用：

互補轉化 基因置換 基因破壞 另外，在釀酒酵母中應用的術語也可用于畢赤酵母。例如：HIS4基因都編碼組氨酸脫氫酶；兩者中基因產物有交叉互補；釀酒酵母中的一些野生型基因與畢赤酵母中的突變基因相互補，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在畢赤酵母中都有各自相互補的突變基因。

畢赤酵母是甲醇營養型酵母：

畢赤酵母是甲醇營養型酵母，可利用甲醇作為其唯一碳源。甲醇代謝的第一步是：醇氧化酶利用氧分子將甲醇氧化為甲醛，還有過氧化氫。為避免過氧化氫的毒性，甲醛代謝主要在一個特殊的細胞器－過氧化物酶體－里進行，使得有毒的副產物遠離細胞其余組分。由于醇氧化酶與O2的結合率較低，因而畢赤酵母代償性地產生大量的酶。而調控產生醇過氧化物酶的啟動子也正是驅動外源基因在畢赤酵母中表達的啟動子。

兩種醇氧化酶蛋白：

畢赤酵母中有兩個基因編碼醇氧化酶－AOX1及AOX2。細胞中大多數的醇氧化酶是AOX1基因產物。甲醇可緊密調節、誘導AOX1基因的高水平表達，較典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分離，含AOX1啟動子的質粒可用來促進編碼外源蛋白的目的基因的表達。AOX2基因與AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中帶AOX2基因的菌株比帶AOX1基因菌株慢得多，通過這種甲醇利用緩慢表型可分離Muts菌株。

表達：

AOX1基因的表達在轉錄水平受調控。在甲醇中生長的細胞大約有5%的polyA+

RNA來自AOX1基因。AOX1基因調控分兩步：抑制/去抑制機制加誘導機制。簡單來說，在含葡萄糖的培養基中，即使加入誘導物甲醇轉錄仍受抑制。為此，用甲醇進行優化誘導時，推薦在甘油培養基中培養。注意即使在甘油中生長（去抑制）時，仍不足以使AOX1基因達到最低水平的表達，誘導物甲醇是AOX1基因可辨表達水平所必需的。

AOX1突變表型：

缺失AOX1基因，會喪失大部分的醇氧化酶活性，產生一種表型為Muts的突變株（methanol utilization slow），過去稱為Mut，而Muts可更精確地描述突變子的表型。結果細胞代謝甲醇的能力下降，因而在甲醇培養基中生長緩慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。這兩種表型用來檢測外源基因在畢赤酵母轉化子中的整合方式。

蛋白胞內及分泌表達：

外源蛋白可在畢赤酵母胞內表達或分泌至胞外。分泌表達需要蛋白上的信號肽序列，將外源蛋白靶向分泌通路。幾種不同的分泌信號序列已被成功應用，包括幾種外源蛋白本身分制作者：陳苗 商漢橋

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泌信號序列，利用釀酒酵母α因子前原肽信號序列也獲得許多成功。

分泌表達外源蛋白的最大優點是：畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上畢赤酵母最小生長培養基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養基中蛋白的主要組成成份，也可算作蛋白純化的第一步。注意，如果外源蛋白一級結構中有可識別的糖基化位點（Asn-X-Ser/Thr）,則這些位點可能發生糖基化。

翻譯后修飾：

與釀酒酵母相比，畢赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有優勢，因為不會使其過糖基化。釀酒酵母與畢赤酵母大多數為N-連接糖基化高甘露糖型，然而畢赤酵母中蛋白轉錄后所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14個甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50-150個甘露糖殘基）短得多。

另外，釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒有。一般認為釀酒酵母中糖基化蛋白的α-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關，使得這些蛋白不適于治療應用。雖然未經證明，但這對畢赤酵母產生的糖蛋白不構成問題，因為畢赤酵母表達蛋白與高級真核生物糖蛋白結構相似。

選擇載體用于基因多拷貝整合：

在某些情況下，畢赤酵母中重組基因多拷貝整合可增加所需蛋白的表達量。該試劑盒中的三個載體均可用于在體內（pPIC3.5K, pPIC9K）或體外（pAO815）產生并分離多拷貝插入，同時可檢測增加重組基因的拷貝數是否增加蛋白表達量。體內整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產生外源基因的串聯插入。pPIC3.5K,

pAO815用于胞內表達，而pPIC9K用于分泌表達，所有載體均利用AOX1啟動子來誘導高水平表達。

多拷貝插入頻率：

畢赤酵母His+轉化子高拷貝整合事件自發發生的概率為1－10%，體內方法可篩選可能插入多拷貝外源基因的His+轉化子，體外方法可通過連接構建多拷貝子。當選擇His+轉化子時，它們中插入體外構建結構多聚體的概率很高。

體內多拷貝插入的產生：

Ppic3.5k及Ppic9k含有細菌kan基因，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性，注意Kan并不賦予畢赤酵母卡那霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴整合的kan基因的數目。單拷貝Ppic3.5k或Ppic9k整合入畢赤酵母基因組后，賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。任何載體多拷貝整合可增加遺傳霉素抗性水平，從0.5mg/ml（1-2拷貝）到4mg/ml（7-12拷貝）。由于kan基因與表達盒（pAOX1及目的基因）之間有遺傳連鎖，可從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數。由于基因的劑量效益，蛋白的表達可能會增加。因此，kan基因可檢測轉化子是否含有多拷貝目的基因。下圖顯示多拷貝插入及kan基因與表達盒的連鎖。

制作者：陳苗 商漢橋

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遺傳霉素直接選擇：

在酵母中對遺傳霉素抗性進行直接選擇并不十分有效，因為新轉化的細胞需要時間表達足夠量的抗性因子。由于酵母生長比細菌慢得多，大部分重組酵母在積累足夠多的抗性因子

以抵抗平板上抗生素之前就已經被殺死了。最有效的篩選遺傳霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先對HIS＋轉化子進行選擇，再進行不同水平遺傳霉素抗性篩選。

雖然可以用電泳進行直接篩選，但用在遺傳霉素篩選之后再進行電泳篩選，獲得含高拷貝克隆的機會更大，大約可獲得5-9拷貝的克隆，而直接電泳選擇只能獲得平均為1-3拷貝的克隆。原生質轉化時不能用遺傳霉素直接選擇。

體外多拷貝插入的產生：

下圖顯示如何產生多表達盒插入載體以轉化畢赤酵母。目的基因插入獨個EcoRI位點

后，產生的表達盒（pAOX1及目的基因）上下游側翼分別為獨個的BglII及BamHI位點。

含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分離表達盒，表達盒再插入BamHI位點以產生串聯重復表達盒，重復該插入程序可產生一系列含單個HIS4基因及逐漸增加數目表達盒的載體。

用體外形成的多拷貝子轉化畢赤酵母增加了多拷貝表達盒重組子出現的頻率，可設計包含一特定數目多拷貝插入的畢赤酵母重組子。

轉化及整合：

可產生兩個不同表型的His+重組菌株：質粒DNA線性化位置不同，轉化GS115后可產生兩種轉化子His+Mut+及His+Muts。KM71只產生His+Muts，因為該菌株為Muts表型。兩種重組子Mut＋及 Muts都是有用的，因為一個表型可能比另一個表型更有利于蛋白表達。理想條件下，每一個表型應該檢測6-10個重組子。沒有辦法預測哪個結構或克隆更利于蛋白表達。強烈推薦用PCR分析重組子來證實整合情況。

成功將基因構建至AOX1啟動子下游后，線性化質粒轉化畢赤酵母時激發重組。下圖顯示用不同酶消化時產生何種重組子。

限制酶

SalI或StuI

SacI

BglII

插入事件

插入his4

插入5’AOX1

取代AOX1

GS115表型

His+Mut+

His+Mut+

His+Muts

KM71表型

His+Muts

His+Muts

His+Muts（不推薦）

制作者：陳苗 商漢橋

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表達及擴大培養：

用PCR證實畢赤酵母重組后，可檢測His+Mut+及 His+Muts的表達。小規模培養每個重組子，用甲醇誘導，檢測時間點.如果是胞內表達，每個時間點細胞沉淀用SDS-PAGE分析;如果是分泌表達，分析每個時間點的細胞及上清。如果有蛋白的抗體，推薦既用考馬斯亮藍染色又用western blot分析SDS-PAGE凝膠。如果可以,建議檢測蛋白活性。因為并不是所有蛋白都能達到g/l的水平，所以建議進行western blot或活性分析，不要僅做SDS-PAGE考馬斯亮藍染色分析。

如何選擇最佳的表達蛋白畢赤酵母菌株及優化誘導見P49-50。如表達已達最優，大規模表達以產生更多蛋白。

制作者：陳苗 商漢橋

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方法

畢赤菌株表型：

畢赤酵母菌GS115及KM71在組氨酸脫氫酶位點（His4）有突變,因而不能合成組氨酸，所有表達質粒都有HIS4基因可與宿主進行互補，通過不含組氨酸的培養基來選擇轉化子。

GS115及KM71自發回復突變到His＋原養生物機率小于1/108。

KM71的親本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突變，在不含精氨酸的培養基中不能生長。用野生型ARG4基因破壞AOX1基因后，產生KM71 MutsArg+His-菌株。

GS115及KM71都可在復合培養基如YPD（YEPD）及含組氨酸的最小培養基中生長。轉化之前，GS115及KM71都不能在最小培養基中生長，因為它們是His-。

KM71結構：

ARG4基因（約2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密碼子)及SalI(AOX1基因227/228密碼子)位點。ARG4取代了AOX1基因16－227密碼子。此結構轉化至KM71親本菌（arg4his4）中,分離Arg+轉化子并分析Muts表型。Arg+轉化子遺傳分析顯示野生型AOX1被aox1::ARG4結構所取代。

重點：

用KM71的優點是，不需要在甲醇最小培養基中篩選Mut表型。所有轉化子都是Muts表型。第二，AOX1位點沒有被完全缺失，理論上可用你的目的結構通過基因取代方法替換aox1::ARG4結構，這樣重組菌株的表型是His+MutsArg-，這意味著重組菌株生長時需精氨酸。不幸的是，僅添加精氨酸并不能完全緩和arg4突變的影響，arg4菌株在含精氨酸的最小培養基中不能很好地生長。因此不推薦在KM71中通過取代aox1::ARG4結構來獲得His＋轉化子。

菌株表達對照：

GS115/His+Muts 白蛋白：該菌株為篩選畢赤酵母分泌表達轉化子與Muts表型時的對照。血清白蛋白基因及其自身分泌信號被整合進畢赤酵母AOX1位點。該菌株可分泌白蛋白（67kDa）到培養基中，分泌水平＞1g/l。

GS115/His+Mut+ β－半乳糖苷酶：該菌株為篩選畢赤酵母轉化子胞內表達與Mut+表型時的對照。β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合進畢赤酵母his4位點，該菌株表達β－半乳糖苷酶（117 kDa），達到通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色或ONPG分析可測水平。

畢赤酵母菌株生長：

畢赤酵母生長溫度為28-30度（液體、平板、斜面）。在32度以上誘導生長時，對蛋白表達有害，甚至會導致細胞死亡。

另外注意點有：

1在YPD中，處于對數期的Mut+、Muts畢赤酵母倍增時間為2小時

2除了在甲醇中生長速度不同外，Mut+、Muts生長速度沒有差別

3甲醇培養基（MM）中，處于對數期的Mut+倍增時間為4-6小時

4甲醇培養基（MM）中，處于對數期的Muts倍增時間為18小時

51OD600=5×107細胞/ml

注意：生長特性依重組菌株不同而不同

制作者：陳苗 商漢橋

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在甲醇中生長：

當使用甲醇平板或培養基培養時，建議每天添加甲醇以補償甲醇揮發及消耗。

1平板培養時，在倒置平板蓋中加入100ul 100%甲醇

2液體培養時，加入100%甲醇至終濃度為0.5%

3部分研究者在進行液體培養時，對Muts菌株每天加甲醇至濃度為1%，對Mut+菌株每天加甲醇至濃度為3%時，對液體培養沒有不良影響。

貯存：貯存細胞幾周或幾月，用YPD培養基或YPD瓊脂斜面

1挑取所需菌株單克隆在YPD平板上劃線生長

2挑取單克隆轉移至YPD進行穿刺培養，30度2天

3細胞在4度可放幾周

幾月或幾年，存于－80度

1挑取所需菌株單克隆在YPD中過夜培養

2收集細胞，在含15%甘油的YPD中懸浮至終OD600為50-100（大約2.5-5.0×109細胞/ml）

3細胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰凍再貯存于-80度。

注意：在4度或－80度長期保存后，用之前建議在MM、MD或MGY平板上劃線培養以檢測His+轉化子的表型是否正確及其活力。

大腸桿菌菌株：

大腸桿菌菌株表型：提供 Top10F’以防沒有合適的菌株。其它合適的菌株為DH5αF’，JM109或其它重組缺失菌株（recA），最好是endA，及帶有選擇性的F’附加體。Top10F’適用于重組及單鏈拯救。

如果不需進行單鏈DNA拯救，也可用不含F’附加體的大腸桿菌菌株。

建議：建議凍存Top10F’

1在5ml含50－100mg/ml四環素的LB中培養Top10F’過夜

2取0.85ml培養液加0.15ml滅菌甘油完全混勻

3轉入凍存瓶中，凍在液氮或干冰/酒精浴中

4存于－80度

選擇畢赤酵母表達載體：

選擇載體：如果目的蛋白是細胞溶質型且是無糖基化蛋白，可選擇胞內表達蛋白。如果目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞內細胞器內，可嘗試分泌表達目的蛋白。

建議用體內及體外方法產生并分離外源基因多拷貝插入子。無法預測哪種方法適用于你的蛋白，每種方法的優缺點如下：

體外方法 pAO815

優點

可構建特定數目的多拷貝子

大多數His＋轉化子含有正確的特定數目插入

篩選多插入子很容易，因為大部分His＋轉化子含有多拷貝目的基因

體外構建可以分析拷貝數對蛋白表達的影響

多拷貝插入位于單一位點

載體上無需另外的藥物抗性標記

缺點

克隆特定數目多拷貝子需要更多工作

載體可能會很大，與基因大小及插入拷貝數有關

在中可能會發生重排

制作者：陳苗 商漢橋

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體外方法 Ppic3.5k或Ppic9k

優點

開始實驗比較容易，轉化畢赤酵母前載體中只需克隆單拷貝基因

1-10%的His＋轉化子有自發的多拷貝插入

載體平均大小與其它畢赤酵母表達系統相似

多拷貝插入位于單一位點

缺點

定量篩選－遺傳霉素抗性并不一定與基因拷貝數相關

篩選His＋轉化子需要做很多工作，因為要從成千上萬個His＋轉化子中才能篩選到足夠多的遺傳霉素抗性克隆進行檢測

多拷貝插入的數目不知（盡管可用southern 或dot blot分析方法進行檢測）

遺傳霉素篩選對細胞密度敏感，可能會分離到假陽性

特點：下表顯示畢赤酵母多拷貝表達載體的一般特點及優點：

特點

5‘AOX1

段

α-factor

信號序列

MCS

TT

HIS4

編碼α因子信號序列的269bp，用于畢赤酵母分泌表達（只能用于Ppic9k）

多克隆位點

描述

含AOX1啟動子的約1000bp片優點

畢赤酵母中可實現甲醇誘導的高水平表達

分泌所需蛋白至培養基中

在表達載體中插入目的基因

AOX1基因自帶的轉錄終止及mRNA有效的轉錄終止及多聚腺polyA信號（約260bp） 苷酸化

畢赤酵母野生型基因編碼組氨為選擇畢赤酵母重組菌株提供選酸脫氫酶（約2.4kb），用于與畢赤酵擇標記

母his4菌株進行互補

AOX1基因序列，在TT3‘遠端序列（約650bp）

Amp抗性基因

復制起始

質粒靶向整合進AOX1基因

用于選擇、復制及維護

3‘AOX1

Amp

pBR322復制起點

BamHI

BglII

NotI

SacI

SalI

StuI

Kan

單一酶切位點 可線性化載體，使有效插入畢赤（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不酵母基因組產生Mut+或Muts重組子

是唯一的）

來自Tn903的卡那抗性基因，賦通過增加的抗遺傳霉素抗性，可予卡那基因抗性，賦予畢赤酵在體內篩選多拷貝插入子

母遺傳霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k） 在大腸桿菌中篩選Kan抗性菌株

在該試劑盒中，任何畢赤酵母表達載體都沒有酵母復制起始位點。只有當質粒與畢赤酵母基因組發生重組時，才能分離到HIS＋轉化子。

Ppic9k：含卡那基因，體內篩選多拷貝子插入，分泌重組蛋白至培養基中。在GS115及KM71中有功能。

制作者：陳苗 商漢橋

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1 9276bp融合載體

2 在α-factor分泌信號閱讀框中含有用于克隆的4個單限制酶位點。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI

3 α-factor分泌信號分泌表達目的蛋白。表達時，目的基因必須克隆進信號序列起始密碼的讀碼框中

畢赤酵母HIS4篩選

GS115或KM71，在AOX1基因處插入，用SacI線性化（對于GS115產生His+Mut+，對于KM71產生His+Muts）

在HIS4位點插入，用SalI線性化（對于GS115產生His+Mut+，對于KM71產生His+Muts）

在GS115菌株中，替換AOX1基因，用BglII線性化（產生His+Muts）

克隆進畢赤酵母多拷貝表達載體：

介紹：下面列出用這些載體進行克隆策略時應考慮的方針。考慮位點，如用Ppic9k載體，應考慮將目的基因克隆進α-factor信號序列讀碼框中。

建議將3個超螺旋畢赤酵母表達載體轉化，以便長期保存。

1用滅菌水或TE緩沖液稀釋1ul質粒（1ug/ul）至10-100pg/ul

2取1-2ul稀釋質粒轉化感受態，在含50-100 ug/mlAmp的LB平板上選擇

一般考慮：下面是應用pAO815、 Ppic3.5k或Ppic9k時的一般考慮

1畢赤酵母的密碼偏愛與釀酒酵母相同，已證明許多釀酒酵母中基因在畢赤酵母中有交叉功能

2應在含recA, endA突變的菌株如Top10F’中構建質粒

3AOX1mRNA的5‘末端在各多克隆位點都已標注出。如需分析RNA，可計算插入基因mRNA的大小

4插入基因的終止密碼子或3‘AOX1序列可使翻譯有效終止，3‘AOX1序列終止密碼已標注出

制作者：陳苗 商漢橋

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5在畢赤酵母及其它真核系統中均發現了“AT富含區”導致的轉錄提前終止。如果表達蛋白時出現問題，應檢查是否是提前終止及AT富含區。如要表達基因則需改變基因序列。

6Ppic9k中預測的蛋白酶裂解位點如圖（p28）所示

7插入成熟基因的開放閱讀框，應克隆進α-factor信號序列讀碼框的下游

一般克隆策略：

1連接適合的限制性片段

A直接插入MCS上兩個不同位點

B利用相同的限制性末端，將片段連入單個合適位點

2PCR擴增插入基因以產生合適的用于連入合適載體的限制性末端

3擴增含目的基因片段通過TA克隆盒進行直接克隆，再將合適的片段亞克隆進所選擇載體

克隆程序：

注意：如果你要插入pAO815上EcoRI位點，而基因中也含有EcoRI位點，我們建議：

1BsaI可識別以下的限制性識別位點：

5‘GGTCTCN/

3‘CCAGAGNNNNN/

2將EcoRI位點改造成BsaI可識別位點

5‘GGTCTCG/AATTC……

3‘CCAGAGCTTAA/G……

3將該序列通過PCR整合進DNA片段中，或在體外制造其它限制性位點的適配子接頭

4用BsaI消化PCR產物或適配連接產物，這樣不用EcoRI消化就可產生EcoRI的限制性末端。

信號序列加工：Ppic9k中α-factor成熟信號序列加工分兩步：

1KEX2基因產物初步切割信號序列，在 Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星號位置即arg及glu之間出現Kex2斷裂

2STE13基因產物接著切割Glu-Ala重復序列

優化信號切割：釀酒酵母中，Glu-Ala重復序列并不是Kex2切割時的必需序列，但Glu-Ala重復序列可使該切割更有效。

Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有許多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小氨基酸及組氨酸。但脯氨酸會抑制Kex2的切割。

許多情況下，Stel13切割Glu-Ala重復片段效率不高，Glu-Ala重復序列就留在了表達的目的蛋白的N端，這一般與目的蛋白本身性質有關。

細菌轉化：一旦確定克隆策略，在進行連接反應前應制備好感受態，可參考電感受態或化學感受態方法或使用本實驗室實驗程序。

Ppic9k的pAOX1及MCS:

特殊考慮：

1目的片段必須克隆進分泌信號序列開放閱讀框中

2信號序列中含ATG，翻譯從離mRNA5‘端最近的一個ATG開始

3如果插入片段中有BglII位點，畢赤酵母轉化時，可選取其它限制性位點來線性化質粒(P30)

制作者：陳苗 商漢橋

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轉化：

介紹：連接反應之后，要通過化學或電轉的方法轉化感受態細胞(Top10F’或相似菌株)

轉化分析：

1轉化后，將轉化混合物涂在含50-100ug/ul Amp的LB平板上，選擇Amp抗性克隆

2挑取10個Amp抗性轉化子，接種含50-100ug/ul Amp的培養基，37度振蕩培養過夜

3小量制備分離質粒DNA用于分析及測序。pAO815或pPIC3.5k測序時，用5‘AOX1及3‘AOX1測序引物；pPIC9k測序時，用α-factor引物及3’AOX1測序引物。將引物重懸于20ul滅菌水中，制成0.1ug/ul溶液。

4在0.85ml過夜培養菌液中加入0.15ml滅菌甘油，以便保存所需克隆，渦旋混勻轉入標記好的儲存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷凍后移入-70度保存。

5測序證實結構正確后，可準備轉化DNA

重組克隆測序：強烈建議轉化畢赤酵母前進行測序

1正確讀碼框(分泌表達)

2真核翻譯起始所需的ATG正確的上下文

制作者：陳苗 商漢橋

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克隆基因后：克隆進pAO815后，需在體外構建多插入子

如果克隆進Ppic3.5k或Ppic9k，可準備將質粒DNA轉入畢赤酵母。轉p28

準備轉化DNA：你應該已經獲得正確插入目的基因的畢赤酵母表達載體質粒，以用于表達。下表列出下階段應做的實驗。

步驟

1

2

3

4

5

6

7

8

實驗

準備轉化用DNA

GS115或KM71用于制備去壁細胞

DNA轉化GS115或KM71

選擇His+轉化子

如果將基因克隆進Ppic3.5k或Ppic9k，篩選His+轉化子的遺傳霉素抗性

證實重組菌的Mut+Muts表型

PCR鑒定基因是否存在

檢測基因表達

頁數

28-30

31-34

35-36

35

37-40

41-43

70-71

44-48

建議同時分離His+Mut+及His+Muts畢赤酵母轉化子，因為很難預測哪種結構更利于蛋白表達。通過線性化DNA 5‘AOX1區或HIS4基因及使用GS115（Mut+） 或KM71（Muts）菌株，可方便地分離到Mut+及 Muts重組子。每次轉化時使用約10ug線性化DNA。

質粒DNA準備：用于畢赤酵母轉化的質粒DNA起碼純到可以做酶切，DNA越純，轉化效率越高。建議用S.N.A.P MiniPrep Kit來準備質粒DNA用于常規畢赤酵母轉化，質粒DNA也可通過堿裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀來獲得。

線性化質粒DNA：建議使用下列方法線性化載體以獲得Mut+及 Muts重組子，可能其中一個會比另一個更利于表達多拷貝重組子。如果只想得到Muts重組子，使用KM71菌株。單個十字交換事件可比雙重十字交換更容易、更有效地獲得Muts重組菌（例如：插入AOX1或his4而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位點，見p29-30以替換位點。

1如果克隆進Ppic3.5k，線性化時，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

2如果克隆進pAO815，線性化時，

插入HIS4用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts）

注意如果用pAO815載體，插入2個或更多拷貝子會產生SacI酶切位點

3如果克隆進Ppic9k，線性化時，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

程序：

1酶切新構建載體及親本載體。將親本載體轉入GS115或KM71用作表達的背景對照

2凝膠分析酶切產物以確定是否酶切完全。如酶切不完全，轉化數及靶向效率都會降低

3用酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提酶切產物，乙醇沉淀DNA，用10-20ulTE緩沖液重懸。不需要將目的基因片段從線性化質粒中分離純化出來。

4貯存于-20度直至轉化

替換酶切位點：下表列出線性化載體轉化畢赤酵母時的可替換酶切位點。

注意Ppic9k中Kan基因中含StuI位點，而HIS4上的StuI位點則被去除。

制作者：陳苗 商漢橋

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對照：建議轉化畢赤酵母時用以下對照：

1親代載體與重組載體以相同方式進行酶切，可在用PCR證實整合時作對照，還有表達分析及定量dot blot或southern分析時作為背景對照。

2含有單拷貝目的表達盒的pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k。以與多拷貝子同樣方式線性化pAO815載體。

大多數通過轉化重組Ppic3.5k或Ppic9k而得到的His+重組子只含有單拷貝插入。確保你挑取的轉化子只能抗0.25mg/ml遺傳霉素。pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k單拷貝對照應與正檢測的假定多拷貝重組子具有相同的Mut表型。這些單拷貝重組子可作為與多拷貝子進行表達比較的參照，也可作為定量dot blot及southern分析時的參照。這是非常重要的參數，因為目的基因拷貝數的增加并不一定會增加重組蛋白的表達量。

培養畢赤酵母用于制作原生質細胞：

介紹：一般，對大多數的研究者來說，原生質細胞及電轉是效率最高的轉化方法（103-104轉化子/ugDNA）。畢赤酵母同樣可用PEG1000（P68）或LiCl（P69）進行轉化。這兩種方法，特別是LiCl方法不如原生質法及電轉化方法。如果沒有電轉化裝置，建議使用原生質細胞法或PEG1000法。畢赤酵母的轉化效率不如釀酒酵母的轉化效率高。

原生質細胞的解釋：畢赤酵母細胞壁阻止攝入DNA，有必要去除部分細胞壁以吸收DNA。藤黃節桿菌酶是一種葡聚糖酶，可在細胞壁水解葡聚糖的β－1,3接頭，還可部分地消化細胞壁。該方法的關鍵在于不能過度消化細胞壁，否則會導致細胞死亡。藤黃節桿菌酶消化能力受細胞對SDS敏感性的影響。等量細胞加入SDS，以產生原生質細胞，該步的結果是溶液變澄清，其澄清度可由800nm處的吸光值獲得。

一般經驗，獲得70%原生質細胞時，消化程度較好。用等滲溶液清洗細胞除去酶并與DNA共孵育。將細胞重懸于山梨醇溶液中，細胞壁再生后再鋪板。

準備：制備下列溶液，存于4度。

YPD（Yeast Extract Peptone Dextro）培養基 1L

YPD平板 1L

RDB（Regeneration Dextro Ba） 平板 1L

RDHB（Regeneration Dextro Histidine Ba） 平板 1L

轉化當天，配制下列試劑：存于4度

5% SDS溶液

制作者：陳苗 商漢橋

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RD（Regeneration Dextro） 融化瓊脂 100ml

溶液：細胞去壁及轉化試劑

1M 山梨醇

SE: 1M 山梨醇, 25mM EDTA pH8.0

DTT: 用水配制成1M濃度

SCE： 1M 山梨醇, 1mM EDTA , 10mM 檸檬酸鈉緩沖液 pH5.8

CaS: 1M 山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2

藤黃節桿菌酶：用水配制成3mg/ml的濃度

40%PEG：用水配制40%（w/v）PEG3350(試劑純)

CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2

SOS: 1M山梨醇, 0.3×YPD, 10mM CaCl2

每次轉化時配制：

SED：19mlSE加1ml 1M DTT

PEG/CaT: 1:1混合40%PEG及CaT

程序：

1在YPD平板上劃線培養GS115或KM71,28－30度培養2天，以得到分散的單克隆。

2在50ml離心管或100ml搖瓶中，從GS115或KM71平板上挑取單個克隆接種10ml

YPD，28－30度劇烈振蕩（250-300rpm）過夜。該培養基可在4度保存數天。

3在3個500ml培養瓶中加入200mlYPD，分別取5、10及20ul第2步中的細胞，于28-30度劇烈振蕩（250-300rpm）過夜

4第二天早上，將試劑盒中的轉化溶液（SE，SCE，滅菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨醇），RDB平板（用于轉化）、RDHB平板（活力對照），放置于室溫下。

5測每個培養瓶中的OD600值

6收集OD600值為0.2-0.3瓶中的細胞，室溫，1500g離心5-10min。去除上清，接下去準備細胞去壁

注意：如果培養基都超過0.3，選擇一個培養基，用新鮮培養基以1：4稀釋，28-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3（2-4小時）。收集細胞如第6步

準備細胞去壁：取得上述第6步細胞

1取100ml融化的RD瓊脂糖，存于45度

2解凍1管1M DTT

3為該次去壁細胞試驗準備新鮮的SED

無菌條件下，將19mlSE轉入合適的滅菌容器中（如50ml離心管），加1ml 1M DTT混合均勻，為得到最好的效果，SED現配現用

注意：DTT的質量及新鮮度是成功制備去壁細胞的關鍵，1M DTT分析純，-20度保存。

洗滌細胞：

1用20ml滅菌水懸浮洗滌細胞，轉入滅菌的50ml的離心管中

2室溫1500g 離心5min，收集細胞

3將細胞重懸于20ml新鮮的SED中洗滌，如2離心

4用20ml 1M 山梨醇洗滌，離心如2

制作者：陳苗 商漢橋

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5用20ml SCE緩沖液重懸細胞，將懸液分至兩個50 ml離心管中(10ml/管)

6取1管藤黃節桿菌酶置于冰上，輕彈管壁以混勻，藤黃節桿菌酶以漿液的形式存在，無需配成溶液，將它混勻以確保每次的量是相等的。

加入藤黃節桿菌酶：可先取一管細胞來確定用藤黃節桿菌酶消化細胞的最佳時間，一旦確定時間，取另一管細胞進行裂解。藤黃節桿菌酶消化細胞壁，使細胞變脆，拿樣品時要輕柔些，加入藤黃節桿菌酶后，即開始消化細胞壁。

*準備至少20ml 5%SDS溶液

*將分光光度計調至800nm處，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白

*準備10個滅菌離心管，編號0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50

1取5步中一管細胞，取出200ul加入標0的管中，置于冰上，此即0點

2加7.5ul藤黃節桿菌酶到該管剩余細胞中，輕輕顛倒混勻，30度孵育，不要晃動樣品。該樣品可用于建立細胞去壁最佳時間表。將另一管細胞置于室溫，用于第六步。將剩余藤黃節桿菌酶放于冰上。

3監測去壁細胞的形成：2min時，取200ul步驟2中的懸浮細胞，加入標2的管中。在t=4,5,6,,,50min時，重復上述操作，讀樣品OD800值

4用公式確定每個時間點時去壁細胞的形成比例：

%去壁率=100-［(時間t時OD800值/時間0時OD800值)×100］

如t=0時，OD800=0.256， t=15時，OD800=0.032

計算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5%

5確定去壁率為70%時的時間，藤黃節桿菌酶的用量不同，最佳時間也各不相同。Invitrogen 實驗室的最佳去壁時間為15-40min。

注意：確定獲得所需量去壁細胞的最小時間很重要，藤黃節桿菌酶消化時間過長，對細胞有害，效率會降低。

6在另一管中加入7.5ul藤黃節桿菌酶(如步驟1)，將管放于30度，時間為步驟5中建立的最佳時間，以獲得最佳比例70%的去壁細胞。

7室溫750g離心10min，收集去壁細胞，去除懸浮液

8用1M山梨醇洗去壁細胞1次(輕叩管壁以分散去壁細胞團，不要渦旋)。如上離心

9用10ml CaS洗滌去壁細胞，如7中離心，用0.6mlCaS重懸細胞。去壁細胞必須立即(至多30min)用于轉化。不能放更長時間，這些細胞共可作6次轉化

轉化畢赤酵母：

開始前：將RDB平板放于室溫，準備好融化的RD上層瓊脂，取出線性化DNA置于冰上

GS115中，用SalI,StuI或SacI線性化的DNA可分離His+Mut+重組子

KM71中，用SalI,StuI或SacI線性化的DNA可分離His+Muts重組子

親代載體用相同酶線性化

對照包括無DNA，線性化PBR322DNA及質粒(無細胞)涂板來檢測是否有污染

程序：

1取上述9中100ul去壁細胞到1.5 ml滅菌的有蓋管中

2取10ugDNA，室溫孵育10min

3同時配制PEG/CaT溶液，計算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)

4加1ml新鮮的PEG/CaT溶液至細胞與DNA混合物中，輕輕混勻，室溫孵育10min

制作者：陳苗 商漢橋

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5室溫750g離心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，顛倒管，輕叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

6用150ulSOS培養基懸浮轉化細胞，室溫孵育20min

7加入850ul1M山梨醇，接下來涂板

涂板：畢赤酵母去壁細胞需要鋪在頂層瓊脂糖或瓊脂上，以防止在選擇前被裂解

1接第7步，取100-300ul去壁細胞-DNA，與10ml融化的RD瓊脂糖混勻倒于RDB平板上，直至上層瓊脂變硬。注意，確保有足夠的去壁細胞-DNA鋪第二板，第三板

2倒置平板，28-30度孵育，轉化子會在4-6天內出現

3細胞活性：用100ul去壁細胞加入900ul 1M山梨醇

4取稀釋樣本100ul，加入10ml融化的RDH，鋪在RDHB平板上，等上層瓊脂凝固

5倒置平板，28-30度孵育，4-6天出現克隆，表明去壁細胞可再生成分裂細胞

His+轉化子分析：如用Ppic3.5k及Ppic9k構建載體轉化畢赤酵母，接著做體內篩選多插入子

如用pAO815構建載體轉化畢赤酵母，篩選Mut+及Muts轉化子

評價轉化試驗：使用去壁細胞，一般轉化效率為103-104His+轉化/ugDNA，在無DNA、線性化PBR322及只有質粒(無細胞)平板上應均無克隆。

功能分析篩選：有些研究者通過功能分析直接檢測高表達畢赤酵母重組克隆，而不進行Mut+及Muts表型篩選。檢測完高表達后，最好也檢測Mut表型，這可幫助你優化重組克隆的表達。

體內篩選多插入子：

介紹：His+轉化子越多越好，因為只有1-10%His+轉化子可能含有多拷貝插入。這意味著，如果多拷貝插入概率為1%，你必須篩選1000個克隆，才能得到10個高遺傳霉素抗性克隆，這需要1-5個含His+轉化子的平板。篩選數以千計的克隆并不罕見。如果有抗高遺傳霉素抗性的克隆，可檢測重組蛋白的表達(P44)，或者檢測Mut表型(P41)。

篩選遺傳霉素抗性轉化子方法：

一、技術上簡單，可篩選大量克隆，但不那么可信。篩選HIS+轉化子后，將它們集中起來，鋪在遺傳霉素濃度逐漸升高的YPD平板上，可應用于去壁細胞及電轉化方法。

二、技術上較難，只可篩選少量克隆，但更可信。每個克隆在微量測定板上生長至濃度一致，將培養基點到YPD-遺傳霉素平板上計算抗遺傳霉素抗性。

注意：用遺傳霉素篩選可能會有假陽性。劃線挑取假定的抗遺傳霉素單克隆，然后在YPD-遺傳霉素平板上進行證實很重要。如果你真的選擇復制平板，一定要證實遺傳霉素抗性。

開始前：準備10個YPD平板，每個的遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。

(去壁細胞)方法1：從含HIS+轉化子的平板開始

1用滅菌刮片將含有HIS+轉化子的頂層瓊脂最上層刮下，放入無菌的50ml離心管中。

2加入10-20ml滅菌水，量應為瓊脂的兩倍，劇烈振蕩1-2min

3將離心管置于管架上，讓瓊脂沉淀(1min)

4用血球計數計確定上清中細胞濃度。至少要5×105細胞/ml，那樣在200ul或更少溶液中可含105個細胞。(如果太稀，可將液體轉入另一管中，離心細胞，再用適量滅菌水重懸至5×105細胞/ml)

5每塊含遺傳霉素的YPD平板涂105細胞。每個濃度用四塊板。

制作者：陳苗 商漢橋

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(需要證實在沒有遺傳霉素的YPD板上細胞的滴度，計算每個遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉化子的1-10%，將收集的轉化子稀釋到10-5，10-6，10-7濃度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5天出現，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現。接下來做結果分析。P39

(電轉化)方法1：電轉化畢赤酵母時用以下程序。轉化子不需要鋪在上層瓊脂。從含HIS+轉化子平板開始。

1吸取1-2ml滅菌水于所有HIS+轉化子平板上

2用滅菌刮子重懸HIS+轉化子，不要劃破瓊脂

3將細胞懸液集中轉移至滅菌的50ml離心管中，稍渦旋(5-10S)

4用分光光度計測定濃度(1OD600=5×107細胞/ml)

注意：混有瓊脂會干擾讀數

5在每塊含有遺傳霉素的YPD平板上涂105細胞。

(需要證實在沒有遺傳霉素的YPD板上細胞的滴度，計算每個遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉化子的1-10%，將收集的轉化子稀釋到10-5，10-6，10-7濃度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5天出現，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現。接下來做結果分析。P39

注意：如果在以上方法里你將所有細胞都懸浮，加15%滅菌甘油，存于-80度，可在以后時間里做遺傳霉素抗性篩選。

方法2：需要三組各兩塊微量測定板(共6塊)來篩選180個HIS+重組子。通過持續接種，得到相同濃度的克隆子，以確保遺傳霉素平板上細胞數相等。如將轉化子鋪于頂層瓊脂中，有必要從瓊脂上收集細胞，重新涂最小組氨酸平板(P42)以收集克隆。記住要有菌株背景對照及單拷貝基因對照。每180個克隆，可選擇出1-10個抗遺傳霉素克隆。

1無菌條件下，在每個微量測定板上加入200ul YPD

2用滅菌牙簽在第一組平板中每孔接種單個HIS+轉化子，輕輕攪動以懸浮細胞

3蓋住微量測定板在30度孵育2天(不需搖動)

4 2天后，取新的微量測定板，加入190ulYPD

5用多道移液器吸取10ul培養液于第二組測定板中，確保第二組板標記好并放置好，這樣可指示細胞所在孔。

6蓋住第二組板，30度孵育過夜

7第二天，在第三組測定板上重復第5,6步

注意：持續生長及傳代可使克隆達到相同細胞濃度

8孵育后，取第三組板，用100ul多道移液器上下吹打重新懸浮細胞

9取10ul每孔中液體點在含遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5……4.0mg/ml的YPD平板上。用多道移液器或在平板底下劃線，確保以規則方式排列。

10待液體吸收，將板放于30度，2，3，4，5天后檢測抗遺傳霉素克隆，接著分析結果。

結果分析：可能只有少數的抗遺傳霉素克隆，大小可能也不一樣，但克隆形態上應一致。挑取抗遺傳霉素克隆，劃線培養純化，挑取單克隆，確保記錄抗遺傳霉素的水平。

可能在2.0，3.0，4.0mg/ml遺傳霉素平板上找不到克隆，因為抗如此高遺傳霉素的“頭彩”克隆很少見。需要篩選數以千計的HIS+轉化子以分離抗2-4mg/ml遺傳霉素的克隆。

因為不能保證多拷貝克隆會確實增加蛋白表達量，許多人選擇直接表達來看是否有克隆制作者：陳苗 商漢橋

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可大量表達蛋白。確保有單拷貝插入作為對照，檢測所有抗遺傳霉素抗性克隆的Mut表型(P41)，以期進行正確誘導表達。

確保劃線純化單克隆，并加入甘油冰凍保存遺傳霉素抗性克隆，每次從凍存樣本中挑菌開始表達研究而不是從老的平板上挑菌。

確定拷貝數目：如果發現抗遺傳霉素HIS+重組子明顯大量表達蛋白，你可能想要知道基因拷貝數。可用southern blot 或dot blot 分析拷貝數(P74)。轉化空載體或含單拷貝基因載體的畢赤酵母重組菌基因組DNA也非常重要，可作為實驗的對照。

解決問題：因為有可能挑取假陽性(看起來可抗高濃度遺傳霉素，其實并不是)，純化假定的遺傳霉素抗性克隆，并證實其所抗遺傳霉素的水平非常重要。

體內方法另一個普遍的問題是，只能分離少數遺傳霉素抗性克隆，這意味著需要篩選更多的HIS+轉化子。記住你正分離的多拷貝插入事件，它發生的概率為1-10%，這意味著需篩選數以千計的克隆而不是區區幾百個。另外，為分離含較多拷貝插入基因的重組子，需要篩選更多的HIS+轉化子。連續的多拷貝插入更是少見。

如果你的轉化效率很低，嘗試用電轉化替代去壁細胞方法。這樣可增加轉化效率，幫助你分離更多HIS+轉化子。

篩選Mut+及Muts 轉化子

介紹：此處，你可分析HIS+轉化子的Mut+及Muts表型。試劑盒中有兩個菌株可提供Mut+及Muts表型對照。GS115 Albumin是Muts表型，GS115 β-gal是Mut+表型。HIS+ KM71重組子不需要篩選重組子表型，因為它們都是Muts表型。

記住要用兩個對照菌株作為畢赤酵母蛋白表達的背景：一個對照即親本質粒線性化產生HIS+ Muts轉化子，另一個對照是親本質粒線性化產生HIS+ Mut+轉化子。

在GS115中篩選HIS+ Mut+轉化子：用SalI或StuI線性化質粒轉化GS115后，大多在HIS4位點上發生重組，大多數轉化子是Mut+表型；然而由于質粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位點發生重組，破壞野生型AOX1基因，產生HIS+ Muts轉化子(P66)。在MD及MM平板上檢測可證實HIS+ Mut+轉化子。

在KM71中篩選HIS+ Muts轉化子:轉化KM71的HIS+轉化子都是Muts，因為AOX1基因被破壞(aox::ARG4)。不需要檢測重組子Mut表型，所有都是Muts。SalI或StuI線性化質粒轉化KM71在HIS4位點重組，SacI線性化質粒在AOX1基因5’區重組。HIS+重組子需在不含組氨酸的平板上純化后再進行表達。

準備：下列培養基可提前準備存于+4度

最小葡萄糖(MD)瓊脂板 1L

最小甲醇(MM)瓊脂板 1L

滅菌牙簽及篩選平板 (P43)

在MD，MGY平板上劃線培養GS115 Ablumin(HIS+ Muts)及GS115β-gal HIS+ Mut+，作為Mut+或 Muts在MD或MM平板上生長的對照。

篩選GS115/HIS+ Mut+ 或HIS+ Muts：篩選HIS+轉化子的Mut+或 Muts表型

1用滅菌牙簽挑取單克隆，在MM及MD平板上以一定的方式劃線或點HIS+轉化子，確保先在MM平板上點

2每個克隆換一次牙簽，點100個轉化子后再繼續向下做(約2-3板)

3為分離Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各點上對照(GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal)

4 30度孵育2天

制作者：陳苗 商漢橋

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5兩天后，計數平板，尋找在MD平板正常生長而在MM平板上生長很小或不長的菌株。

注意：建議純化HIS+轉化子，確保分離的是單克隆，這可在檢測Mut表型前后進行。

復制平板程序：該程序錯誤分離的概率較小，但分離的程序要增加2天，需要儀器復制平板。

制作者：陳苗 商漢橋

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1用滅菌牙簽，在MD平板上(2-3板) 點100個HIS+轉化子，點GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal在MD上作對照。

2在28-30度孵育2天

3兩天后，復制平板至新鮮的MM、MD平板，篩選Muts

4 28-30度孵育復制平板2天

5在28-30度孵育兩天后，計數復制平板，查找在MD平板上正常生長而在MM平板上長得小或不長的菌落。每塊板上的HIS+Mut s及 HIS+Mut+對照菌落，可作為Muts及 Mut+表型的參照。

轉化子更簡單的選擇方法：由于鋪在上層瓊脂，導致轉化子中有些在上層有些則包埋在瓊脂里，無法挑取克隆。下列程序可進行轉化子選擇，直接將它們鋪于板上，而無需用上層瓊脂。

1用滅菌刮子刮取含HIS+轉化子的瓊脂置于滅菌的50ml離心管中，加入20ml滅菌去離子水，劇烈渦旋重懸細胞

2用4層干酪包布過濾上清，室溫1000g離心5min。細胞在底部，殘留的瓊脂在細胞上方

3仔細去除瓊脂，輕輕晃動管子，使瓊脂顆粒分散于水中，棄去含瓊脂的上清。

4用5ml滅菌去離子水重懸細胞，用小超聲頭，20-30%輸出功率下超聲細胞10秒，只將細胞超聲分散而不是裂解細胞。

5將細胞稀釋至104，在MD平板上鋪50-100ul。30度孵育過夜。選擇方法進行Mut表型篩選。

重組酵母菌表達：

介紹：確定目的基因表達的最優方法及條件，下面為畢赤酵母表達因素及指導，因為對于任何表達系統，最優化條件因表達蛋白的特征而不同。

培養基：需要BMGY/BMMY(緩沖復合甘油或緩沖復合甲醇培養基)BMG/BMM(緩沖最小甘油或緩沖最小甲醇培養基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培養基)進行表達(P60)。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表達，特別是當PH對蛋白活性比較重要時。它們是緩沖培養基，這與MGY、 MM不同。這四種培養基用磷酸鹽緩沖，PH值在一個較大的范圍內，可用于蛋白優化表達。BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可穩定分泌蛋白，阻止或減少分泌蛋白的分解。酵母浸出物及蛋白胨作為“混合飼料”，使生長更好并可積累大量表達產物。

蛋白酶：有些蛋白特別易受在中性PH值時有很好活性的蛋白酶的影響。在這種情況下，建議用MGY，MM培養基，因為當畢赤酵母在無緩沖培養基如MM中表達時，PH降至3或更低，許多中性PH蛋白酶都將失活。畢赤酵母對低PH值有抗性，因此低PH值不會影響生長。與此相對的是，有報道稱加入1%酪蛋白氨基酸(Difco)并將培養基PH值緩沖至6.0，胞外蛋白酶受抑制，增加了小鼠表皮生長因子的表達。

如果你的目的蛋白對中性PH蛋白酶敏感的話，可在無緩沖培養基(MM)中表達。如果沒有證據證明你的分泌蛋白對中性PH值蛋白酶敏感，建議開始表達時用BMMY。如果表達蛋白降解了，嘗試在無緩沖培養基中進行表達。

如果以上條件仍不能有效防止蛋白降解，可將基因轉入SMD1168中，該菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，轉化與表達程序與GS115相同，也可用于大規模發酵。

制作者：陳苗 商漢橋

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換氣：畢赤酵母高效表達的重要因素是在甲醇誘導時充分換氣。基本上在誘導時，培養基不要超過搖瓶體積的10-30%。建議使用隔板搖瓶，用2-3層干酪包布或松散合適的蓋子蓋住搖瓶，不要用很緊的蓋子。(換氣在誘導前大量培養時并不那么重要)

生長動力學：當Mut+及Muts在YPD或甘油培養基中生長接近相同速度時，加入甲醇，由于AOX1基因產物的產生，Mut+將比Muts生長快。

溫度及振蕩：所有表達需在30度的搖床中進行。溫度不能超過30度很重要，如果搖床溫度不穩，設置在28度。使用落地式搖床，速度為225-250rpm，如果為臺式搖床，速度調至250-300rpm。

開始前：先證實重組子及對照重組子(無插入，1拷貝插入)在GS115或KM71中的表達情況。進行表達時，選擇合適的對照很重要，可以更好地解釋你的表達結果。表達對照如下：

GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts分泌表達對照

GS115/ HIS+ Mut+ β-gal Mut+胞內表達對照

GS115或KM71/載體(無插入) 背景對照

GS115或KM71/載體(1拷貝插入) 單拷貝基因表達水平對照

不同的重組形式均會影響表達，建議挑取6-10個克隆進行表達水平篩選。從最新的平板上挑取克隆。克隆子活力隨時間而下降，如果有任何懷疑，最好劃線純化菌株。(也可以從凍存的甘油菌中取部分進行培養)

表達指導：下面信息有關如何開始表達，可能需要改變條件來表達不同蛋白，如可能使用底隔板或邊隔板搖瓶。如果分析許多重組子，可用50ml離心管。為確保有效換氣，可增加搖瓶速度或將離心管以一定角度置于搖床中。

Mut+胞內或分泌表達：為檢測表達條件是否有效，可培養GS115β-gal (Mut+)(胞內表達-半乳糖苷酶)。親代載體轉化GS115或KM71作為胞內表達背景對照。

1挑取單克隆，接種至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml搖瓶)，28-30度，250-300rpm搖至OD600=2-6(對數生長，大約16-18小時)

2室溫1500-3000g離心5min，收集細胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重懸細胞至OD600=1.0，進行誘導表達(大約100-200ml)

3在1L搖瓶中加入上述培養物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續生長。

4每24小時，加甲醇至終濃度為0.5%以繼續誘導。檢查培養基的量，確保正確加入甲醇，因為蒸發作用會減少培養基的體積。

5在下列的各個時間點，取1ml培養基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。室溫用水平離心機最大轉速離心2-3min。時間點：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表達時，將上清轉移至單獨管中，將上清及細胞沉淀存于-80度直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

胞內表達時，去除上清將細胞沉淀存于-80度，直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

7用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法來分析上清及細胞沉淀的蛋白表達(SDS-PAGEp47)。

Muts胞內或分泌表達:可培養GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培養基中)檢測培養條件的效率。記住要用轉化親本載體的GS115或KM71作為胞內表達的背景對照。

制作者：陳苗 商漢橋

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1挑取單克隆，接種至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板搖瓶中。在搖床中28-30度，250-300rpm生長至OD600=2-6(約16-18小時)

2室溫1500-3000g離心5min收集細胞，去除上清，用1/5-1/10原培養基體積的MM，BMM或BMMY重懸細胞(約10-20ml)

3置于100ml隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床繼續培養。

4每隔24小時，加入甲醇至終濃度為0.5%以繼續誘導。

5在下列的各個時間點，取1ml培養基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達水平及確定誘導后收集細胞的最佳時間。室溫用水平離心機最大轉速離心2-3min。時間點：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表達時，將上清轉移至單獨管中，將上清及細胞沉淀存于-80度直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

胞內表達時，去除上清將細胞沉淀存于-80度，直至開始檢測。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍。

7用考馬斯亮藍染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法來分析上清及細胞沉淀的蛋白表達(SDS-PAGE p47)。

SDS-PAGE分析：

介紹：任何標準SDS-PAGE儀器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝膠，5%濃縮膠用于分離40-100kDa蛋白。

樣品準備：需要準備Breaking 緩沖液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠

細胞洗滌準備：(胞內或分泌表達)

1快速融化細胞沉淀，置于冰上

2每1ml樣品，加入100ul裂解緩沖液(細胞+上清)

3加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通過置換來估算相等體積

4渦旋30s，冰上孵育30s，重復8次

5 4度最大轉速離心10min，將上清轉移至干凈的微量離心管中

6取50ul上清(細胞裂解物)，，加入50ul2×SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液(樣品buffer)

7煮沸10min,每孔加10-20ul，依膠的厚薄及孔量，決定點樣量。剩下樣品存于-20度，用于western blot。細胞裂解物存于-80度用于分析。

蛋白濃度：Lowry,BCA(pierce)或Bradford蛋白分析可用于定量分析細胞裂解物中及培養基上清中蛋白量。一般，畢赤酵母細胞裂解物含有5-10ug/ul蛋白。畢赤酵母培養基上清中蛋白含量各有不同，基本上與分泌蛋白的量有關。畢赤酵母只分泌很少自身蛋白，如果培養基中蛋白量大于50ug/ml，10ul培養基在SDS-PAGE上通過考馬斯亮藍染色可得一條弱帶。

對照：在SDS-PAGE上用下列樣品作對照：

1與所需蛋白相適的分子量標準

2標準蛋白(如果有的話)

3含親本載體的GS115或KM71樣品，這可顯示畢赤酵母胞內自身蛋白背景，如果在胞內表達，可幫助你將目的蛋白從背景蛋白中區分開來

4分析GS115β-gal 及Ablumin 對照，可指示培養基或條件是否有問題

用考馬斯亮藍染色時，強烈建議進行western blot或其它更敏感的分析方法來分析蛋白，表達蛋白依染色而呈現出來依靠多種因素，如表達水平，可溶性，分子量及胞內相同分子量的蛋白是否掩蓋了它等等。Wetern blot,酶活分析或特定的純化方式，可幫助在自身蛋白中辨認表達蛋白。

制作者：陳苗 商漢橋

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分析蛋白表達：檢查考馬斯亮藍染色SDS-PAGE時，會發現隨不同時間誘導產生目的蛋白與標準蛋白移行相同距離，如果沒有可見的重組蛋白，進行western blot或功能分析。

*如果重組蛋白的表達量很低，見(畢赤酵母表達蛋白優化)P49，優化表達指導。

*用試劑盒自帶的兩個對照菌檢測表達條件

*如果沒有檢測到表達，進行northern blot分析，看是否有及有多少被誘導的全長mRNA。見P76，RNA分離程序。

優化畢赤酵母蛋白表達：

介紹：根據現有數據，在畢赤酵母中表達可測水平外源蛋白的概率大約為75%。最大的障礙可能是最初的成功---表達任意水平蛋白，雖然表達≧10g/l的例子很少，仍有許多表達水平≧1g/l的例子，使得畢赤酵母表達系統成為最高產的真核表達系統之一。也有一些無法在桿狀病毒及釀酒酵母中表達而在畢赤酵母中成功表達的例子，表明畢赤酵母系統是一個很好的替代選擇，如果你最初沒有表達或很少的話，使用下列指導來優化表達。

蛋白酶水解或降解：作一系列表達時間研究，檢測是否在某一個時間點產生較多比例的全長蛋白。

1如果分泌表達，在無緩沖的MM培養基中培養，檢測蛋白是否對中性PH蛋白酶敏感。另外，在緩沖培養基中加入1%酪蛋白氨基酸，抑制胞內蛋白酶

2用SMD1168(蛋白酶A缺陷)進行表達

3分泌表達水平低：檢測細胞沉淀，看是否總體表達水平低或蛋白沒有分泌 。如果不分泌，嘗試不同的信號序列(自身或α-factor信號序列)

4用硫酸銨沉淀或超濾濃縮上清(P52)

5Mut+，用高濃度培養物進行誘導表達

表達水平低：

1檢測Mut+及Muts重組子以期增加表達，一些蛋白在一種遺傳背景下表達比另一種好

2如果是分泌表達，嘗試胞內表達，因為蛋白不能正確加工或不能分泌，檢查細胞沉淀是否有表達。如果胞內表達有困難，嘗試進行分泌表達。可能的糖基化也許是你需要的也許是不要的，如果不要，寡糖苷可用peptide: N-Glycosida F進行去除。(P54)

3進行大規模發酵(P52)，畢赤酵母是酵母，當然更適于發酵。致電Invitrogen技術服務部尋求幫助。

沒有表達：

1先按前面所列簡單方法進行優化，因為沒有表達與表達量極低情況相似。如果這些方法仍不能增加蛋白表達，進行northern blot分析或檢查基因轉錄情況。附錄中有畢赤酵母RNA分離方法(P76)

2 PCR分析插入情況(P70)。PCR選取12-20個轉化子才可信，記得用空載體及單拷貝插入載體作對照分析PCR結果

3如果有轉錄提前終止，檢測基因的AT結構，在釀酒酵母中，只有很少序列會使轉錄提前終止,其中之一TTTTTATA，與HIVI-gp120中ATTATTTTATAAA序列相似，在酵母中表達時，會出現提前終止。改變該序列，才能出現更長的轉錄。

過糖基化：如果是過糖基化的

1試用胞內表達，因為蛋白不經過分泌通路，不會被修飾

2用peptide: N-Glycosida F或其它酶進行去糖基化

3去除基因N端糖基化位點

制作者：陳苗 商漢橋

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大規模表達：

表達指導：表達優化后，可用更大搖瓶或用發酵罐來生產更多蛋白(P79)。用下列指導來進行規模化表達，純化蛋白見參考(P53)

Mut+胞內或分泌表達：

1挑取單克隆，接種至含25mlMGY，BMG或BMGY的250ml搖瓶中，28-30度，250-300rpm培養至OD600=2-6(約16-18小時)

2將25ml培養基接種至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L搖瓶中，28-30度劇烈振蕩(250-300rpm)，至對數生長期(OD600=2-6)

3用滅菌離心管，室溫1500-3000g離心5min收集細胞。誘導表達時，去除上清，用MM，BMM或BMMY重懸細胞至OD600=1.0(2-6L)進行誘導

4分裝培養基至幾個3-4L隔板搖瓶，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住，放入搖床28-30度繼續培養

5每24小時，加甲醇至0.5%濃度，直至到達最佳誘導時間

6室溫，1500-3000g離心5min收集細胞。胞內表達去除上清，細胞立即進行處理或存于-80度。分泌表達，保留上清，置于4度預冷，如需要可進行濃縮。接下來進行蛋白純化或將上清存于-80度備用。

Muts胞內或分泌表達：

1挑取單克隆，接種至含10mlMGY，BMG或BMGY的100ml隔板搖瓶中，28-30度，250-300rpm培養至OD600=2-6(約16-18小時)

2將10ml培養基接種至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L搖瓶中，28-30度劇烈振蕩(250-300rpm)，至對數生長期(OD600=2-6)

3用滅菌離心管，室溫1500-3000g離心5min收集細胞。誘導表達時，去除上清，將細胞重懸于1/5-1/10原體積的MM，BMM或BMMY培養基中(100-200ml)

4將培養基加至1L隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住，放入搖床28-30度繼續培養

5每24小時，加甲醇至0.5%濃度，直至到達最佳誘導時間

6室溫，1500-3000g離心5min收集細胞。胞內表達去除上清，細胞立即進行處理或存于-80度。分泌表達，保留上清，置于4度預冷，如需要可進行濃縮。接下來進行蛋白純化或將上清存于-80度備用。

建議：為增加Muts重組子的數量，增加搖瓶數量，將200-300ml培養基加至3L搖瓶中或發酵培養。

濃縮蛋白：分泌進培養基中的蛋白，同質性>50%，需要另外進行純化，如果蛋白表達水平并不太高，可優化濃縮蛋白。有幾種方法濃縮畢赤酵母分泌蛋白

*硫酸銨沉淀法 *透析 *體積小時，離心集中器 *體積大時，加壓濃縮 *凍干濃縮

細胞裂解：用玻璃珠進行裂解

發酵：Invitrogen有發酵指導，建議曾做過或身邊有人曾做過發酵時再嘗試發酵。

蛋白純化與糖基化：

介紹：你已經優化蛋白表達程序，也通過大規模培養生產大量蛋白以進行純化。你也許有蛋白純化的方法，由于每種蛋白都不同，很難推薦統一的技術用于純化

一些蛋白純化技術：確保細胞裂解及純化蛋白都在4度進行

*離子交換色譜 *凝膠過濾 *親和色譜分析 *聚焦色譜 *等電聚焦免疫沉淀

制作者：陳苗 商漢橋

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*可溶性（膜蛋白）Lectin親和色譜

細胞裂解程序：準備breaking buffer（BB）見附錄P60

1用BB重懸清洗細胞，4度下3000g離心5-10min，

2用BB重懸細胞至OD600＝50-100

3加入等體積的酸洗玻璃珠（0.5mm），通過替代預測體積

4渦旋混合物30s，冰上孵育30s，重復7次，間隔渦旋并預冷細胞抽提物減少蛋白變性

5在4度，12000g離心5-10min

6將上清轉至干凈容器并分析，總蛋白含量應在5-10mg/ml

7保留細胞沉淀，用6M尿素或1%Triton X-100抽提來檢測不可溶蛋白

糖基化分析：在異源表達系統中表達純化糖基化蛋白，需要盡快確定是否正確糖基化，最近發表的一些蛋白碳水結構分析方法，使得分子生物學家可對糖基化目的蛋白進行分析。

畢赤酵母培養基配方：

貯存液：

*10×YNB （13.4%酵母氮源堿（YNB）含硫酸銨不含氨基酸）

溶解134gYNB于1000ml水中，過濾除菌，加熱至YNB完全溶解，存于4度。或者用34gYNB（不含硫酸銨不含氨基酸），100g 硫酸銨進行配制，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長更好。該試劑盒中所用YNB的量是釀酒酵母中的兩倍。

*500×生物素（0.02%）

溶解20mg生物素于100ml水中，過濾除菌，放于4度，可放1年

*100×H（0.4%組氨酸）

溶解400mg L-組氨酸于100ml水中，低于50度加熱以促溶解，過濾除菌，可放1年

*10×D（20%葡萄糖）

溶解200g D-葡萄糖于1000ml水中，高壓滅菌15min或過濾除菌，可放1年

*10×M（5%甲醇）

混合5ml甲醇與95ml水，過濾除菌存于4度，可放2個月

*10×GY（10%甘油）

混合100ml甘油與900ml水，過濾或高壓滅菌，室溫放置，可存放1年以上

*100×AA（0.5%各種氨基酸）

溶解各50mgL-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-賴氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸于100ml水中，過濾除菌，存于4度，可放1年

*1M磷酸鉀緩沖液 PH6.0

132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，調整PH值為6.0±0.1（如果需調PH值，用磷酸或KOH）。過濾或高壓滅菌，室溫下可放1年以上

*YPD或YPED：Yeast Extract Peptone Dextro Medium(1L)

1%Yeast Extract 2% Peptone 2%Dextro (gluco)

1溶解10gYE, 20gPEP于900ml水中，如制平板加入20g瓊脂粉

2高壓20min

3加入100ml 10×D

*YPD-遺傳霉素平板：

1%酵母浸出物， 2%蛋白胨 2%葡萄糖 2% 不同量的遺傳霉素

100mg/ml遺傳霉素：用無菌水制備30ml 100mg/ml遺傳霉素貯存液，過濾除菌，存于-20度。用來制備含不同終濃度遺傳霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0

250ml（8－10個遺傳霉素平板）

制作者：陳苗 商漢橋

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1溶解2.5g酵母浸出物,5g蛋白胨,5g瓊脂粉于225ml去離子水中

2高壓滅菌20min

3加入25ml 10×D，混勻

4待YPD冷至55-60度，加入合適量遺傳霉素貯存液，同時也制幾個不含遺傳霉素的YPD平板

5混勻，不要產生太多氣泡

6傾倒10cm彼得里培養皿，凝固后，倒置存于4度，可放至少6個月

終濃度

0.25 0.5 0.75 1.0 1.5 1.75 2.0 3.0 4.0

ml遺傳霉素貯存液/250mlYPD

0.625 1.25 1.875 2.5 3.75 4.375 5.0 7.5 10

*MGY及MGYH （minimal glycerol medium±histidine）1L

1.34%YNB 1%甘油 4×10-5%生物素 ±0.004%組氨酸

1在800ml水中加入100ml 10×YNB,，2ml 500×B，100ml 10×GY

2培養his4菌株，需加入組氨酸（稱為MGYH），加入10ml 100×H貯存液。

3存于4度，可放2個月

*RD及RDH液體培養基：regeneration dextro medium±histidine 1L

1M山梨醇 2%葡萄糖 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.005%氨基酸 ±0.004%組氨酸

1溶解186g山梨醇于700ml水中

2滅菌20min

3放冷并置于45度水浴

4準備預溫（45度）的混合液

100ml 10×D

100ml 10×YNB

2ml 500×B

10ml 100×AA

88ml 滅菌水

加至山梨醇溶液中

5培養his4菌株，需加入組氨酸，在4中45度預溫混合液在加入10ml 100×H。4度保存，可放幾個月

*RDB或RDHB瓊脂平板：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入20g瓊脂粉

2滅菌20min

3將溶液置于60度水浴，以防止溶液變稠

4準備RD及RDH中用到的預熱的（45度）混合物，加至山梨醇/瓊脂粉溶液中。如選擇HIS＋轉化子，不要加組氨酸。

5制備平板，放于4度，可放幾個月。

*RD及RDH上層瓊脂：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入10g瓊脂或瓊脂糖

2滅菌20min

3置于60度水浴

4準備RD及RDH中用到的預熱的（45度）混合物，加至山梨醇/瓊脂粉溶液中，如選擇HIS＋轉化子，不要加組氨酸。

5如立即作轉化，將溶液置于45度

6存于4度，可放幾個月

制作者：陳苗 商漢橋

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*MD，MDH (minimal dextro medium±histidine) 1L

1.34% YNB 4×10-5%生物素 2%葡萄糖

1滅菌800ml水

2于60度下加入100ml 10×YNB，2ml 500×B, 100ml 10×D

3制MDH時，加入10ml 100×H,混勻存于4度

4如制備平板，于第一步加入15g瓊脂粉

5倒置平板，4度放置幾個月

*MM、MMH minimal methanol ±histidine 1L

13.4%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇

1滅菌800ml水

2于60度 下加入100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M

3制MMH時，加入10ml 100×H,混勻存于4度

4如制備平板，于第一步加入15g瓊脂粉

5倒置平板，4度放置幾個月

*BMG、BMM Buffered minimal glycerol (methanol) 1L

100mM 磷酸鉀 PH6.0 1.34%YNB 4×10-5%生物素 1%甘油或0.5%甲醇

1滅菌700ml水，

2冷至室溫，加入下列：100ml 1M磷酸鉀緩沖液PH6.0, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×GY

3制BMM時,加入100ml 10×M取代10×GY

4放置于4度，可放2個月

*BMGY Buffered Glycerol-complex Medium

BMMY Buffered Methanol-complex Medium 1L

1%酵母浸出物 2%蛋白胨 100mM磷酸鉀 PH6.0， 1.34%YNB 4×10-5%生物素1%甘油或0.5%甲醇

1溶解10g酵母浸出物，20g蛋白胨于700ml水中

2滅菌20min

3冷至室溫，加入下列混合液：

100ml 1M 磷酸鉀緩沖液 PH6.0

100ml 10×YNB

2ml 500×B

100ml 10×GY

4制BMMY時，加入100ml 10×M取代10×GY

5存于4度，可放2個月

裂解緩沖液：

50mM 磷酸鈉 PH7.4

1mM PMSF(或其它蛋白酶抑制劑)

1mM EDTA

5%甘油

1準備所需蛋白酶抑制劑貯存液，正確保存

2取900ml去離子水，6g磷酸鈉（單堿），372mg EDTA，50ml 甘油

3用NaOH調節PH，定容至1L，存于4度

4使用前，加入蛋白酶抑制劑

制作者：陳苗 商漢橋

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畢赤酵母重組及整合

介紹：通過轉化DNA與畢赤酵母基因組中同源序列的同源重組，畢赤酵母與釀酒酵母一樣可產生穩定轉化子。這些整合在無選擇壓力條件下，即使是以多拷貝出現，也表現出極度穩定性。常用的表達載體含有選擇用HIS4基因，這些載體用限制酶線性化后，可在AOX1或his4位點進行重組，從而產生HIS＋重組子。注意單十字交換事件（插入）比雙十字交換事件（替換）更容易發生，多拷貝插入事件自發發生率只有單插入事件的1-10%。

基因插入AOX1或aox1::AGR4位點：GS115的AOX1或KM71的aox1::AGR4位點與載體上三個AOX1區：AOX1啟動子，AOX1轉錄終止子（TT）或AOX1下游遠側序列（3‘AOX1）中的任一個之間發生單十字交換事件都會形成基因插入。結果在AOX1或aox1::AGR4基因的上游或下游插入一個或多個載體。轉化子在GS115中為HIS+ Mut+表型，在KM71中為HIS+ Muts表型。在重組質粒5’或3‘AOX1區用限制酶進行線性化，依轉化宿主菌的不同，可方便地產生Mut+或Muts重組子。

下圖顯示質粒3‘端插入完整的AOX1位點（Muts），增加pAOX1、目的基因、HIS4（表達盒）。這也可發生在載體及基因組的5 AOX1區，在5‘AOX1位點產生5‘方向插入。盡管發生頻率很低，該事件也可發生在未線性化載體或自連的載體上。

基因插入His4位點:GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，染色體上his4位點與載體上HIS4基因之間發生單十字交換事件后會在his4位點形成插入。結果在his4位點插入一個或多個載體。由于基因組上AOX1或aox1::AGR4位點未發生重組，這些His＋轉化子的表型均與親本菌株相同。通過HIS4基因處限制性內切酶線性化，依轉化宿主菌不同，可方便地產生Mut+或Muts重組子。

下圖顯示質粒插入雙拷貝HIS4/his4基因。一個為突變子，另一個為野生型。

制作者：陳苗 商漢橋

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基因多拷貝插入事件：細胞中單位點多基因插入確實可自發形成，雖然比例低，占所有HIS＋轉化子的1-10%，但卻是可測的。多拷貝插入事件的發生是因為基因可在AOX1、

aox1::AGR4位點或his4位點進行插入。結果在GS115中產生Mut+ 表型，在KM71中產生Muts表型。定量dot blot及southern blot分析，差顯雜交均可檢測到多基因插入事件。（P74篩選多拷貝插入）

GS115中基因在AOX1處發生替代：在his4菌株如GS115中，載體及基因組中AOX1啟動子及3‘ AOX1區的雙十字交換事件，可產生基因替代（omega插入）。結果AOX1編碼區全部被取代，產生HIS＋Muts表型。以AOX1位點由于基因替代而產生的Muts表型作為指示，可很容易地篩選HIS＋轉化子的Mut表型。基因取代的結果是缺失了AOX1位點（Muts），增加了含pAOX1、目的基因、HIS4的表達盒。下圖顯示AOX1位點的基因取代。

制作者：陳苗 商漢橋

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基因取代（雙交換事件）不如插入（單交換事件）發生得多，一般我們建議線性化質粒通過單交換事件產生畢赤酵母重組子。用GS115或KM71菌株時，Mut表型與親本菌相同。

畢赤酵母電轉化：

介紹：該方法無需產生去壁細胞，是產生畢赤酵母重組子的簡便方法。與去壁細胞效率相似。

細胞準備：

1在含5mlYPD的50ml離心管中，培養畢赤酵母，30度過夜

2取0.1-0.5ml過夜培養物，接種含500ml新鮮培養基的2L搖瓶，過夜生長至OD600＝1.3-1.5

3在4度，1500g離心5min收集細胞,用500ml預冷的滅菌水懸浮細胞

4如上離心，用250 ml預冷的滅菌水懸浮細胞

5如上離心，用20ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞

6如上離心，用1 ml預冷的1M山梨醇懸浮細胞，至終體積約1.5ml

注意：可凍存80ul等量的電感受態細胞，但轉化效率會下降很多

轉化：

1取80ul上述細胞與5-20ug線性化DNA（溶于5-10ulTE）混合，轉入預冷的0.2cm電轉杯中。

2在冰上放置5min

3根據所使用裝置推薦的釀酒酵母參數進行電擊

4立即加入1ml預冷的1M山梨醇至杯中，將內容物轉移至滅菌離心管中

5分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上

6在30度孵育平板至克隆產生，按P41篩選Mut+/Muts表型

PEG1000轉化方法：

介紹：據稱PEG比LiCl方法好，但不如去壁細胞及電轉化法，但對沒有電轉裝置的人來說，更方便，效率為102-103/ugDNA。

溶液準備：

Buffer A: 1M山梨醇， 10mM bicine（N－二（羥乙基）甘氨酸）pH8.35，3%（v/v）乙二醇

Buffer B: 40%(w/v)聚乙二醇1000， 0.2M N－二（羥乙基）甘氨酸 pH8.35

Buffer C: 0.15M NaCl, 10mM N－二（羥乙基）甘氨酸 pH8.35

過濾除菌，存于-20度

新鮮的試劑級DMSO，未打開或剛配制，存于-70度直至使用。

注意，當細胞溶解后，即使放在冰上，其感受性下降都極快，加入DNA于冰凍的管中制作者：陳苗 商漢橋

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很關鍵。可進行多個轉化，建議每次轉化6個。

感受態細胞制備：

1在YPD平板上劃線培養畢赤酵母菌，30度孵育2天

2從平板上挑取單克隆于10mlYPD中，30度振蕩過夜

3早上，在100mlYPD培養基中接種等量的過夜培養物，至OD600達0.1，在30度生長至OD600為0.5-0.8

4室溫3000g離心收集細胞，用50ml Buffer A洗滌細胞1次

5用4ml Buffer A重懸細胞，分成0.2ml等份分裝至1.5ml離心管中，加入11ulDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷凍細胞

6存于-70度

轉化：在<20ul水中加入50ug DNA,將DNA直接加入仍處于冰凍狀態的感受態細胞管中。載體DNA（40ug變性及超聲處理的鮭魚精DNA）中加入＜1ug DNA樣品，檢測最大轉化效率。

2在37度水浴中孵育各管5min，其間混勻1-2次

3取出各管，加入1.5ml Buffer B，完全混勻

4在30度水浴中孵育1小時

5室溫，2000g 離心樣品10min，去除上清，用1.5ml Buffer C重懸細胞

6再次離心，用0.2ml Buffer C重懸細胞

7將管中內容物全部涂在選擇生長平板上，30度孵育3-4天，篩選Mut表型（P41），或篩選遺傳霉素高抗性克隆（P37）

LiCl轉化方法：

介紹：該程序是依釀酒酵母修改的版本，是電轉化的替代方法。轉化效率為102-103cfu/ug線性化DNA。

溶液準備：不能用醋酸鋰，一定要用氯化鋰

*用無菌去離子蒸餾水配制1M LiCl，過濾除菌，用無菌水稀釋

*用無菌去離子蒸餾水配制50%PEG（3350），過濾除菌，存于蓋緊的瓶中

*用TE（10mM Tris-HCl pH8.0 , 1.0mM EDTA）溶解2mg/ml變性斷裂鮭魚精DNA，存于-20度

細胞準備：

1在50mlYPD中培養畢赤酵母至OD600＝0.8-1.0（約108個/ml）

2收集細胞，用25ml滅菌水洗滌，室溫1500g離心10min

3去除水，用1ml 100mM LiCl 重懸細胞

4將細胞懸液轉至1.5ml離心管中

5最大轉速沉淀細胞15s,用吸頭吸去LiCl

6在400ul 100mM LiCl中懸浮細胞

7將50ul細胞懸浮液移到1.5ml離心管中，每次用一管，現做現用，不要置于冰上或-20度保存

轉化：

1煮沸單鏈DNA 5min，快速放于冰水中使變冷，后置于冰上。注意：載體DNA不需要在每次用之前都煮，在-20度保存等份少量樣品，每次解凍一管，用3-4次后再煮。

2取上面第7步中細胞，離心去除LiCl

3每個轉化樣品，按順序加入下列試劑，PEG可保護細胞免受高濃度LiCl的有害作用

240ul 50%PEG， 36ul 1M LiCl， 25ul 2mg/ml 單鏈DNA， 溶解于50ul滅菌水中的制作者：陳苗 商漢橋

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質粒DNA（5-10ug）

4劇烈渦旋細胞沉淀至完全混勻（1min）

5在30度孵育30min（不要搖動）

6在42度水浴熱擊20-25min

7 6000-8000rpm離心，將轉化溶液轉移走

8用1ml滅菌水重懸細胞沉淀

9在RDB或MD平板上涂25-100ul,在30度孵育2-4天，篩選轉化子Mut表型及遺傳霉素高抗性克隆

PCR分析畢赤酵母整合：

介紹：下列程序可分析目的基因是否整合到基因組中，從6-10個Muts或Mut+畢赤酵母克隆中分離基因組DNA（P73），從轉化親本質粒的菌株中提取DNA，進行整合分析。用α-factor引物（僅用于pPIC9K）或5‘AOX1引物與3‘AOX1引物配對擴增目的基因。該程序可證實基因插入，但不能證實插入位點。

更直接的PCR篩選方法見P72

PCR分析：設置PCR反應如下：

10×PCR buffer 5ul

基因組DNA（1ug） 5ul

100mM dNTPs(25mM/個) 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

加入滅菌水至 50ul

Taq多聚酶（5U/ul） 0.25ul

用20ul滅菌水重懸引物，制成0.1ug/ul溶液，如需要可減少引物量。如20pmol引物，加2ul引物進行擴增。

對照： 100ng重組質粒（陽性對照），100ng不含插入基因的相同質粒（陰性對照）

2加入50ul礦物油，如果PCR儀有防蒸發系統，不需要加礦物油。

3上樣，按下列程序：

步驟

熱啟動

變性

退火

延伸

最終延伸

溫度

94度

94度

55度

72度

72度

時間 min

2

1

1

1

7 1

循環

1

25-35

4用0.8%瓊脂凝膠分析10ul樣品，緩沖液為1×TAE

5如果篩選Mut+整合，可見兩條帶，一條與目的基因相關，另一條為AOX1基因（大約2.2kb），如果篩選GS115中Muts整合，可見與目的基因相關的一條帶。在KM71中，由于ARG4插入AOX1，PCR產物為3.6kb。親代質粒產生下列大小PCR產物。在分析PCR結果時，需將這些片段的長度加到最終片段中。

載體

pPIC3.5k

pAO815

pPIC9k(用5‘AOX1引物)

pPIC9k(用α-factor引物)

PCR產物

220bp

189bp

492bp

195bp

制作者：陳苗 商漢橋

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重要：如使用α-factor引物，在GS115及KM71中都可見一條帶。因為染色體AOX1基因上沒有α-factor信號序列。

注意：有時PCR會產生假帶，這不重要因為它們并不產生什么問題。

PCR分析示例：下面是PCR分析的典型例子，從畢赤酵母重組菌、合適的對照中分離基因組DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠上，每個PCR樣品點10ul。

泳道1含有1kb及100bp條帶。

泳道2顯示野生型AOX1基因2.2kb及含目的基因的2.4kb產物

（GOI, 1.9kb）及GS115/ pPIC9k/ GOI中492bp的AOX1基因側

翼序列 。

泳道3顯示GS115中野生型AOX1基因。

注意：Invitrogen“Easy-DNA”試劑盒可快速簡便地分離

畢赤酵母基因組DNA。

畢赤酵母克隆直接進行PCR篩選：

介紹：有報道稱可用PCR直接檢測畢赤酵母克隆中的插入基因，簡單講，通過酶、冷凍及熱處理相結合的方法裂解細胞，基因組DNA可直接用作PCR模板。

開始前：準備下列試劑及儀器

＊畢赤酵母轉化子培養基或單克隆 ＊1.5ml離心管 ＊5U/ul溶細胞酶溶液（Lytica）＊30度水浴，或熱擊 ＊液氮 ＊PCR試劑

程序：

1在1.5ml離心管中加入10ul畢赤酵母培養物，若培養物很濃，可將1ul培養物稀釋至9ul水中，或直接挑取單克隆，重懸于10ul水中。

2加入5ul 5U/ul的溶細胞酶lityca, 30度孵育10min

3將樣品凍存于-80度10min，或浸入液氮中1min

4設立50ul PCR反應體系

10×反應buffer 5ul

25mM MgCl2 5ul

25mM dNTPs 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

滅菌水 27 ul

細胞裂解液 5 ul

總體積 45ul

5混合溶液，覆蓋20ul礦物油

6將溶液置于熱循環器中，95度孵育5min

7加入5ul 0.16U/ul Taq聚合酶（0.8U）

8按下列參數循環30次

步驟

變性

退火

延伸

最后延伸

溫度

95度

54度

72度

72度

時間min

1

1

1

7

9在瓊脂糖凝膠中分析10ul等量樣品

制作者：陳苗 商漢橋

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畢赤酵母總DNA提取

介紹：下列操作可從所需的HIS＋重組子及未轉化的GS115、KM71中提取DNA，適用于southern 分析，dot /slot blot分析 或基因組PCR

溶液：需要配制下列溶液，有些試劑在試劑盒中沒有

最小培養基 (MD，MGY) 滅菌水

SCED(1M 山梨醇，10mM檸檬酸鈉 pH7.5, 10mM EDTA, 10mM DTT)

藤黃節桿菌酶 3mg/ml 貯存液 1%SDS 5M醋酸鉀 pH8.9

TE buffer pH7.4 (10mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8.0)

7.5M醋酸銨 pH7.5 酚：氯仿(1：1，V/V)

準備：

1在30度，在10mlMD或MGY中培養重組子，在10mlMDH，MGYH中培養GS115或KM71至OD600=5-10

2室溫，1500g離心5-10min

3用10ml滅菌水洗滌細胞，如2中離心

細胞去壁及裂解：

1在2mlSCED緩沖液(pH7.5)中重懸細胞，溶液現配現用

2加入0.1-0.3ng藤黃節桿菌酶(加前混合均勻)，37度孵育50min，獲得去壁率<80%去壁細胞(監測去壁細胞比例，P33-34)

3加入2ml 1%SDS，輕輕混勻，冰上放置5min(0-4度)

4加入1.5ml 5M醋酸鉀 pH8.9， 輕輕混勻

5在4度 1000g離心4min，保留上清

DNA沉淀：

1從上述5中轉移上清，加入2倍體積乙醇，室溫放置15min

2在4度 1000g離心20min

3用0.7mlTE pH7.4輕輕重懸沉淀，轉入離心管中

4以下操作需輕柔，用等量的酚：氯仿(1:1 v/v)抽提取,再用等量的氯仿：異戊醇(24:1)抽提。將上層水相轉入兩個離心管中。

5每管中加入1/2體積的7.5M醋酸銨，2倍體積的乙醇，干冰上放置10min，或-20度放置60min

6在4度 10000g離心20min,用1ml70%乙醇洗滌沉淀，空氣干燥沉淀。用50ulTE pH7.5重懸沉淀。測定DNA樣品濃度。兩管可分別存放或合在一起存放于-20度。

多拷貝重組子拷貝數：

介紹：你若想知道畢赤酵母重組子準確插入數，可用定量blot或southern 雜交來分析拷貝數。需要分離轉化有親代載體、含單拷貝的pAO815或pPIC3.5k及含多拷貝外源基因的畢赤酵母重組子的基因組DNA。

定量dot blot溶液：需要下列溶液，每個反應10-15ml，3MM紙, 50mM EDTA, 2.5% β-

巰基乙醇 pH 9.0, 1mg/ml藤黃節桿菌酶100T, 0.1N NaOH, 1.5M NaCl, 2×SSC

定量dot blot 程序：下列為DNA快速dot blot技術檢測多拷貝插入。在濾紙上點等量的細胞對定量拷貝數很重要。另外可提取基因組DNA，直接點在醋酸纖維膜或尼龍膜上，固定并分析。

1在30度，在96孔板上用200ul YPD分別培養Mut+及Muts轉化子直至到相同濃度，制作者：陳苗 商漢橋

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可能要傳幾代(p39)。另外可在培養管中培養單個轉化子，加入培養基至OD600吸收值一致。

2用多孔道移液器吸取50ul樣品至安裝于dot blot裝置上的醋酸纖維膜或尼龍膜上，自然干燥膜。

3裂解膜上細胞，用下列4種溶液進行處理：在托盤中放置兩塊3MM紙，用10-15ml

50mM EDTA，2.5% β- 巰基乙醇 pH 9.0進行浸泡。確保紙浸泡一致，不要有氣泡。將醋酸膜正面對著3MM紙，室溫孵育15min

4將醋酸膜從3MM紙上取走，更換另兩張3MM紙，用10-15ml 1mg/ml藤黃節桿菌酶100T 浸泡，將醋酸膜正面對著3MM紙，37度孵育4小時

5將膜移走，再換兩張3MM紙，用10-15ml 0.1N NaOH, 1.5M NaCl浸泡，將醋酸膜正面對著3MM紙，室溫孵育5min

6將膜移走，再換兩張3MM紙，用10-15ml 2×SSC浸泡，將醋酸膜正面對著3MM紙，室溫孵育5min,重復一次

7在80度烘干醋酸纖維膜，或用UV-crosslink烘干尼龍膜。膜可用與目的基因互補的非放射性標記或32P標記的隨機引物探針進行反應。多拷貝整合可通過與單拷貝對照相關的強烈雜交信號來進行確定。Dot blot 可通過膜或blot 的密度計量，如用放射性標記的用β-scanner來確定拷貝數。

Southern blot:用正確的內切酶消化DNA非常重要，消化后凝膠分離基因組DNA可用于點膜。如果用pPIC3.5K或pAO815產生的多拷貝，那樣方法可能不一樣。消化含多拷貝目的基因的重組子DNA，會產生一條因插入數目不同而密度不同的帶。用單拷貝作對照看密度也非常重要，用密度計量計定量條帶的密度可預測基因的數量。

對照：用宿主菌(GS115，KM71)DNA，轉化親本載體菌DNA(pPIC3.5K或pAO815)，轉化含單拷貝基因載體的DNA作對照很重要。用HIS4基因探針作為單拷貝及基因的內在對照。注意，如果基因插入his4位點，可產生兩拷貝HIS4基因，一個突變型，一個野生型。(見畢赤酵母重組及整合部分)

基本指導：

1用分子克隆中southern 標準溶液

2分離基因組DNA，用熒光計定量。確保去除RNA。確定拷貝數時，點相同量DNA很重要。

3要有southern 探針，HIS4基因探針及目的基因探針。注意：如果你的探針完全與野生型基因互補的話，宿主菌中his4基因的點突變并不影響雜交。

4如用pPIC3.5K產生多拷貝，用BglII消化DNA。注意：如用pPIC3.5K，并不是所有多插入子都是以頭-尾形式存在。有些可能是頭-頭、尾-尾形式。建議你們自己思考可能產生的產品。相反方向的表達盒會產生不同的帶，Southern blot時，當拷貝數>2時，會產生1條或2條帶(根據方向)，這都會增加密度。

5如用pAO815產生多插入子，用BglII及BamHI消化基因組DNA，釋放多插入子，條帶的分子量可幫助確定插入數。如果多插入子很大，可用SacI進行消化。這樣可產生包含單個目的基因的片段。這樣將會產生一條非常亮的帶。根據它與單拷貝基因所產生的帶的相對亮度，可判斷插入數。

6用BalII消化GS115基因組。轉化pPIC3.5K或pAO815的GS115基因組，用HIS4互補探針進行反應時，可產生一條2.8kb的帶(基因組中HIS4基因)及一條約6.7kb(載體來源的HIS4基因)的帶。

制作者：陳苗 商漢橋

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